Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây na (Annona squamosa L.) và cây dủ dẻ trâu (Melodoum fruticosum Lour.) thuộc họ Na (Annonaceae) ở Việt Nam Bùi Thị Minh Nguyệt.

26 811 1
Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây na (Annona squamosa L.) và cây dủ dẻ trâu (Melodoum fruticosum Lour.) thuộc họ Na (Annonaceae) ở Việt Nam  Bùi Thị Minh Nguyệt.

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH BÙI THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY NA (ANNONA SQUAMOSA L.) VÀ CÂY DỦ DẺ TRÂU (MELODORUM FRUTICOSUM LOUR ) THUỘC HỌ NA (ANNONACEAE) Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 62 44 01 14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN - 2014 Cơng trình hồn thành tại: Phịng thí nghiệm Chuyên đề Hữu cơ, khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Đình Thắng PGS TS Ping Chung Kuo Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: vào hồi phút, ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm Thông tin & Thư viện Nguyễn Thúc Hào – Trường Đại học Vinh MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Thực vật nước ta đa dạng phong phú, số liệu thống kê gần thực vật bậc cao nước ta cho biết có 13.000 lồi, đến năm 2002 biết có 2.270 chi 305 họ có khoảng 4.000 loài sử dụng làm thuốc [9], 600 loài cho tinh dầu [6] Đây nguồn tài nguyên thiên nhiên quý báu đất nước Hiện nay, có nhiều nghiên cứu thực vật mà chủ yếu nghiên cứu hóa thực vật Theo thống kê cho thấy, có khoảng 80% dân số giới tin vào y học cổ truyền để chăm sóc sức khoẻ Trong thập kỉ qua, có gần 121 sản phẩm thuốc tạo nên dựa kiến thức y học truyền thống từ nguồn khác [106] Có nhiều sản phẩm thuốc tạo trực tiếp dẫn xuất tổng hợp bắt chước theo khung từ sản phẩm thiên nhiên [9] Nhiều bệnh nhân mắc bệnh nan y đặc biệt ung thư chữa khỏi nhờ sử dụng sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên [41] Đặc biệt 20 năm trở lại đây, hợp chất thiên nhiên sử dụng rộng rãi có hiệu sản xuất thực phẩm chức năng, bổ sung dinh dưỡng hay thực phẩm thuốc sản phẩm nâng cao sinh lực, phòng hỗ trợ điều trị bệnh tật, nâng cao tuổi thọ [8] Chính thế, việc nghiên cứu hợp chất thiên nhiên để làm thuốc chữa bệnh vơ quan trọng sử dụng loại thuốc có nguồn gốc từ hố tổng hợp gây tác dụng phụ làm cho môi trường ngày nhiễm hơn, loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên hạn chế nhược điểm Trong việc xác định cấu trúc chúng khâu then chốt việc giải mã chế tương tác thuốc với tác nhân gây bệnh Ở Việt Nam, thuốc sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm, có khoảng 20-30% số lồi xác minh khoa học giá trị, chế chữa bệnh dùng để chữa bệnh thông thường: cảm sốt, cảm lạnh, cầm máu, làm lành vết thương, ăn uống khó tiêu, bong gân…, số bệnh nan y như: tim mạch, gan, thận, thần kinh, dị ứng,…Trong số công bố gần 920 lồi thuốc có khả điều trị 64 loại bệnh chứng theo cách cổ truyền [4] Các họ Na nói chung thuộc chi Na chi Dủ dẻ nói riêng, có giá trị kinh tế cao, không dùng để làm cảnh, số lồi ăn ngon mà cịn sử dụng nhiều thuốc y học dân tộc hoạt tính sinh học đáng q chúng Ngồi ra, số có mùi thơm đặc biệt nên dùng ngành hương liệu Trên giới có nhiều cơng trình nghiên cứu na, Việt Nam chưa nghiên cứu nhiều Còn dủ dẻ trâu, báo cáo cịn khiêm tốn, Việt Nam chưa tìm thấy cơng trình nghiên cứu lồi Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học lồi giúp đánh giá giá trị nguồn tài nguyên thiên nhiên nước ta Kết nghiên cứu loài mang lại ý nghĩa to lớn ngành dược liệu Chính ưu điểm thế, nhận thấy cần thiết để nghiên cứu thành phần hóa học Với lí quan trọng nêu thực luận án với tên “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học na (Annona squamosa L.) dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) thuộc họ Na (Annonaceae) Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu Với lí nêu trên, xác định mục tiêu nghiên cứu luận án gồm nội dung sau: - Xác định thành phần hóa học cấu trúc hợp chất phân lập từ na dủ dẻ trâu - Thử hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án na (Annona squamosa L.) thuộc chi Na (Annona) dủ dẻ trâu (Melodrum fruticosum Lour.) thuộc chi Dủ dẻ (Melodorum), hai loài thuộc họ Na (Annonaceae) Nhiệm vụ nghiên cứu Với mục tiêu nghiên cứu đặt ra, xác định nhiệm vụ cần thực gồm: - Lựa chọn dung mơi thích hợp để chiết hỗn hợp hợp chất từ na dủ dẻ trâu - Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất từ cao thu từ na dủ dẻ trâu - Thử hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập Những đóng góp luận án Đây cơng trình khoa học báo cáo thành phần hóa học hoạt tính sinh học chất phân lập từ na (Annona squamosa L.) dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) lần Việt Nam - Đã phân lập xác định cấu trúc 05 hợp chất ent-kauran 02 hợp chất steroit Trong đó, có hợp chất ent-kauran ditecpenoit lần phân lập từ loài na - Từ dịch chiết dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) phân lập xác định 01 hợp chất amit thơm mới, 08 hợp chất flavonoit, 01 hợp chất ancaloit, 01 hợp chất tannin, 02 hợp chất steroit Ngoại trừ 02 hợp chất steroit, hợp chất lại hợp chất lần phân lập từ lồi dủ dẻ - Xác định thơng số cấu trúc tinh thể hợp chất amit thơm Các số liệu tinh thể học hợp chất (CCDC 872 187) lưu trữ Trung tâm liệu Cambridge - Trong số hợp chất ent-kauran ditecpenoit phân lập từ na có hợp chất lần báo cáo hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư vú (MCF-7) Có ba hợp chất phân lập từ dủ dẻ trâu lần nghiên cứu hoạt tính kháng viêm dựa khả ức chế tạo thành O2- cho bạch cầu trung tính phản ứng với formyl-Lmethionyl-L-leucyl-L-phenylalanin/cytochalasin B (FMLP/CB) Bố cục luận án Luận án gồm 124 trang với 24 bảng số liệu, 23 hình sơ đồ với 144 tài liệu tham khảo Kết cấu luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (27 trang), phương pháp thực nghiệm (14 trang), kết thảo luận (60 trang), kết luận (2 trang), danh mục cơng trình cơng bố (1 trang) tài liệu tham khảo (16 trang) Ngồi cịn có phần phụ lục gồm 114 phổ hợp chất (62 trrang) liệu tinh thể học melodamit A (6 trang) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan na (Annona squamosa L.) dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) trình bày với mục gồm: - Đặc điểm thực vật - Thành phần hố học - Sử dụng hoạt tính CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất, thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chiết tách Sử dụng dung mơi thích hợp để chiết hỗn hợp chất từ cao metanol trích từ na dủ dẻ trâu 2.2.2 Sắc kí lớp mỏng Thực mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254, độ dày 0,2 mm Phát chất đèn tử ngoại bước sóng 254 nm màu với iot 2.2.3 Sắc kí cột Sử dụng phương pháp sắc kí cột thơng thường với pha tĩnh silica gel 70-230/mesh sắc kí cột pha đảo RP-18 2.2.4 Kết tinh phân đoạn Phương pháp kết tinh phân đoạn dùng để làm hợp chất thu phân đoạn sắc kí 2.2.5 Phương pháp xác định cấu trúc Sử dụng phương pháp phổ chứng minh cấu trúc gồm phổ tử ngoại (UV), hồng ngoại (IR), phổ khối (ESI-MS, HR-ESIMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H-COSY), X-ray đo độ quay cực riêng 2.2.6 Phương pháp thử hoạt tính sinh học - Hoạt tính gây độc tế bào tiến hành phịng Cơng nghệ Sinh học, Viện hóa học Hợp chất Thiên nhiên, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam - Hoạt tính kháng viêm tiến hành trường Đại học Cheng Kung, Đài Loan 2.3 Thu hái mẫu thực vật Mẫu na (Annona squamosa L.) thu hái Đồng Tháp vào tháng 8/2010 dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) thu hái Huế vào tháng 5/2009, hai mẫu thực vật PGS TS Trần Huy Thái (Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học tiêu lưu giữ khoa Sinh-Trường Đại học Vinh 2.4 Kết nghiên cứu chiết tách xác định cấu trúc thành phần hóa học na 2.4.1 Chiết tách cao Lá na (10 kg) - Ngâm với metanol - Cất thu hồi metanol Cao metanol (786 g) - Phân bố nước - Chiết với hexan, etyl axetat, butanol Cao hexan (287 g) Cao etyl axetat (358 g) Dịch nước Cao butanol (145 g) Sơ đồ 1: Quy trình chiết tách cao từ na 2.4.2 Phân lập chất Cao etyl axetat (358g) CC, silica gel CHCl3:CH3OH (50:1; 30:1; 20:1; 10:1; 4:1) F-1 (44 g) (*) ASE3 (349 mg) ASE5 (294 mg) ASE6 (125 mg) F-2 (95 g) F-3, -4 (**) ASE1 (1027 mg) F-5 ASE2 (246 mg) F-6 F- ASE7 (342 mg) ASE4 (328 mg) (*): CC, silica gel; CHCl3: CH3OH (30:1, 20:1; 10:1; 4:1; 2:1) (**): CC, silica gel; CHCl3: CH3OH (25:1, 15:1; 10:1; 4:1; 2:1) Sơ đồ 2: Quy trình phân lập chất từ cao etyl axetat na 2.5 Kết nghiên cứu chiết tách xác định cấu trúc thành phần hóa học dủ dẻ trâu 2.5.1 Chiết tách cao Lá dủ dẻ (9,8 kg) - Ngâm với metanol - Cất thu hồi metanol Cao metanol (716 g) Cao hexan (38 g) Cao etyl axetat (267 g) Cao butanol (192 g) Sơ đồ 3: Quy trình chiết tách cao từ dủ dẻ trâu 2.5.2 Phân lập chất 2.5.2.1 Cao hexan Cao hexan (38 g) CC, silica gel hexan : axeton (9:1, 5:1, 3:1, 1:1) F-1 F-2 (3 g) F-3 F-4 F-5 F6 CC, silica gel hexan: axeton (9:1) MFH2 (321mg) Sơ đồ 4: Quy trình phân lập chất từ cao hexan dủ dẻ trâu 2.5.2.2 Cao etyl axetat Cao etyl axetat (267 g) CC, silica gel hexan:axeton (19:1, 12:1, 7:1, 3:1, 1:1) F-1 F-2 F-3 F-4 F-5 F-7, -8 F-6 (14,2 g) F-9 (35,7 g) CC, silica gel hexan:axeton (19:1) MFE3 (52 mg) F-10 (15,9 g) CC, silica gel hexan:axeton (15:1, 10:1, 7:1, 5:1) MFE1 (99 mg), MFE4 (70 mg), MFE5 (71 mg), MFE7 (35 mg) CC, silica gel hexan:axeton (7:1) MFE6 (58 mg) Sơ đồ 5: Quy trình phân lập chất từ cao etyl axetat dủ dẻ trâu 2.5.2.3 Cao butanol Cao butanol (192 g) CC, silica gel CHCl3:MeOH ( %, %, 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 %, 100 %) F-1 F-2 F-3 (5,0 g) F-4 (18,6 g) F -6 F-7 (30,6 F-5 (10,4 g) F-8, F-9, F -10 g) CC, silica gel CC, silica gel CHCl3:CH3OH CC, silica gel CHCl3:CH3OH CC, silica gel CHCl3:CH3OH:H2O CHCl3:CH3OH:H2O (9:1:0,05) (4:1:0,05) (19:1) (15:1) MFB8 (39 mg) MFB10 (87 mg) MFB11 (14 mg) MFB12 (45 mg) MFB13 (97 mg) MFB9 (12 mg) Sơ đồ 6: Quy trình phân lập chất từ cao butanol dủ dẻ trâu 10 12 12 13 11 10 14 15 COOH 19 18 13 10 18 14 COOH 16 12 (ASE3) axit 16hydro-ent-kauran17,19-dioic 19 OH 14 21 17 18 19 20 24 23 13 19 17 11 14 10 (ASE5) 16,17-Dihydroxyent-kauran-19-al 27 22 12 15 CHO 18 (ASE4) Axit 16hydro-19-al-entkauran-17-oic 10 CHO 16 29 28 20 15 OH 13 11 15 19 COOH H COOH 14 COOH 18 17 17 16 20 10 15 19 20 OCCH3 O 16 14 (ASE2) axit 16hydro-17-axetoxy-entkauran-19-oic 12 11 18 (ASE1) axit entkaur-16-en-19-oic 10 13 11 20 16 12 H 17 13 11 17 20 25 26 16 15 HO (ASE6) β-Sitosterol 29 28 21 12 19 HOH 2C HO HO 17 O 5' 3' 2' O 25 26 16 14 15 10 6' 4' 24 23 13 27 20 18 11 22 1' OH (ASE7) -Sitosterol-3-O--D-glucopyranozit 3.1.3.2 Những đóng góp từ kết thu Những hợp chất ent-kauran ditecpenoit phân lập tìm thấy nhiều lồi thuộc chi Na (Annona) với hai hợp chất steroit β-sitosterol (ASE6) -Sitosterol-3-O--D-glucopyranozit (ASE7) thường bắt gặp hầu hết loài thực vật Theo thống kê tư liệu tham khảo cho thấy hầu hết hợp chất phân lập luận án phân lập công bố đối tượng na ngoại trừ hợp chất axit 16-hydro-17-axetoxy-ent-kauran-19-oic (ASE2) tìm thấy loài khác thuộc chi Cấu trúc hợp chất xác định lần hợp chất phân lập xác định cấu trúc từ na phân bố Việt Nam lần kết nghiên cứu từ đối tượng na Việt Nam công bố 3.2 Lá dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) 11 3.2.1 Các hợp chất phân lập Các cao chiết ứng với dung môi khác gồm: hexan phân lập hợp chất, cao etyl axetat phân lập hợp chất cao butanol phân lập hợp chất, chất với tên cụ thể nêu bảng 3.9 Bảng 3.9: Danh mục chất phân lập từ dủ dẻ trâu ST T Kí hiệu hợp chất MFE1 MFH2 MFE3 MFE4 MFE5 MFE6 MFE7 MFB8 MFB9 10 11 MFB10 MFB11 12 MFB12 13 MFB13 Tên hợp chất Melodamit A β-Sitosterol Flavokawain A 2',6'-Dihydroxy-4'metoxychalcon 2',4'-Dihydroxy-4,6'dimetoxydihydrochalcon 4',5-Dimetoxy-7hydroxyflavanon (Tsugafolin) 5-O-Metylnaringenin (7,4′-dihydroxy-5metoxyflavanon) Naringenin - 4',7dimetylete Kaempferol 3-O{-D-apiofuranozyl(12)[-L-rhamnopyranozyl(16)]-D-glucopyranozit} Rutin Oxoanolobin Axit 3, 3', 4'-trimetoxy ellagic -sitosterol-3-O--Dglucopyranozit Công thức Khối lượng Phân tử hợp chất (mg) C17H17NO3 99 C29H50O 321 C18H18O5 52 C16H 14O4 70 C17H18O5 71 C17H16O5 58 C16H14O5 35 C17H16O5 39 C32H38O19 12 C27H30O16 C17H10NO4 87 14 C17H12O8 45 C35H60O6 97 12 3.2.2 Xác định cấu trúc hợp chất 3.2.2.1 Hợp chất MFE1 Hợp chất MFE1 phân lập có dạng chất bột khơng màu, 28 ,8 đ.n.c 183–185°C Độ quay cực  D = 0,001 (CH3OH, c 1,53) cho thấy hợp chất không quang hoạt Phổ ESI-MS (positive) cho pic ion giả phân tử [M+H]+ m/z 284, phổ ESI-MS (negative) cho pic ion giải phân tử [M-H]- m/z 282, từ xác định khối lượng phân tử MFE1 283, kết hợp với liệu phổ 1H-, 13-NMR, DEPT giúp dự đốn cơng thức phân tử MFE1 C17H17NO3 (xem hình 3.1 hình 3.2) Phổ HR-ESI-MS cho cho pic ion giả phân tử m/z 284,1289 + [M+H] giúp khẳng định công thức phân tử MFE1 C17H17NO3N (hình 3.3) Trên phổ IR cho thấy xuất pic hấp thụ mạnh đặc trưng cho dao động hố trị nhóm OH (3.441 cm-1), N–H (3.257 cm-1), nhóm cacbonyl liên hợp (1.662,3 cm-1), C=Colefin (1.609,6 cm-1) C=Cvịng thơm (1.573,2 cm-1) (hình 3.4) Trên phổ 1H-NMR, quan sát thấy có tín hiệu  8,09 (1H, t, J=5,5 Hz) nhận định tín hiệu đặc trưng proton nhóm amit tín hiệu  5,83 (1H, s) tín hiệu proton nhóm -OH Một gồm proton thơm cho tín hiệu doublet vùng  7,55 ppm với J=8,5 Hz (có tương tác octo) gán cho hai proton H-5, H-9 cụm tín hiệu proton lại  7,39 (3H, m) xác nhận H6, H-7, H-8, tín hiệu đặc trưng cho vịng benzen lần Tín hiệu hai proton thuộc trans-olefin quan sát, đó, tín hiệu proton bị chồng lấp với proton thơm  7,39 (1H, d, J=15,5 Hz) quy kết cho H-3 tín hiệu doublet H-2  6,56 với J=15,5 Hz (đặc trưng cho kiểu liên kết trans-olefin) Thêm vào đó, xuất tín hiệu doublet proton olefin  6,94 (2H, d, J=8,5 Hz);  6,09 (2H, d, J=8,5 Hz) quy kết 13 cho H-4' H-8'; H-5' H-7' Ngồi cịn nhận thấy xuất tín hiệu multilet vùng trường cao proton thuộc nhóm metylen cho thấy có tương tác bậc cao  3,18 (2H, m) 1,86 (2H, m) cho H-1' H-2' (xem hình 3.5 – hình 3.7 bảng 3.10) Phổ 13C-NMR, DEPT kết hợp với phổ HSQC cho thấy tín hiệu 17 cacbon gồm nhóm xeton liên hợp ( 185,2 ppm), amit liên hợp ( 164,8 ppm), hai tín hiệu cacbon olefin ( 138,6 122,1 ppm), hai cacbon olefin liên hợp đối xứng ( 152,8, 126,8 ppm), tín hiệu sáu cacbon thơm (δ 134,9, 129,4, 129,4, 128,9, 127,5, 127,5 ppm) cacbon bậc bốn có gắn oxi (δ 67,8 ppm), hai nhóm metylen (δ 39,0 34,2 ppm) Xác định vị trí nhóm dựa vào phổ HMBC, mối tương quan H-2 (δ 6,56 ppm) với C-1 (δ 164,8 ppm)/ C-3 (δ 138,6 ppm)/ C-4 (δ 134,9 ppm) từ xác định thứ tự amit cinnamic hợp chất MFE1 Tương quan proton nhóm amit ( 8,09 ppm) với C-1 ( 164,8 ppm)/C-1' (34,2 ppm), proton nhóm hydroxyl  5,83 ppm với C-2' ( 39,0 ppm)/C-3' ( 67,8 ppm)/C-4' ( 152,8 ppm)/C-8' (152,8 ppm) Ngồi ra, vịng B có cấu trúc cyclohexadienon xuất tín hiệu H-5'/H-7' (δ 6,09 ppm) H-4'/H-8' (δ 6,94 ppm) có tương quan với C-3' (δ 67,8 ppm) C-6' (δ 185,2 ppm) Thêm vào đó, pic giao H-1' (δ 3,18 ppm) tương quan với C-1 (δ 164,8 ppm)/C-2′ (δ 39,0 ppm)/C-3′ (δ 67,8 ppm) H-2′ (δ 1,83 ppm) với C-1′ (δ 34,2 ppm)/ C-3′ (δ 67,8 ppm)/C-4′ (δ 152,8 ppm)/C-8′ (δ 152,8 ppm), phổ HMBC cho thấy amit liên hợp vòng B liên kết với C-1' C-2' (hình 3.8 – hình 3.17 bảng 3.10) Bảng 3.10: Số liệu phổ DEPT HMBC hợp chất MFE1 C (ppm) Vị trí H (ppm) HMBC 164,8 6,56 (1H, d, J = 15,5 Hz) 122,1 C-1, C-3, C-4 14 7,39 (1H, d, J = 15,5 Hz) 138,6 C-1, C-2, C-4, C-5, C-9 134,9 7,55 (1H, d, J = 8,5 Hz) 127,5 C-3, C-7, C-9 7,39 (1H, m) 128,9 C-4, C-8 7,39 (1H, m) 129,4 C-5, C-6, C-8, C-9 7,39 (1H, m) 128,9 C-4, C-6 7,55 (1H, d, J = 8,5 Hz) 127,5 C-3, C-5, C-7 1' 3,18 (2H, dd, J = 14,0, 7,0 Hz) 34,2 C-1, C-2', C-3' 2' 1,86 (2H, t, J = 7,0Hz) 39,0 C-1', C-3', C-4', C-8' 3' 67,8 4' 6,94 (1H, d, J = 8,5 Hz) 152,8 C-3', C-6' 5' 6,09 (1H, d, J = 8,5 Hz) 126,8 C-3', C-6' 6' 185,2 7' 6,09 (1H, d, J = 8,5 Hz) 126,8 C-3', C-6' 8' 6,94 (1H, d, J = 8,5 Hz) 152,8 C-3', C-6' CONH 8,09 (1H, br s) C-1, C-1' 3'-OH 5,83 (1H, s) C-2', C-3', C-4', C-8' C (Đo 125 MHz DMSO-d6) Qua số liệu phân tích từ phổ đồ hợp chất MFE1 cho phép khẳng định hợp chất lần phân lập từ thiên nhiên đặt tên melodamit A O HO 8' 7' 4' 5' 1' 6' 3' N 2' O H HMBC Hình 3.18: Tương tác HMBC cấu trúc Melodamit A (MFE1) Bên cạnh đó, cấu trúc hợp chất melodamit A khẳng định qua kết tinh thể học xác định nhiễu xạ tia X Sau thông tin tinh thể MFE1 Bảng 3.11: Một số thông số hình học tinh thể MFE1 Dữ liệu tinh thể Hệ tinh thể: monoclinic Dc = 1,283 mg/m3 Nhóm điểm khơng gian: Z = P 21/n 15 a = 8,6116 Å T = 100 K b = 10,3693 Å F000 = 640 c = 17,8352 Å Dạng xạ CuK\a  = 90,0o λ = 1,54178 Å o β = 101,716 (100) θ = 4,96 – 66,38o o  = 90,0  = 0,751 mm-1 V = 1559,44 Å3 Kích thước tinh thể: 0,18 x 0,15 x 0,12 mm3 Ghi nhận liệu Máy nhiễu xạ Bruker Rint = 0,0199 APEX DUO Nguồn xạ: fine-focus R1 = 0,032 với I > 2 (I) sealed tube Phản xạ dùng 8662 θmax = 66,38o Phản xạ tự 2619 θmin = 4,96o Máy đơn sắc: graphite h = -9  10 Dạng hiệu chỉnh hấp thụ: k = -12  12 multi-scan T = 100 K l = -21  24 Cấu trúc tinh tế wR (F2) = 0,0857 w = 1/[2(Fo2) + (0,0495P)2 + 0,4542P] S = 1,036 đó: P = (Fo2 + Fo2)/3 Số thông số: 200 Các thông số độ dài liên kết góc liên kết (xem phụ lục trang PL-64-67) Hình 3.19: Cấu trúc đơn tinh thể nhiễu xạ tia X melodamit A 3.2.3 Điểm bật từ kết phân lập hợp chất dủ dẻ trâu 3.2.3.1 Cấu trúc hợp chất phân lập 16 O HO 2' 28 6' 3' 1' NH 29 7' 8' 21 O 5' 4' 8 14 10 (MFE1) Melodamit A (chất mới) 6' 4' OCH3 5' H3CO 1' 2' O 3' 3' OCH3 OH O OH HO O 3' OH 4' 1' O OCH3O 3' 2' 6' 3' 2' O 10 OH O 1''' OH O (MFB8) Naringenin – 4',7dimetylete OH 6' O 6'' 6' O 5'' 4'' HO HO O 3'''' 10 OH CH2OH 1'''' (MFB9) Kaempferol 3-O{-D-apiofuranozyl-1 [-L-rhamnopyranozyl (16)]- -D-glucopyranozit} 4' OH 3' OH O O 6'' 4'' 2'''' OH OH O 1' 2' 1'' O 5'''' HO 2'' 3'' 4'''' 5' 5' O OCH3 6' 5' 2''' HO 4' 5''' 10 1' O 4' 1' OCH3O 1 H3CO (MFE7) 5-O-Metylnaringenin (7,4′-dihydroxy-5-metoxyflavanon) (MFE6) Tsugafolin hay 4',5-dimetoxy-7-hydroxyflavanon) HO 5 3''' 5' 6' 5' O 4' 1' O 10 2' 6''' OCH3 2' (MFE5) 2',4'-Dihydroxy-4,6'dimetoxydihydrochalcon HO (MFE4) 2,6'-Dihydroxy-4'-metoxychalcon  1' 2' 4''' 3' 6'  CH3 HO 1' 2' OCH3 5' 4' 6' 4' (MFE3) Flavokawain A HO OH OH 3' HO 15 HO 5' H3CO 26 16 (MFH2) β-Sitosterol OCH3 25 17 13 24 23 11 19 20 18 12 27 22 5'' O 6''' 5''' H3C HO 4''' O HO 3''' HO 1''' HO 3'' 2'' O 1'' OH 2''' HO (MFB10) Rutin 17 O CH3 O 3' 4' 1' 5' O 3a N6 O 6' 7a 10 OH (MFB11) Oxoanolobin 29 28 21 12 19 O 4' 5' 3' 2' O 27 24 23 17 13 25 26 16 14 10 6' 22 20 18 11 HO HO O (MFB12) 3, 3', 4'trimethoxy ellagic acid HOH2C 11a 11 CH3 O CH3 6a 1a O 7' O O OH 1b 2' O 1' OH (MFB13) -Sitosterol-3-O--Dglucopyranozit 3.2.3.2 Những đóng góp từ kết thu Từ tư liệu thu thập hóa thực vật loài dủ dẻ trâu cho biết, kết phân lập xác định cấu trúc hạn chế, số tư liệu tìm thấy, tác giả chưa chưa tìm thấy cơng trình cơng bố loài dủ dẻ trâu phân bố Việt Nam Chính kết việc xác định cấu trúc hợp chất từ lồi điểm bật luận án Theo phần tổng quan tư liệu cho thấy hợp chất phân lập từ lồi thuộc chi Dủ dẻ nói riêng lồi dủ dẻ trâu nói chung phần nhiều hợp chất heptene số hợp chất khác Qua cho thấy, hợp chất phân phân lập luận án gồm melodamit A (MFE1), flavokawain A (MFE3), 2,6’-dihydroxy-4’-metoxychalcon (MFE4), 2’,4’-dihydroxy-4,6’-dimetoxydihydrochalcon (MFE5), tsugafolin (MFE6), 5-O-metylnaringenin (MFE7), naringenin - 4',7dimetylete (MFB8), kaempferol 3-O-{-D-apiofuranozyl-(12)-[-Lrhamnopyranozyl-(16)]--D-glucopyranozit} (MFB9), rutin (MFB10), oxoanolobin (MFB11), axit 3,3’,4’- trimetoxy ellagic (MFB12) 18 lần phân lập từ loài thuộc chi Dủ dẻ, đặc biệt hợp chất MFE1 hợp chất lần phân lập xác định cấu trúc từ sản phẩm thiên nhiên Hai hợp chất β-sitosterol (MFH2) sitosterol-3-O--D-glucopyranozit (MFB13) có cấu trúc giống với hai hợp chất ASE6 ASE7 phân lập từ na phân lập từ loài dủ dẻ trâu 3.3 Kết thử hoạt tính sinh học chất phân lập 3.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào Bốn hợp chất ent-kauran tinh khiết phân lập từ na (Annona squamos L.) gồm: axit ent-kaur-16-en-19-oic (ASE1), axit 16-hydro17-axetoxy-ent-kauran-19-oic (ASE2), axit 16-hydro-19-al-ent-kauran17-oic (ASE4), 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al (ASE5) tiến hành thử hoạt tính in vitro với ba dịng tế bào ung thư người: ung thư gan (Hep-G2- Human hepatoma), ung thư phổi (Lu- Human lung carcinoma) ung thư vú (MCF-7- Human breast adenocarcinoma) Các giá trị bảng 3.22 cho thấy hợp chất ASE4 ASE2 thể hoạt tính với dịng tế bào thử nghiệm có giá trị % CS > 50%, điều có nghĩa khả gây độc tế bào chúng yếu nên xem hoạt tính với thử nghiệm Các hợp chất với giá trị % CS < 50% chọn để tiếp tục thử nghiệm Bảng 3.22: Kết thử hoạt tính gây độc tế bào theo cơng thức Ducan Nồng Dòng tế bào KH T độ Cell survival (%) Kết luận mẫu T Lu MCF-7 (g/ml) Hep-G2 DMSO Chứng (+) ASE1 100,0  0,0 100,0  0,0 100,0 0,0 5 0,0  0,0 16,5  0,08 1,3  0,1 61,1  0,7 1,5  0,06 Dương tính 1,6  0,2 Dương tính với HepG2 MCF-7 19 ASE2 70,6  0,4 88,20,6 68,5  1,0 Âm tính ASE4 85,6  1,2 92,5  1,2 95,1  0,6 Âm tính ASE5 69,3  0,4 90,8  1,1 38,7  0,5 Dương tính với MCF-7 Bảng 3.23: Kết IC50 theo chương trình Table curve TT KH mẫu Chứng (+) Dòng tế bào Cell survival (%) Hep-G2 Lu MCF-7 0,256 0,305 0,287 ASE1 3,140 >5 1,799 ASE5 >5 >5 2,594 Kết luận Dương tính Dương tính với dịng Hep-G2 MCF-7 Dương tính với dịng MCF-7 Hợp chất ASE5 ức chế mạnh dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) với IC50 2,594, hợp chất ASE1 ức chế mạnh dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) ung thư vú (MCF-7) với giá trị IC50 tương ứng 3,14 1,799 Như vậy, hai hợp chất có khả ức chế mạnh dòng tế bào ung thư, đó, hai hợp chất ASE1 ASE5 ức chế tế bào ung thư vú, hợp chất ASE1 có khả ức chế mạnh hợp chất ASE5 IC50 (ASE1) < IC50 (ASE5) 3.3.2 Hoạt tính tạo anion peroxit giải phóng elastase Trong hợp chất phân lập từ dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) có hợp chất gồm: MFE1, MFE3, MFE7, MFE4, MFE6, MFB8, MFB10, MFB12 tiến hành thử nghiệm để đánh giá khả kháng viêm dựa khả ức chế giải phóng elastase, tạo thành anion peroxit (O2-) bạch 20 cầu trung tính cho chúng phản ứng với formyl-L-methionyl-Lleucyl-L-phenylalanin/cytochalasin B (FMLP/CB), từ đánh giá hoạt tính kháng viêm hợp chất Kết thử nghiệm trình bày cụ thể qua giá trị bảng 3.24 Bảng 3.24: Hiệu hợp chất trình tạo anion peroxit giải phóng elastase Anion peroxit Giải phóng elastase Hợp chất a IC50 (µM) (Inh %) (Inh %) MFE1 5,25 ± 0,48 (39,17 ± 6,87)** MFE3 8,65 ± 1,93 (40,22 ± 6,72)** MFE4 8,40 ± 2,19 (25,14 ± 5,22)** MFB6 (2,50 ± 1,43) (10,14 ± 6,49) MFE7 (2,20 ± 1,68) (2,11 ± 7,91) MFE8 (7,69 ± 5,72) (-4,54 ± 1,44)* MFB10 (39,46 ± 2,29)*** (10,06 ± 4,75) * MFB12 (3,08 ± 0,88) (14,91 ± 5,97) b Sorafenib 3,44 ± 0,29 1,00 ± 0,60 b SB202190 6,73 ± 0,65 (5,53 ± 3,50) Percentage of inhibition (Inh %) nồng độ 10 µM Các kết biểu thị giá trị trung bình ± SEM (n =3) * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 so sánh với giá trị đối chứng a Nồng độ cần thiết để ức chế 50% (IC50) b Sorafenib tosylate SB202190 sử dụng làm chất đối chứng dương Từ số liệu thu bảng 3.23 cho ta biết có ba hợp chất MFE1, MFE3, MFE4 thể khả ức chế tạo thành anion peoxit hợp chất thể khả ức chế q trình giải phóng elastase Cụ thể, hợp chất MFE1 với IC50 = 5,25 ± 0,48 µM, hợp chất MFE3 với IC50 = 8,65 ± 1,93 µM MFE4 IC50 = 8,40 ± 2,19 µM Như vậy, hợp chất MFE1 thể hoạt tính cao có giá trị IC50 nhỏ 21 3.3.3 Điểm bật từ kết thử hoạt tính sinh học 3.3.3.1 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ na Trong số hợp chất được phân lập, có hợp chất thử hoạt tính gây độc tế bào có hợp chất thể hoạt tính axit ent-kaur-16-en-19-oic (ASE1) 16,17-dihydroxy-ent-kauran19-al (ASE5) Với kết hoạt tính sinh học so sánh với tư liệu có liên quan cho thấy hợp chất ASE1 với khả gây độc hai dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) ung thư vú (MCF-7) biết đến cơng trình công bố, với hợp chất ASE5 gây độc dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) lần hợp chất báo cáo hoạt tính sinh học 3.3.3.2 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ dủ dẻ trâu Đây lần hợp chất tiến hành thử hoạt tính kháng viêm dựa khả ức chế tạo thành O2- cho bạch cầu trung tính phản ứng với formyl-L-methionyl-L-leucyl-Lphenylalanin/cytochalasin B (FMLP/CB), số hợp chất thử hoạt tính, có hợp chất gồm melodamit A (MFE1), flavokawain A (MFE3), 2,6’-dihydroxy-4’-metoxychalcon (MFE4) thể hoạt tính kháng viêm Đặc biệt hợp chất MFE1 lần phân lập từ thiên nhiên nên hoạt tính kháng viêm MFE1 lần công bố Khả kháng viêm hợp chất MFE3 biết đến dựa khả ức chế giải phóng iNOS, COX-2, NO PGE2 kích thích lipopolysaccharides (LPS) qua thử nghiệm đại thực bào chuột [59], lần tiến hành khảo khát khả kháng viêm theo phương pháp 22 KẾT LUẬN Lần Việt Nam, có cơng trình khoa học báo cáo thành phần hóa học hoạt tính sinh học chất phân lập từ na (Annona squamosa L.) dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) Nghiên cứu thành phần hoá học na dủ dẻ trâu Việt Nam thu số kết sau:  Từ dịch chiết na (Annona squamosa L.) phân lập xác định cấu trúc hợp chất ent-kauran diterpenoit: axit ent-kaur16-en-19-oic (ASE1), axit 16-hydro-17-axetoxy-ent-kauran-19-oic (ASE2), axit 16- hydro-ent-kauran-17,19-dioic (ASE3), axit 16hydro-19-al-ent-kauran-17-oic (ASE4), 16,17-dihydroxy-ent-kauran19-al (ASE5) 02 hợp chất steroit là: β-sitosterol (ASE6) sitosterol-3-O--D-glucopyranozit (ASE7)  Từ dịch chiết dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc 13 hợp chất bao gồm: - 01 hợp chất amit thơm melodamit A (MFE1), - 08 hợp chất flavonoit là: flavokawain A (MFE3), 2,6’dihydroxy-4’-metoxychalcon (MFE4), 2’,4’-dihydroxy-4,6’dimetoxydihydrochalcon (MFE5), tsugafolin (MFE6), 5-Ometylnaringenin (MFE7), naringenin - 4',7- dimetylete (MFB8), kaempferol 3-O-{-D-apiofuranozyl-(12)-[-L-rhamnopyranozyl(16)]--D-glucopyranozit} (MFB9), rutin (MFB10), - 01 hợp chất ankaloit oxoanolobin (MFB11), - 01 hợp chất tannin axit 3,3’,4’- trimetoxy ellagic (MFB12), - 02 hợp chất steroit β-sitosterol (MFH2) -sitosterol3-O--D-glucopyranozit (MFB13) 23 - Xác định thông số cấu trúc tinh thể hợp chất melodamit A (MFE1) Các số liệu tinh thể học hợp chất melodamit A (CCDC 872 187) lưu trữ Trung tâm liệu Cambridge  Hợp chất axit ent-kaur-16-en-19-oic (ASE1) có khả gây độc dịng tế bào ung thư gan (Hep-G2) ung thư vú (MCF-7), hợp chất 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al (ASE5) gây độc dòng tế bào ung thư vú (MCF-7), đó, hợp chất ASE1 gây độc tế bào ung thư vú mạnh ASE5  Hợp chất melodamit A (MFE1), flavokawain A (MFE3) 2,6’-dihydroxy-4’-metoxychalcon (MFE4) có khả ức chế tạo thành anion peroxit bạch cầu trung tính người hoạt hóa FMLP/CB với khả ức chế đường ức chế đánh dấu p38 MAPK từ cho thấy chúng có hoạt tính chống viêm nhiễm 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ Bùi Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Lương Thiện, Nguyễn Phan Chung, Trần Đình Thắng (2011), hợp chất Flavonoit từ Dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum L.) Việt Nam, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 49 (3A) tr 7-11 Bùi Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Nguyễn Thị Hồng, Trần Đình Thắng (2011), Các hợp chất diterpenoit na (Annona squamosa L.) Việt Nam Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 49 (3A) tr 106-111 Bùi Thị Minh Nguyệt, Trương Thị Ngọc Hiền, Trần Đình Thắng (2012), Một số hợp chất phân lập từ dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum L.) Việt Nam Tạp chí Khoa học Công nghệ, 50 (3A) tr.120-125 Hsiu-Hui Chan, Tsong-Long Hwang, Tran Dinh Thang, YannLii Leu, Ping-Chung Kuo, Bui Thi Minh Nguyet, Do Ngoc Dai, Tian-Shung Wu (2013,) Isolation and synthesis of melodamide A, a new anti-inflammatory phenolic amide from the leaves of Melodorum fruticosum Planta Medica, 79 (3-4), pp 288-294 ... - Thử hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án na (Annona squamosa L.) thuộc chi Na (Annona) dủ dẻ trâu (Melodrum fruticosum Lour.) thuộc chi... Việt Nam, có cơng trình khoa học báo cáo thành phần hóa học hoạt tính sinh học chất phân lập từ na (Annona squamosa L.) dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) Nghiên cứu thành phần hoá học na. .. 7-11 Bùi Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Nguyễn Thị Hồng, Trần Đình Thắng (2011), Các hợp chất diterpenoit na (Annona squamosa L.) Việt Nam Tạp chí Khoa học Công nghệ, 49 (3A) tr 106-111 Bùi

Ngày đăng: 09/01/2015, 20:15

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

Tài liệu liên quan