ĐạI HọC QuốC GIA Hà NộI Tr-ờng đại học khoa học tự nhiên - Trần thị nga Xác định rhodamine thực phẩm Kỹ THUậT sắc ký lỏng Hiệu cao hplc Sử DụNG DETETOR UV Luận văn thạc sĩ khoa học Giảng viên h-ớng dẫn: pgs.ts phạm luận H Ni - 2011 Luận văn tốt nghiệp Chun ngành phân tích Mơc lơc MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Một vài nét rhodamine B 1.1.1 Công thức cấu tạo 1.1.2 Tính chất lý học 1.1.3 Tính chất sinh học………………………………………………… 1.1.3 Ứng dụng 1.2 Các phƣơng pháp xác định rhodamine B 1.2.1 Phƣơng pháp sắc ký cổ điển - phƣơng pháp sắc ký giấy hay sắc ký mỏng- TLC 1.2.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 1.2.2.1 Nguyên tắc chung trang bị phƣơng pháp HPLC………………… …………………………………………………… …8 1.2.2.2 Giới thiệu chung phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng…………10 1.2.2.3 Các kết nghiên cứu rhodamine B phƣơng pháp HPLC 11 1.2.3 Phƣơng pháp UV- Vis xác định rhodamine B 13 Chƣơng 2: 14 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tƣợng, mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu 14 2.1.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu 14 2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu 14 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Detector UV-Vis 16 2.2.2 Phân tích định lƣợng HPLC 17 2.3 Hoá chất dụng cụ nghiên cứu 18 2.3.1 Hoá chất 18 2.3.2 Máy móc thiết bị 19 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 88 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hố K20 Luận văn tốt nghiệp Chun ngành phân tích 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 21 3.1.1 Chọn thể tích vịng mẫu (sample loop) 21 3.1.2 Chọn bƣớc sóng detector 22 3.1.2.1 Phƣơng pháp 24 3.1.2.2 Phƣơng pháp 26 3.2 Chọn pha tĩnh 28 3.3 Tối ƣu hóa pha động 30 3.3.1 Ảnh hƣởng thành phần pha động tới khả tách sắc ký 30 3.3.1.1 Pha động thứ 31 3.3.1.2 Pha động thứ hai 36 3.3.2 Ảnh hƣởng pH đến trình tách sắc ký……………………………………………………………………….………40 3.3.2.1 Pha động gồm 70% MeOH- 30% đệm 40 3.3.2.2.Pha động gồm 85% ACN- 15% đệm 43 3.3.3 Ảnh hƣởng chất phụ 45 3.3.3.1 Ảnh hƣởng trietylamin hệ pha động gồm MeOH đệm 45 3.3.3.2 Ảnh hƣởng natri 1- heptansunfonat tới dung môi ACN đệm fomat có pH=3 48 3.3.4 Khảo sát tốc độ pha động 51 3.3.4.1 Hệ pha động MeOH – đệm 51 3.3.4.2 Hệ pha động ACN – đệm 53 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 57 3.4.1 Tổng kết điều kiện chọn 57 3.4.2 Khảo sát lập đƣờng chuẩn khoảng nồng độ 0,01- 2,00ppm với pha động ACN- Đệm 57 3.4.3 Giới hạn phát (limit of detection- LOD) 61 3.4.3.1 Phƣơng pháp tính tốn theo đƣờng chuẩn 61 3.4.3.2 Phƣơng pháp trực tiếp 63 3.4.4 Giới hạn định lƣợng (limit of quanlity- LOQ) 64 89 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 3.4.5 Độ phép đo 64 3.4.6 Độ lặp lại phép đo 68 3.5 Phân tích mẫu thực phẩm, quy trình xử lý kết phân tích 69 3.5.1 Khảo sát dung môi chiết lấy Rhodamine B 69 3.5.1.1 Xử lý sơ mẫu phân tích 69 3.5.1.2 Chọn dung môi chiết 70 3.5.2 Phân tích mẫu thực từ dung dịch chiết 74 3.5.2.1 Mẫu hạt dƣa 74 3.5.2.2 Mẫu bánh xu xê 77 3.5.2.4 Mẫu siro dâu 79 3.5.2.5 Mẫu nƣớc hƣơng dâu 80 KẾT LUẬN 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 90 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao UV Vùng tử ngoại Vis Vùng khả kiến ADN LC- MS Sắc ký lỏng khối phổ SPE Cột chiết pha rắn TLC Sắc ký mỏng MSD Detectơ khối phổ DAD 10 NP- HPLC Sắc ký hấp phụ pha thường 11 RP- HPLC Sắc ký hấp phụ pha đảo 12 Ex- HPLC Sắc ký trao đổi ion 13 Gel- HPLC Sắc ký rây phân tử 14 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam 15 SD Độ lệch chuẩn 16 LOD Limit of detection Giới hạn phát 17 LOQ Limit of quanlity Giới hạn định lượng Acid dedonucleoic Diod array Điốt array Luận văn tốt nghiệp Chun ngành phân tích Danh mơc b¶ng Bảng 3.1 Diện tích chiều cao pic phụ thuộc vào bước sóng detector hệ dung mơi 75% metanol-25% nước 25 Bảng 3.2 Diện tích chiều cao pic phụ thuộc vào bước sóng detector hệ dung môi 85% axetonitril- 15% nước (0,005M natri 1heptansunfonat) 27 Bảng 3.3 Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động 31 Bảng 3.4 Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động 37 Bảng 3.5 Sự phụ thuộc k’ vào giá trị pH dung dịch đệm pha động 40 Bảng 3.6 Sự phụ thuộc k’ vào giá trị pH dung dịch đệm pha động 43 Bảng 3.7 Hệ số dung lượng ki’ phụ thuộc vào nồng độ trietylamin 45 Bảng 3.8 Diện tích píc phụ thuộc vào nồng độ natri heptansunfonat 48 Bảng 3.9 Diện tích píc Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động 51 Bảng 3.10 Diện tích píc Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động 54 Bảng 3.11 Diện tích píc sắc ký phụ thuộc vào nồng độ Rhodamine B 58 Bảng 3.12 Độ xác phép đo nồng độ 0,1ppm 65 Bảng 3.13 Độ xác phép đo nồng độ 0,5ppm 66 Bảng 3.14 Độ xác phép đo nồng độ 1,0ppm 67 Bảng 3.15 Độ lặp lại phép đo nồng độ 69 Bảng 3.16 Ảnh hưởng dung môi chiết tới hàm lượng Rhodamine B 70 Bảng 3.17 Ảnh hưởng dung mơi chiết tới diện tích píc Rhodamine B 72 Bảng 3.18 Kết phân tích mẫu hạt dưa 75 Bảng 3.19 Kết phân tích mẫu bánh xu xê 77 Bảng 3.20 Kết phân tích mẫu siro dâu 79 Bảng 3.21 Kết phân tích mẫu nước hương dâu 81 91 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hố K20 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 15 Hình 3.1 Phổ hấp thụ ánh sáng dung dịch chuẩn rhodamine B 23 Hình 3.2 Diện tích píc sắc ký rhodamine B phụ thuộc vào bước sóng detectơ 26 Hình 3.3 Diện tích píc sắc ký rhodamine B 28 Hình 3.4 Sắc ký đồ Rhodamine B cột tách khác 29 Hình 3.5 Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % MeOH pha động 32 Hình 3.6 Sắc đồ píc sắc ký tỷ lệ thành phần pha động khác 34 Hình 3.7 Sắc đồ píc sắc ký tỷ lệ thành phần ACN khác 35 Hình 3.8 Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % ACN pha động 37 Hình 3.9 Sắc đồ píc sắc ký tỷ lệ thành phần pha động khác 39 Hình 3.10 Sự phụ thuộc ki’ vào giá trị pH dung dịch đệm 41 Hình 3.11 Sắc đồ pic sắc ký pH khác nhauđối với pha động MeOH-đệm42 Hình 3.12 Sự phụ thuộc ki’ vào giá trị pH dung dịch đệm 43 Hình 3.13 Sắc đồ pic sắc ký pH khác 44 Hình 3.14 Sự phụ thuộc hệ số dung lượng vào nồng độ TEA 46 Hình 3.15 Sắc đồ píc sắc ký Rhodamine B với nồng độ TEA 47 Hình 3.16 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ natri heptansunfonat 49 Hình 3.17 Sắc đồ píc sắc ký Rhodamine B với nồng độ 50 Hình 3.18 Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động 52 Hình 3.19 Sắc đồ sắc ký tốc độ khác pha động 53 Hình 3.20 Sự phụ thuộc diện tích pic vào tốc độ pha động 54 Hình 3.21 Sắc đồ sắc ký tốc độ khác pha động 56 Hình 3.22 Đường chuẩn theo diện tích pic khoảng nồng độ 59 Hình 3.23 Sắc đồ píc sắc ký nồng độ khác Rhodamine B 61 Hình 3.24 Sắc đồ píc sắc ký mẫu chuẩn Rhodamine B nồng độ 63 Hình 3.25 Sắc đồ pic sắc ký sau lần đo nồng độ 0,1ppm 66 Hình 3.26 Sắc đồ pic sắc ký sau lần đo nồng độ 0,5ppm 67 Hình 3.27 Sắc đồ pic sắc ký sau lần đo nồng độ 1,0ppm 68 Hình 3.28 Sắc đồ píc sắc ký mẫu hạt dưa với dung mơi chiết 71 Hình 3.29 Sắc đồ píc sắc ký Rhodamine với tỷ lệ dung mơi chiết 73 Hình 3.30 Đường chuẩn (a) sắc đồ (b) thêm chuẩn mẫu hạt dưa75 Hình 3.31 Đường chuẩn sắc đồ thêm chuẩn mẫu bánh xu xê 78 Hình 3.32 Đường chuẩn(a) sắc đồ (b)khi thêm chuẩn mẫu siro 80 Hình 3.33 Đường chuẩn (a)và sắc đồ (b)khi thêm chuẩn mẫu nước ngọt82 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích MỞ ĐẦU Khi xã hội ngày phát triển vấn đề sức khoẻ người ngày trọng, vấn đề an tồn thực phẩm vệ sinh mơi trường đặt lên hàng đầu có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người Sự tồn dư chất độc hại có thực phẩm vấn đề đáng lo ngại người tiêu dùng Ngày với phát triển khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật phân tích mới, đại áp dụng nhiều lĩnh vực khác đặc biệt đánh giá, kiểm định chất độc thực phẩm Trong trinh chế biến thực phẩm, để tạo cho thực phẩm màu sắc đẹp, bắt mắt, người ta sử dụng phẩm màu cơng nghiệp Phẩm màu cơng nghiệp nói chung, rhodamine B nói riêng độc hại, bị cấm sử dụng thực phẩm khó phân huỷ, ảnh hưởng đến gan, thận tồn dư lâu ngày gây độc hại đến thể người, đặc biệt gây ung thư Phẩm màu thực phẩm tự nhiên có độ bền hơn, lại đắt phẩm màu công nghiệp Do nhiều người lạm dụng phẩm màu công nghiệp chất bị cấm sử dụng thực phẩm Vì việc nghiên cứu xác định hàm lượng rhodamine B vấn đề cần thiết để bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Tuy nhiên, ngồi có mặt rhodamine B cịn có thành phần hố học khác có phẩm nhuộm Sudan- I, Sudan- IV,…Phương pháp tối ưu để xác định rhodamine B sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Đây phương pháp ứng dụng nhiều năm gần Nó áp dụng để tách nhận dạng xác định hàng loạt hợp chất mà số phương pháp khác gặp nhiều khó khăn hợp chất khơng bền với nhiệt, hợp chất có tính chất hố học tương tự nhau,…Phương pháp HPLC có nhiều ưu Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích điểm mà phương pháp khác khơng có như: xác định đồng thời nhiều chất, tốn mẫu, thao tác đơn giản,… Trong phân tích phương pháp HPLC có hai loại cột tách thường sử dụng cột trao đổi ion cột tách pha đảo Trong luận văn này, tiến hành khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình tách xác định hàm lượng rhodamine B số mẫu thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detetor UV- Vis Phương pháp có độ chọn lọc cao, độ nhạy tốt trang bị nhiều sở kiểm nghiệm nước ta, có tính khả thi tính ứng dụng thực tế cao Phân tích số mẫu thực phẩm hạt dưa, bánh xu xê, mứt, …và mẫu thực phẩm khác nhằm đánh giá hàm lượng rhodamine B mẫu thực phẩm Dựa kết nghiên cứu phân tích hàm lượng rhodamine B mẫu thực phẩm mà đánh giá vấn đề an toàn thực phẩm sở sản xuất Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Một vài nét rhodamine B 1.1.1 Công thức cấu tạo Rhodamine B hợp chất hóa học, thành phần phẩm màu công nghiệp Công thức phân tử C28H31ClN2O3 Phân tử khối 479,02g/mol Công thức cấu tạo rhodamine B [9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]-diethylammonium chloride 1.1.2 Tính chất vật lý Rhodamin B tinh thể màu tối có ánh xanh hay dạng bột màu nâu đỏ Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 2100 C đến 2110C Rhodamine B thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tan tốt methanol, ethanol, nước (khoảng 50 g/l) Dung dịch nước rượu etylic có màu đỏ ánh xanh nhạt phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ dung dịch loãng Dung dịch nước hấp thụ cực đại với ánh sáng có  = 526 517 nm Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp 1/3.514 10.0 mV(x10) Detector A Ch2:555nm 1/3.522 mV(x10) Detector A Ch2:555nm Chuyên ngành phân tích 3.0 2.5 7.5 2.0 5.0 1.5 1.0 2.5 0.5 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min (c) (d) 1/3.509 mV 4.0 Detector A Ch2:555nm 3.0 2.0 1.0 0.0 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 (e) Hình 3.29 Sắc đồ píc sắc ký rhodamine với tỷ lệ dung mơi chiết (a) 80% nước- 20% etanol (b) 70% nước- 30% etanol (c) 60% nước- 40% etanol (d) 50% nước- 50% etanol (e) 40% nước- 60% etanol Với số liệu khảo sát mẫu hạt dưa tỷ lệ dung môi chiết etanol- nước khác nhau, nhận thấy dung mơi chiết thích hợp 60% nước- 40% etanol (hình 3.29- c) pic thu gọn diện tích lớn Ba mẫu cịn lại: bánh xu xê, nước vị dâu siro dâu, tiến hành khảo sát xử lý mẫu với điều kiện tương tự xử lý mẫu hạt dưa, từ hiệu suất thu hồi trình chiết ba loại mẫu nhận thấy dung mơi chiết thích hợp 60% nước- 40% etanol 73 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 3.5.2 Phân tích mẫu thực từ dung dịch chiết 3.5.2.1 Mẫu hạt dƣa Sau tìm điều kiện tối ưu cho trình xử lý mẫu, chúng tơi tiến hành phân tích mẫu thực đối tượng mẫu: hạt dưa, bánh xu xê, nước ngọt, tương ớt Đối với mẫu hạt dưa,quy trình chiết sau: mẫu hạt dưa cân xác 0,5g cân phân tích chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết chuyển vào bình định mức 10ml định mức pha động, lắc lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn (mục 3.4.1) Đối với chất mẫu phân tích thêm chuẩn lượng chất chuẩn thêm vào từ đầu trước chiết Các trình chiết tiến hành điều kiện tương tự mẫu phân tích khơng thêm Xác định hàm lượng rhodamine B mẫu hạt dưa theo phương pháp thêm tiêu chuẩn, thông qua cách lập phương trình hồi quy đường thêm chuẩn dạng y= a+ bx Ta có: Cx  S S S a x  ( a )2  ( b )2 b Cx a b Trong đó: Cx : nồng độ chất phân tích có dung dịch bơm vào cột tách a, b hệ số phương trình hồi qui Sa, Sb: sai số hệ số phương trình hồi qui Sx : sai số nồng độ xác định theo phương pháp thêm chuẩn Khối lượng chất phân tích có a mg mẫu cân ban đầu là: 74 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích mcpt= V*Cx*F*10-3 Trong đó: mcpt: khối lượng chất phân tích a mg mẫu (mg) V: thể tích dung dịch pha từ a mg F: hệ số pha loãng Cx: nồng độ chất phân tích xác định từ phương trình hồi qui 10-3: hệ số chuyển từ g sang mg Kết phân tích mẫu rhodamine B trình bày bảng 3.18 Bảng 3.18 Kết phân tích mẫu hạt dưa Khối lƣợng mẫu Lƣợng rhodamine thực (mg) TT Diện tích píc (mAu.s) B chuẩn thêm vào (ppm) 500 0,0 546419,0 500 0,5 1295550 500 1,0 2364128 Kết tính tốn theo phần mềm thống kê Origin 7.5 sau: 70000 3500000 60000 3000000 50000 Y=A+B*X 40000 Spic(mAu.s) 2500000 he so gia tri sai so -A 1.03868E6 17297.10384 B 2.2321E6 26796.55804 2000000 1500000 R SD N P -0.99993 18948.02791 0.00764 1000000 500000 -0.4 -0.2 20000 10000 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 nong Rhodamine B(ppm) -0.6 30000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 (a) (b) Hình 3.30 Đường thêm chuẩn (a) sắc đồ (b) thêm chuẩn mẫu hạt dưa 75 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích Ta có: Cx= a/b = 0,465 (ppm) Theo cơng thức tính hàm lượng chất phân tích 500mg mẫu ban đầu, tính được: mx = 0,02325(mg) Hay khối lượng rhodamine B có gam mẫu hạt dưa 0,0465 mg/g Hiệu suất thu hồi tính theo cơng thức sau: H Với Cx  Cx 100% C0 ( S y  S0 )  a b F m Trong đó: a,b hệ số hồi qui phương trình đường chuẩn F hệ số pha lỗng m khối lượng cân mẫu phân tích Cx lượng chất tính từ đường chuẩn hồi qui C0 lượng chất thêm chuẩn ban đầu Dựa vào cơng thức tính hiệu suất thu hồi chất phân tích H= 0,465/0,5 x 100=93% Nhận xét: Với kết phân tích trên, nhận thấy rằng, đối tượng mẫu hạt dưa, hàm lượng Rhodamine B nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp, hiệu suất thu hồi tương đối tốt (93%) Như với đối tượng phân tích mẫu hạt dưa dung mơi chiết phương pháp tối ưu lựa chọn phù hợp cho hiệu phân tích tốt Kết phân tích cho thấy 76 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hố K20 Luận văn tốt nghiệp Chun ngành phân tích mẫu hạt dưa phân tích có chứa rhodamine B 0,0465mg/g, chất bị cấm sử dụng chế biến bảo quản thực phẩm 3.5.2.2 Mẫu bánh xu xê Giống mẫu hạt dưa trên, tiến hành chiết mẫu phân tích theo quy trình tương tự khơng pha lỗng Đối với mẫu bánh xu xê,quy trình chiết sau: mẫu bánh xu xê cân xác lượng 1,030g cân phân tích chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết , lắc lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn (mục 3.4.1) Kết phân tích mẫu rhodamine B bánh xu xê trình bày bảng 3.19 Bảng 3.19 Kết phân tích mẫu bánh xu xê TT Khối lƣợng mẫu Lƣợng Rhodamine Diện tích píc (mAu.s) thực (mg) B chuẩn thêm vào (ppm) 1030,4 0,0 305 245 1030,0 0,2 657 811 1035,0 0,4 044 941 Kết tính tốn theo phần mềm thống kê Origin 7.5 sau: 77 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 1100000 40000 1000000 900000 Y=A+B*X Spic(mAu.s) 800000 he so gia tri sai so -A 299484.33333 12881.24226 B 1.84924E6 49888.83676 700000 600000 500000 30000 20000 400000 R SD N P -0.99964 14110.69391 0.01717 300000 200000 10000 100000 nong Rhodamine B(ppm) -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 (a) 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 (b) Hình 3.31 Đường chuẩn sắc đồ thêm chuẩn mẫu bánh xu xê Ta có: Cx= a/b = 0,162 (ppm) Theo cơng thức tính hàm lượng chất phân tích 1030mg mẫu ban đầu, tính mx = 0,000324(mg) Hay khối lượng rhodamine B có gam mẫu là: 0,000315mg/g Hiệu suất thu hồi chất phân tích mẫu H= 0,162/0,2 x 100=81% Nhận xét: Với kết phân tích trên, nhận thấy rằng, đối tượng mẫu bánh xu xê, hàm lượng rhodamine B nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp, hiệu suất thu hồi tương đối tốt (81%), hàm lượng Rhodamine B thu 0,162mg/kg Như với đối tượng phân tích mẫu bánh xu xê dung mơi chiết phương pháp tối ưu lựa chọn phù hợp cho hiệu phân tích tốt Kết phân tích cho thấy mẫu bánh xu xê phân tích có chứa 0,000315mg/g rhodamine B 78 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 3.5.2.4 Mẫu siro dâu Quá trình chiết mẫu phân tích tiến hành tương tự mẫu hạt dưa mẫu bánh xu xê, khơng pha lỗng Đối với mẫu siro dâu,quy trình chiết sau: mẫu siro dâu lấy xác 0,5ml pipet chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10 ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn (mục 3.4.1) Kết phân tích mẫu rhodamine B mẫu siro dâu trình bày bảng 3.20 Bảng 3.20 Kết phân tích mẫu siro dâu Lƣợng mẫu thực Lƣợng rhodamine (ml) TT Diện tích píc (mAu.s) B chuẩn thêm vào (ppm) 0,5 0,00 28047 0,5 0,01 61781 0,5 0,02 96730 Kết tính tốn theo phần mềm thống kê Origin 7.5 sau: 79 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 3000 100000 90000 80000 Spic(mAu.s) 1000 Y=A+B*X 70000 2000 he so gia tri sai so -A 27844.5 452.80377 B 3.43415E6 35074.02885 60000 50000 40000 R SD N P -0.99995 496.02167 0.0065 30000 20000 -1000 10000 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 nong RhodamineB(ppm) -0.010 -0.005 0.000 0.005 (a) 0.010 0.015 0.020 (b) Hình 3.32 Đường chuẩn (a) sắc đồ (b)khi thêm chuẩn mẫu siro dâu Ta có: Cx= a/b = 0,0081(ppm) (nhỏ LOQ) Theo cơng thức tính hàm lượng chất phân tích 0,5ml mẫu ban đầu, tính mx = 1,62.10-5(mg) Hay khối lượng rhodamine B có 1l mẫu siro dâu 0,0324mg/l Hiệu suất thu hồi chất phân tích mẫu H= 0,0081/0,01 x 100=81% Nhận xét: Với kết phân tích trên, nhận thấy rằng, đối tượng mẫu siro dâu, hàm lượng rhodamine B nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp, hiệu suất thu hồi tương đối tốt Như với đối tượng phân tích mẫu siro dâu dung mơi chiết phương pháp tối ưu lựa chọn phù hợp cho hiệu phân tích tốt Kết phân tích cho thấy mẫu siro dâu phân tích khơng chứa rhodamine B 3.5.2.5 Mẫu nƣớc hƣơng dâu 80 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích Q trình chiết mẫu phân tích nước hương dâu tiến hành tương tự mẫu siro Đối với mẫu nước hương dâu,quy trình chiết sau: mẫu nước đong xác 1ml pipet chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10 ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn (mục 3.4.1) Kết phân tích mẫu rhodamine B mẫu nước hương dâu trình bày bảng sau: Bảng 3.21 Kết phân tích mẫu nước hương dâu TT Lƣợng (ml) mẫu thực Lƣợng rhodamine Diện tích píc (mAu.s) B chuẩn thêm vào (ppm) 1,0 0,0 96898,0 1,0 0.1 169861 1,0 0.2 248919 Kết tính toán theo phần mềm thống kê Origin 7.5 sau: 81 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 260000 10000 240000 220000 Y=A+B*X 200000 7500 Spic(mAu.s) 180000 he so gia tri sai so -A 95882.16667 2271.47239 B 760105 17594.74945 160000 140000 120000 100000 R SD N P 2500 0.99973 2488.27333 0.01473 80000 60000 40000 20000 -0.20 -0.15 -0.10 5000 -0.05 0.00 nong Rhodamine B(ppm) 0.05 0.10 0.15 0.20 1.0 2.0 ( a) 3.0 4.0 5.0 6.0 (b) Hình 3.34 Đường chuẩn (a) sắc đồ (b) thêm chuẩn mẫu nước hương dâu Ta có: Cx= a/b = 0,126(ppm) Theo cơng thức tính hàm lượng chất phân tích 1ml mẫu ban đầu, tính mx =0,1386 (mg) Hay khối lượng rhodamine B 1l mẫu nước hương dâu 138,6mg/l Hiệu suất thu hồi chất phân tích mẫu H= 0,126/0,1 x 100=126% Nhận xét: Với kết phân tích trên, nhận thấy rằng, đối tượng mẫu nước ngọt, hàm lượng Rhodamine B nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp, hiệu suất thu hồi tốt (126%) Như với đối tượng phân tích mẫu nước hương dâu dung mơi chiết phương pháp tối ưu lựa chọn phù hợp cho hiệu phân tích tốt Kết phân tích cho thấy mẫu nước phân tích có chứa 138,6mg/l rhodamine B 82 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích KẾT LUẬN Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, nhằm ứng dụng kỹ thuật phân tích HPLC sử dụng detector UV-Vis để xác định hàm lượng rhodamine B thực phẩm, thu số kết sau đây: Đã chọn điều kiện phù hợp cho việc xác định hàm lượng rhodamine B có mẫu thực phẩm kỹ thuật HPLC sử dụng detetơ UV-Vis: Pha tĩnh: RP- C8 (4,6 x 150 mm, 5m) Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 7mM natri heptansunfonat), pH=3 Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút Nhiệt độ cột tách: 300C Thể tích vịng mẫu: 20l Detector: UV-Vis 550 nm Đã đánh giá phương pháp phân tích: Khoảng tuyến tính Rhodamine B: 0,01- 2ppm Giới hạn phát hiện: + Theo phương pháp phân tích trực tiếp 1ppb + Theo phương pháp đường chuẩn 15ppb Giới hạn định lượng: + Theo phương pháp phân tích trực tiếp 3,33ppb + Theo phương pháp đường chuẩn 50,2ppb Khảo sát mẫu thực  Đã chọn quy trình phân tích khảo sát dung môi chiết tách loại thực phẩm 60% nước- 40% etanol 83 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích  Trên sở quy trình tối ưu tìm tiến hành xác định hàm lượng rhodamine B mẫu thực phẩm gồm mẫu hạt dưa, mẫu bánh xu xê, mẫu siro dâu, mẫu nước hương dâu với độ lặp lại tốt  Kết xác định mẫu thực cho thấy: mẫu thực phẩm lưu hành thị trường lấy mẫu, hàm lượng rhodamine B xác định nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Chứng tỏ bị cấm sử dụng chế biến bảo quản thực phẩm, rhodamine B sử dụng phổ biến số loại thực phẩm kiểm tra Từ kết thu được, thấy phương pháp HPLC sử dụng detectơ UV-Vis có độ nhạy cao, thích hợp cho việc xác định hàm lượng rhodamine B có loại thực phẩm với cách xử lý mẫu thích hợp Chúng tơi hy vọng nghiên cứu góp phần vào việc ứng dụng kỹ thuật HPLC sử dụng detectơ UV-Vis nói riêng kỹ thuật HPLC nói chung để xác định rhodamine B đối tượng mẫu thực phẩm, phục vụ lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng 84 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích TÀI LIỆU THAM KHẢO Thái Bình (18/ 11/2009), “Rhodamine B có vị thuốc đông y chất gây ung thư”, báo Sức khoẻ đời sống Nguyễn Thạc Cát, Từ Vọng Nghi, Đào Hữu Vinh (1980) “Cơ sở ký thuyết hố học phân tích”, nhà xuất Đại học trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Nguyễn Xuân Dũng, Từ Vọng Nghi, Phạm Luận (1986) “Các phương pháp tách- Sắc ký lỏng cao áp”, Đại học Tổng hợp Amsterdam, Hà Nội Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xn Trung (2003), “Hố học phân tích- Phần II- Các phương pháp phân tích cơng cụ”, ĐHQG Hà Nội Nguyễn Đắc Kiên (2009- 2010), “Nghiên cứu hình thành tích lũy độc tố afltoxin bảo quản thức ăn thủy sản”, luận văn thạc sỹ khoa họcĐại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia, Hà Nội Phạm Luận (1999), “Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu cao”, Đại học Tổng hợp Hà Nội Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Đào Tố Uyên, Phạm Văn Hoan (2009), “Xác định Sudan I số loại gia vị kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)”, tạp chí y học thực hành, số (641+642), trang 58-60 Đỗ Văn Quân (2007), “Xác định hợp chất Sudan phương pháp sắc ký lỏng có độ phân giải cao” Luận văn thạc sỹ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội TCVN 8670-2011 việc xác định Rhodamine B HPLC 10 An activity of asean committee on science and technology  federation of institutes of food science and technology in asean (2005), “identification 85 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích of prohibited colorants in cosmetic products by TLC and HPLC”, ACM SIN 02, pp 1-6 11.Brian Stuart and M.Walker (2006) “Analysis of illegal Dyes in Chili Powder by LC- UV”, Statutory analysis government chemist: Programme ad hoc project 1, pp 1-11 12.C.Minier (1996) “Rhodamine B accumulation and MXR protein expression in musscle blood cells: effects of exposure to vicristine” Marine ecology progress series vol 142 pp 165-173 13 Carcinogen, Pesticide Branch, (2/1989), Rhodamine B, OSHA analytical Laboratory- Salt Lake city- Utah 14.Geertruida Sihombing (2001), “An Exploratory Study on three Synthetic Colouring Matters Commonly Used as Food colours in Jakarta”, Master Theses from JKPKBPPK 15.Hu- sheng cheng (2007) “Indentification of Rhodamine B 6g and Rhodamine B dyes present in ballpoint pen ink using high performance liquidchromatography and UV vis spectro mettry”, Frorensic science journal pp21-37 16 L.Gagliardi, D.De Orsi, G.Cavazzutti, G.Multari, D Tonelli, (6/1996), “HPLC determination of rhodamine B (C.I 45170) in cosmetic products”, Chromatographia Vol.43.ultari 17.Noureddine Barka and CS(2008) “Factors influencing the photocatalytic degradation of Rhodamine B by TiO2- coated non- woven paper” journal of photochemistry and photobiology A: Chemistry 195, pp 346-351 18 Giao Xuân, (1/2/2010), “Chili powder maker suspended for Rhodamine B contaminnation health news”, báo Sức khoẻ đời sống 86 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích 19.Petr botek, Jan Poustka (2007) “Determination of banned dyes in spices by liquid chromatography- Mass spectrometry”, Czech J Food Sci, vol.25, No.1, pp 17- 24 20 R.W Mason L.R.Edwards (1989), “High-performance liquid chromatographic determination of rhodamine B in rabbit and human plasma”, Journal of Chromatography, 491 page 468- 472 21.Wirasto, Skrisi (2008) “Analisis Rhodamine B dan metanil yellow danam minuman jajana anak sd di kecamatan laweyan kotamadya surakarta dengan metade kromatography lapis tipis” Fakultas Farmasi, Muhammaadiyah surakarta, Indonesia, pp 2-17 22 http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodamine_B (7/2011) 23 http://vietbao.vn/Suc-khoe/Phat-hien-chat-doc-Rhodamine-B-trong-giavi/70077015/248/ (9/2/2007) 24 http://wordpress.com/2010/03/02/vấn-đề-an-toàn-thực-phẩm-tại-việtnam-nổi-cộm-trở-lại-với-vụ-bột-gia-vị-nhiễm-rhodamine B/Tonelli 25.http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Tools/Phuongphap/SKLM.htm (6/2011) 26.www.asean.org/MRA-Cosmetic/Doc-2.pdf (02/12/2005) 27.http://www.leo.com (9/2008) “Using LC- TOFMS for screening of Sudan Dyes in food” 28.http://duocphamvn.com/baiviet/6159-28-TCN198-2004-Histamin-trongsan-pham-thuy-san-Phuong-phap-dinh-luong-bang-sac.thuoc 29 http://3c.com.vn/Story/vn/tintucvasukien/diemtin/2007/2/8174.htmlc (6/2011) “khâu liên quan đến trình sản xuất lương thực thực phẩm” 87 Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20 ... tách xác định rhodamine B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng cột tách pha ngược dùng detector UV- Vis Xây dựng phương pháp xác định Rhodamine B thực phẩm kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao. .. phẩm Trong trinh chế biến thực phẩm, để tạo cho thực phẩm màu sắc đẹp, b? ??t mắt, người ta sử dụng phẩm màu cơng nghiệp Phẩm màu cơng nghiệp nói chung, rhodamine B nói riêng độc hại, b? ?? cấm sử dụng. .. khác có phẩm nhuộm Sudan- I, Sudan- IV,…Phương pháp tối ưu để xác định rhodamine B sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Đây phương pháp ứng dụng nhiều năm gần Nó áp dụng để tách nhận dạng xác định hàng