TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN BAN ĐẦU ĐỂ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN THỦY TIÊN TÍM (DENDROBIUM AMABILE) SẠCH VIRUS SVTH: TRẦN THỊ LỆ THỦY MSSV: 60604409 CBHD: ThS.NGUYỄN XUÂN DŨNG KS.NGUYỄN PHÚC TRƯỜNG TT CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP.HCM TP HỒ CHÍ MINH 1/2011 iii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ, động viên của gia đình, thầy cô, các anh hướng dẫn. Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến: Thạc sĩ Nguyễn Xuân Dũng – Phó trưởng phòng Công nghệ Sinh học Thực vật, Trung tâm công nghệ sinh học Tp.HCM – đã đồng ý cho tôi thực hiện đề tài này tại phòng thực vật trung tâm công nghệ sinh học Tp.HCM, anh đã rất tận tình giúp đỡ, góp ý và động viên tôi trong quá trình làm việc. Kỹ sư Nguyễn Phúc Trường – nhân viên phòng CNSH Thực vật, Trung tâm công nghệ sinh học Tp.HCM – đã hướng dẫn tận tình giúp tôi quen dần với môi trường làm việc ở đây và luôn theo sát chỉ bảo tôi. Các anh chị kỹ thuật viên của trung tâm đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm. Các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại học Bách Khoa TP.HCM cùng các thầy cô của trường đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập. Bố mẹ và em tôi luôn sát cánh, động viên tinh thần, giúp đỡ về mặt tái chính để tôi có thể an tâm thực hiện tốt luận văn. Các bạn lớp HC06BSH trường Đại học Bách Khoa đã cùng học tập, trao đổi, góp ý giúp đỡ tôi trong quá trình học tập. iv TÓM TẮT Sử dụng phương pháp RT – PCR thanh lọc được nguồn mẫu sạch, làm nguyên liệu ban đầu cho kỹ thuật nhân giống in vitro cây lan Thủy tiên tím. Đoạn thân mang chồi bên được khử trùng bằng dung dịch Canxi Hypochloride ở các nồng độ khác nhau và sử dụng các biện pháp bổ sung kháng sinh trong quá trình khử trùng và cô lập mẫu có kích thước nhỏ để hạn chế sự nhiễm do vi khuẩn nội sinh trong mẫu cấy. Sau đó, khảo sát sự ảnh hưởng của các loại chất điều hòa sinh trưởng BA (0, 2, 2.5 và 3 mg/l) riêng lẻ và BA (2.5, 3, 4 mg/l) kết hợp với NAA 0.5 mg/l lên khả năng tăng trưởng của chồi bên. Cuối cùng, sử dụng kỹ thuật RT – PCR để kiểm tra tình trạng sạch virus đối với những chồi lan in vitro vừa tái sinh sau 8 tuần nuôi cấy. Kết quả đã chọn lọc được mẫu cây lan Thủy tiên tím sạch virus từ bộ sưu tập để sử dụng làm nguyên liệu ban đầu cho quy trình nhân giống in vitro. Xác đinh được nồng độ Ca(OCl) 2 17%, thời gian khử trùng 30 phút kết hợp ngâm kháng sinh Streptomycin trong 20 phút có khả năng khử trùng tốt nhất và tỷ lệ mẫu chết ít nhất. Tiếp theo, thành công trong việc tăng trưởng chồi bên trên môi trường MS bổ sung BA 3 hay 4 mg/l kết hợp NAA 0.5 mg/l. Sau 8 tuần các chồi tái sinh được kiểm tra lại bằng phương pháp RT – PCR khẳng định hoàn toàn sạch virus. v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv MỤC LỤC v CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix Chương 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Yêu cầu đề tài 2 1.3. Nội dung thực hiện 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Sơ lược về giống lan Dendrobium 3 2.1.1 Phân loại 3 2.1.2 Phân bố 3 2.1.3 Đặc điểm hình thái 3 2.1.4 Đặc điểm sinh thái 4 2.2. Sơ lược về lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) 5 2.2.1 Đặc điểm hình thái 5 2.2.2 Đặc điểm sinh thái 6 2.2.3 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng sự phát triển của thủy tiên tím 6 2.3. Giới thiệu tổng quan về virus 7 2.3.1 Cách gọi tên virus 7 2.3.2 Thành phần cấu tạo 8 2.3.3 Phương thức sinh sản và lan truyền 9 2.4. Sơ lược về virus thực vật 9 2.5. Sơ lược về virus gây bệnh trên lan 10 2.5.1 Cymbidium mosaic virus (CyMV) 10 2.5.2 Odontoglossum ringspot virus (ORSV) 12 2.6. Sơ lược về phương pháp RT-PCR 15 2.7. Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô 16 vi 2.7.1 Vài nét về kỹ thuật nuôi cấy mô 16 2.7.2 Các giai đoạn của nhân giống in vitro 17 2.7.3 Những thuận lợi và khó khăn của kỹ thuật nhân giống in vitro 17 2.7.4 Một số phương pháp nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh 18 2.7.5 Sơ lược về những kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro trên giống Dendrobium 20 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1. Vật liệu 23 3.1. 1. Mẫu thí nghiệm 23 3.1. 2. Địa điểm và thời gian thực hiện 23 3.1. 3. Thiết bị dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm 23 3.1. 4. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 23 3.2. Phương pháp 24 3.2. 1 Thanh lọc nguồn mẫu sạch virus bằng phương pháp RT – PCR 24 3.2. 2 Khử trùng mẫu tạo nguồn mẫu ban đầu cho nhân giống in vitro 26 3.2. 3 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA lên sự tăng trưởng chồi bên lấy từ đoạn thân Thủy tiên tím 27 3.2. 4 Kiểm tra sự nhiễm virus của mẫu sau khi nuôi cấy 27 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1. Thanh lọc nguồn mẫu sạch virus bằng phương pháp RT – PCR 28 4.2. Khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu ban đầu 29 4.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA lên sự tăng trưởng chồi bên cô lập từ thân lan Thủy tiên tím. 32 4.4. Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự tăng trưởng chồi bên cô lập từ thân lan Thủy tiên tím. 34 4.5. Kiểm tra sự nhiễm virus của mẫu sau khi nuôi cấy 36 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1. Kết luận 37 5.2. Đề nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 2 vii CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4 – D 2,4 – Dichlorophenoxyaxetic acid BA Benzyladenine BAP Benzylaminopurine cDNA Complementary Deoxynucleotide Acid CĐHST Chất điều hòa sinh trưởng cs cộng sự Strep Kháng sinh Streptomycin CyMV Cymbidium Mosaic Virus DAI Days After Inoculation NAA Naphthalene acetic acid ORSV Odotoglossum Ringspot Virus PCR Polymerase Chain Reaction PLB Protocorm-like body RNA Ribose Nucleotide Acid RT Reverse Transcription TAE Tris-acetate-EDTA TPHCM Thành phố Hồ Chí Minh viii DANH MỤC BẢNG Bảng 3. 1: Các thành phần phản ứng multiplex RT – PCR 25 Bảng 3. 2: Chu kỳ nhiệt của phản ứng multiplex RT - PCR 25 Bảng 3. 3: Các nồng độ Ca(OCl) 2 không kết hợp kháng sinh 26 Bảng 3. 4: Các nồng độ Ca(OCl) 2 kết hợp kháng sinh 27 Bảng 4. 1: Tỉ lệ sống vô trùng sau 7 ngày nuôi cấy chồi bên từ cây lan Thủy tiên tím. 29 Bảng 4. 2: Tỉ lệ sống vô trùng sau 7 ngày nuôi cấy chồi bên cô lập từ cây lan Thủy tiên tím. 30 Bảng 4. 3: Tỉ lệ sống vô trùng của chồi bên cô lập từ thân Thủy tiên tím với các nồng độ Ca(OCl) 2 có kháng sinh sau 7 ngày nuôi cấy 31 Bảng 4. 4: Sự tăng trưởng của chồi bên cô lập từ thân lan Thủy tiên tím trên môi trường MS bổ sung BA 33 Bảng 4. 5: Sự tăng trưởng của chồi bên cô lập từ thân lan Thủy tiên tím trên môi trường MS bổ sung BA và NAA sau 2 tuần nuôi cấy 34 ix DANH MỤC HÌNH Hình 2. 1: Cây lan Thủy tiên tím nở hoa. 6 Hình 2. 2: Hình dạng của virus CyMV (Navalinskiene và cs, 2005) 10 Hình 2. 3: Sơ đồ miêu tả bộ gen của CyMV (Ajjikuttira và cs, 2003) 11 Hình 2. 4: Triệu chứng của CmMV trên lá và hoa 12 Hình 2. 5: Hình dạng của ORSV (Navalinskiene và cs, 2005) 13 Hình 2. 6: Cấu trúc bộ gen của ORSV (Ajjikuttira và cs, 2003) 13 Hình 2. 7: Triệu chứng của ORSV gây ra 14 Hình 4. 1: Kết quả phát hiện virus trên các mẫu lan Thủy tiên tím bằng phương pháp RT – PCR. 28 Hình 4. 2: Quá trình cô lập chồi có kích thước nhỏ lấy từ đoạn thân Thủy tiên tím 30 Hình 4. 3: Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng chồi bên cây lan Thủy tiên tím bằng Ca(OCl) 2 kết hợp kháng sinh . 32 Hình 4. 4: Sự tăng trưởng của chồi bên cô lập từ thân lan Thủy tiên tím trên môi trường MS bổ sung BA 33 Hình 4. 5: Sự tăng trưởng của chồi bên cô lập từ thân lan Thủy tiên tím trên môi trường MS bổ sung BA và NAA sau 2 tuần nuôi cấy 35 Hình 4. 6: Kết quả phát hiện virus trên các mẫu chồi tăng trưởng của cây lan Thủy tiên tím sau 8 tuần nuôi cấy. 36 Chương 1: Mở đầu 1 Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) là một trong những giống lan rừng đặc hữu của Việt Nam (Trần Hợp,1998). Đây là giống lan rừng có dáng hoa rất đặc biệt, hoa to, đẹp, màu sắc nhã nhặn, có mùi thơm dễ chịu lại rất lâu tàn. Tuy nhiên, hiện nay đang được liệt vào danh sách những giống lan quý hiếm, mức độ đe dọa bậc R. Vì vậy vấn đề bảo tồn nguồn gen giống lan này là vấn đề đang được quan tâm. Thông thường có 2 cách để bảo tồn nguồn gen lan là lưu trữ thông qua nhân giống In vivo và In vitro. Phương pháp nhân giống In vivo thường không đạt hiệu quả cao trên lan do đặc điểm sinh thái đặc biệt, chịu sự chi phối của các yếu tố tự nhiên, gây khó khăn cho vấn đề quản lý và chăm sóc bộ sưu tập. Trái lại, việc nhân giống In vitro phát huy được nhiều ưu điểm như không phụ thuộc vào các yếu tố tự nhiên, dễ dàng kiểm soát, chăm sóc và sử dụng được cho nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau. Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm trên thì phương pháp In vitro vẫn có nhược điểm là không loại trừ được bệnh virus, một trong những loại bệnh gây hại nghiêm trọng trên hoa lan nói chung. Để giải quyết những vấn đề trên, đề tài: “ Khảo sát các điều kiện ban đầu để xây dựng quy trình nhân giống In vitro cây lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) sạch bệnh virus được thực hiện nhằm mục đích phục vụ cho việc bảo tồn nguồn gen và cung cấp cây giống chất lượng cao của giống lan này cho sản xuất. Chương 1: Mở đầu 2 1.2. Yêu cầu đề tài Khảo sát và đưa ra được một số điều kiện cần thiết cho việc xây dựng quy trình nhân giống In vitro cây lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) sạch bệnh (Cymbidium mosaic virus, Odotoglossum ringspot virus). 1.3. Nội dung thực hiện Bao gồm 4 nội dung chính: Kiểm tra, thanh lọc để tạo nguồn mẫu lan sạch virus bằng kỹ thuật RT-PCR. Khảo sát loại chất khử trùng, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp cho việc khử trùng mẫu cấy. Khảo sát điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp cho việc tăng trưởng và phát triển chồi từ mẫu cấy vô trùng. Kiểm tra sự sạch bệnh (virus) của các chồi tạo thành từ kỹ thuật RT – PCR. [...]... những điều kiện nuôi cấy khác nhau Nhưng nhìn chung chia thành các giai đoạn như sau: Giai đoạn 1: Tạo thể nhân giống in vitroi Giai đoạn 2: Nhân giống in vitro Giai đoạn 3: Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Giai đoạn 4: Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm (Dương Công kiên, 2006) 2.7.3 Những thuận lợi và khó khăn của kỹ thuật nhân giống in vitro Những thuận lợi của kỹ thuật nhân giống in vitro so với các. .. phương pháp nhân giống vô tính khác: (1) Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo (2) In vitro có thể cảm ứng trẻ hóa của mô nên có thể tạo được một số loài thực vật mà nhân giống in vivo không thể thực hiện (3) Sự tăng trưởng của cây nhân giống in vitro thường mạnh hơn những cây được nhân giống in vivo vì những cây này đã được trẻ hóa và sạch bệnh (4) Nuôi cấy in vitro chỉ sử... Hình 4 1: Kết quả phát hiện virus trên các mẫu lan Thủy tiên tím bằng phương pháp RT – PCR (1 10) Mẫu; (11) Đối chứng âm (-); (12) Đối chứng dương (+); (13) thang DNA Những cây lan tương ứng với các mẫu sạch virus được sử dụng làm nguồn mẫu ban đầu cho quá trình nuôi cấy in vitro Một trong những điều kiện quan trọng để tạo được giống cây in vitro sạch virus là phải có nguồn mẫu sạch bệnh Vì vậy, kết quả... phút Cuối cùng quan sát sự xuất hiện của các băng DNA trên gel bằng máy Geldoc Từ kết quả PCR, chọn ra cây không bị nhiễm virus được chọn để làm nguồn mẫu cho giai đoạn nhân giống in vitro 3.2 2 Khử trùng mẫu tạo nguồn mẫu ban đầu cho nhân giống in vitro Đoạn thân mang chồi bên thu nhận từ những cây lan đã kiểm tra sạch virus trong bộ sưu tầm lan rừng Các bước thực hiện như sau: Bóc sạch vảy lá trên đoạn... hypochloride Các hóa chất dùng chop ha chế môi trường MS Phương pháp 3.2 1 Thanh lọc nguồn mẫu sạch virus bằng phương pháp RT – PCR Các cây lan Thủy tiên tím trong bộ sưu tập Lan rừng được sử dụng cho mục đích thanh lọc chọn nguồn mẫu sạch virus Quá trình kiểm tra virus được tiến hành theo quy trình phát hiện virus Cymbidium mosaic virus (CyMV) và Odontoglossum ringspot virus (ORSV) gây bệnh trên lan của... thân, phiến lá, hạt phấn, phát hoa…, mà nhân giống in vivo không thực hiện được - Tạo nguồn gen giống cây trồng sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng - Cải tiến giống, lai vô tính hay tạo giống mới bằng kỹ thuật chuyển gen 2.7.2 Các giai đoạn của nhân giống in vitro Thành công của việc vi nhân giống phụ thuộc vào việc phân định rõ các bước phát triển khác nhau của mẫu... và nhân giống số lượng ít Đối với phương pháp gieo hạt, vì hạt lan nhỏ, không có chất dinh dưỡng dự trữ nên hạt khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên nếu không cộng sinh với nấm 4 Chương 2: Tổng quan tài liệu tương thích Hạt chín sau 12 – 18 tháng và phát tán nhờ gió, nhờ nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện thích hợp hạt sẽ nảy mầm 2.2 Sơ lược về lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) Thủy tiên. .. Cây lan Thủy tiên tím nở hoa 2.2.2 Đặc điểm sinh thái Đây là loài thuộc giống Dendrobium ra hoa nhưng không rụng lá Hoa thường nở vào tháng 5 hoặc tháng 6 Phát hoa lên ở gần đỉnh của thân còn lá Tái sinh lan Thủy tiên tím bằng hạt và bằng chồi (Sách đỏ Việt Nam, 1996 - trang 325) Nếu tái sinh bằng hạt trong điều kiện tự nhiên phải công sinh với nấm tương thích, hoặc gieo hạt không có nấm cộng sinh... môi trường có thành phần dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng thích hợp Tế bào của mẫu cấy sẽ phản phân hóa dưới tác động của chất điều hòa sinh trưởng để phân chia hỗn loạn tạo thành mô sẹo Mỗi giai đoạn phát sinh hình thái khác nhau sẽ cần sự điều chỉnh chất điều hòa sinh trưởng khác nhau, điều kiện để phát sinh cơ quan này có thể cản trở sự cảm ứng phát sinh cơ quan khác Do đó, sau khi mô sẹo hình... sẽ được chuyển sang môi trường khác để cảm ứng phát sinh hình thai tạo chồi và rễ (Lê Thị Thủy Tiên, 2002) 2.7.5 Sơ lược về những kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro trên giống Dendrobium a) Môi trường nuôi cấy Năm 2004, D.Puchooa đã nghiên cứu của các loại môi trường (VW (Vacin & Went, 1949), KdC (Knudson, 1946), MS (Murashige & Skoog, 1962)) để tái sinh câ lan Dendobium Sonia từ mô lá Kết quả . những loại bệnh gây hại nghiêm trọng trên hoa lan nói chung. Để giải quyết những vấn đề trên, đề tài: “ Khảo sát các điều kiện ban đầu để xây dựng quy trình nhân giống In vitro cây lan Thủy tiên. KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN BAN ĐẦU ĐỂ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN THỦY TIÊN TÍM (DENDROBIUM AMABILE) SẠCH. việc ở đây và luôn theo sát chỉ bảo tôi. Các anh chị kỹ thuật viên của trung tâm đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm. Các thầy cô Bộ môn Công