1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Như Hoa PHÂN TÍCH BETA-LACTAM TRONG MẪU DƯỢC PHẨM VÀ SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Như Hoa Phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp HPLC Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Nguyễn Văn Ri Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 10 1.1 Giới thiệu về kháng sinh β -lactam 10 1.1.1 Lịch sử ra đời 10 1.1.2 Phân loại 10 1.1.3 Đánh giá tác dụng 10 1.2 Kháng sinh β-lactam 11 1.2.1 Định nghĩa 11 1.2.2 Cấu trúc và phân loại 11 1.2.3 Tính chất vật lí và hóa học 15 1.2.4. Tác dụng 15 1.2.5. Điều chế 16 1.2.6. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 17 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 19 1.3.1. Phương pháp quang học 19 1.3.2. Phương pháp điện hóa 20 1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) 20 1.3.4. Sắc ký bản mỏng ( TLC) 22 1.3.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC) 22 CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 25 2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 25 2.1.2. Nội dung nghiên cứu 25 2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 26 2.2.1. Thiết bị 26 2.2.2. Dụng cụ 26 2.2.3. Hóa chất 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. Khảo sát điều kiện xác định β – lactam bằng LC/MS/MS 28 3.1.1. Khảo sát các điều kiện chạy của detector khối phổ 28 3.1.2. Ch ọn pha tĩnh 30 3.1.3. Chọn pha động 30 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích 32 3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính 32 3.2.2. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 37 3.3. Phân tích mẫu thực tế 38 3.3.1. Phân tích mẫu nước tiểu 38 3.3.2. Phân tích mẫu dược phẩm 49 3.4. Hướng phát triển của đề tài 58 KẾT LUẬN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI Bảng 3.2 Kết quả khảo sát bắn phá các ion mẹ Bảng 3.3 Năng lượng bắn phá và các ion con của beta-lactam Bảng 3.4 Chương trình chạy gradien tối ưu rửa giải các chất beta-lactam Bảng 3.5 Thời gian lưu t r của các kháng sinh nhóm beta-lactam Bảng 3.6 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ các beta-lactam Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các beta-lactam Bảng 3.8 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 1 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 2 Bảng 3.10 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu thêm chuẩn ở nồng độ 5 ppb Bảng 3.11 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu thêm chuẩn ở nồng độ 100 ppb Bảng 3.12 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu thêm chuẩn ở nồng độ 200 ppb Bảng 3.13 Kết quả thực hiện trên mẫu nước tiểu thực Bảng 3.14 Thông tin mẫu thuốc phân tích Bảng 3.15 Bảng tính khối lượng trung bình viên của các mẫu thuốc Bảng 3.16 Khảo sát quy trình xử lý mẫu thuốc Bảng 3.17 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn ở nồng độ 5ppb Bảng 3.18 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn ở nồng độ 100ppb Bảng 3.19 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn ở nồng độ 200ppb Bảng 3.20 Kết quả phân tích mẫu thuốc thực DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin Hình 3.1 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp beta-lactam 100ppb Hình 3.2 Đường chuẩn AMP Hình 3.3 Đường chuẩn PEN G Hình 3.4 Đường chuẩn PEN V Hình 3.5 Đường chuẩn OXA Hình 3.6 Đường chuẩn CLOX Hình 3.7 Đường chuẩn CEP Hình 3.8 Đường chuẩn CEF Hình 3.9 Đường chuẩn AMO Hình 3.10 Sắc đồ mẫu nước tiểu sau 6h Hình 3.11 Sắc đồ phân tích mẫu thuốc DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN: Acetonitrile AMO Amoxicillin AMP Ampicillin APCI Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển CAD Áp suất khí mang trong tứ cực Q 2 CE Thế áp vào tứ cực Q1 CEF Cefaclor CEP Cephalexin CLOX Cloxacillin CUR Khí mang CXP Thế áp vào giữa tứ cực Q2 và Q3 DP Thế đầu vào áp vào màn chắn EP Thế áp vào nguồn ion mẹ ESI Ion hóa phun điện tử GC – MS: Sắc kí khí khối phổ GS1 Áp suất khí hai bên đầu phun GS2 Áp suất của luồng khí nóng HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao IS Thế ion hóa LC-MS Sắc kí lỏng khối phổ LOD Giới hạn phát hiện LOQ Giới hạn định lượng MeOH Methanol OXA Oxacillin PEN G Penicillin G PEN V Penicillin V R% Độ thu hồi RSD% Độ lệch chuẩn tương đối SPE Chiết pha rắn TLC Sắc kí bản mỏng t r Thời gian lưu MỞ ĐẦU Các kháng sinh là một trong những nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện đại. Nhờ thuốc kháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, cúm, và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh gây ra bởi các loại virus, vi khuẩn. Đối với các nước nghèo thuốc kháng sinh lại giữ một vị trí rất quan trọng vì ở các nước này do điều kiện vệ sinh kém và mức sống còn thấp nên thường xảy ra các dịch bệnh. Hiện nay trên thế giới người ta đã phát hiện trên 8000 kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện. Kể từ khi penicillin được ALEXANDER FLEMING phát hiện năm 1929 và được chứng minh có tác dụng chữa bệnh năm 1941 thì trong hơn nửa thế kỷ qua kháng sinh đã trở thành dược phẩm không thể thiếu được trong việc điều trị các loại bệnh do virus, vi khuẩn gây ra và nó có tác dụng hơn hẳn so với các thuốc kháng khuẩn khác [1, 13]. β -Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu vào thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị càng khó khăn. Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có những bệnh do virus không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh. Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây các bệnh về thận, đặc biệt là người cao tuổi. Vì vậy, kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng. Hai phương pháp thường dùng để phân tích các β -lactam là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp điện di mao quản (CE). Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lượng mẫu ít và thời gian phân tích ngắn. Tách và xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector hiện đại như huỳnh quang, MS trong mẫu dược phẩm và sinh học là một hướng nghiên cứu mới, với những ưu điểm nổi bật của nó về độ nhạy và độ chọn lọc ngày càng được áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Xuất phát từ những lý do đó nên tôi đã chọn nghiên cứu đề tài: : "Phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp HPLC” sử dụng detector MS/MS. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về kháng sinh β -lactam [1, 2, 11] 1.1.1 Lịch sử ra đời Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh, và sau đó là hàng loạt những nghiên cứu, sản xuất và sử dụng kháng sinh phát triển mạnh do tác dụng hơn hẳn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn so với các thuốc kháng sinh khác. Giới y học định nghĩa : Kháng sinh là những chất tạo thành do chuyển hoá sinh học, có tác dụ ng ngăn cản sự tồn tại hoặc phát triển của vi khuẩn ở nồng độ thấp, được sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các kháng sinh tự nhiên. 1.1.2 Phân loại Kháng sinh phân lọai dựa vào cấu tạo hoá học gồm các nhóm sau: - Kháng sinh β-lactam - Kháng sinh Aminoglycosid - Kháng sinh Tetracylin - Cloramphenicol và dẫn xuất - Kháng sinh Macrolid - Kháng sinh Lincosamid - Kháng sinh polypeptide - Các kháng sinh khác: Rifamycin 1.1.3 Đánh giá tác dụ ng - Theo đơn vị tác dụng (IU): Thường dùng cho các sản phẩm kháng sinh thiên nhiên, không nguyên chất. - Theo khối lượng chất chuẩn (g, mg,…) : Thường dùng cho các chế phẩm kháng sinh bán tổng hợp. 1.2 Kháng sinh β-lactam 1.2.1 Định nghĩa Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin. Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA). Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên. 1.2.2 Cấu trúc và phân loại * Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β-Lactam N S CH 3 CH 3 N H O CO R COOM 2 3 4 1 56 7 Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H. Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau. [...]... phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh β -lactam bằng phương pháp HPLC Theo [34], Blanchflower WJ và cộng... với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này 1.3.2 Phương pháp điện hóa Một số phương pháp. .. tạp như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ Do đó việc kết hợp phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và kỹ thuật chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu đạt độ tối ưu cao trong việc phân tích β -lactam do có độ nhạy, độ chính xác và độ lặp... cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh… Theo [23], F Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M Kết quả tạo ra phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện... đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 1.3.1 Phương pháp quang học Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học. .. chất nội chuẩn Mẫu huyết tương được chiết với Acetonitril là phương pháp có giới hạn định lượng 12 ng/ml Mẫu thận được đồng nhất trong nước và Acetonitril sau đó được làm sạch trên cột chiết pha rắn C18 Giới hạn định lượng của phương pháp này là 10 ng/ml Nước tiểu được pha loãng, lọc và phân tích trực tiếp Giới hạn định lượng của phương pháp phân tích này là 63 ng/ml Độ chính xác cho mẫu huyết tương... tương đối không lớn hơn 2.2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu Attila Gaspar và cộng sự [17] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE) Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8 Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin,... PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thận, thịt và sữa, độ thu hồi đạt 89-117% Khi tách và làm giàu các β -lactam trong mẫu phân tích bằng kỹ thuật SPE thì thường dùng theo hai phương pháp chiết pha đảo (thường là C18) và trao đổi ion dựa trên đặc tính kém phân cực và chứa đồng thời nhóm axit, amin hữu cơ K Takeba và cộng sự sử dụng cột chiết pha rắn pha đảo C18 và dung môi rửa giải là MeOH để tách... cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa Điều kiện chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN – (C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg J.M Cha và cộng sự [26] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích βlactam trong nước sông và nước thải... CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu Hiện nay, các chỉ tiêu về chất lượng, dư lượng các chất độc hại là một vấn đề cấp thiết đang được quan tâm Trong đó chỉ tiêu về dư lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu sinh học là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng Như chúng tôi đã đề cập trong bản luận văn này, . 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Như Hoa PHÂN TÍCH BETA-LACTAM TRONG MẪU DƯỢC PHẨM VÀ SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC . tế và cứu đươc nhiều sinh mạng. 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 1.3.1. Phương pháp quang học Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học. KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Như Hoa Phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng