ĐA ̣ I HO ̣ C QUÔ ́ C GIA HA ̀ NÔ ̣ I TRƢƠ ̀ NG ĐA ̣ I HO ̣ C KHOA HO ̣ C TƢ ̣ NHIÊN BÙI MINH THÁI NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LUÂ ̣ N VĂN THA ̣ C SI ̃ KHOA HO ̣ C HÀ NỘI – 2011 ĐA ̣ I HO ̣ C QUÔ ́ C GIA HÀ NỘI TRƢƠ ̀ NG ĐA ̣ I HO ̣ C KHOA HO ̣ C TƢ ̣ NHIÊN Bùi Minh Thái NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ Chuyên nga ̀ nh: Hóa Phân Tích M số: 60 44 29 LUÂ ̣ N VĂN THA ̣ C SI ̃ KHOA HO ̣ C NGƢỜI HƢỚNG DN KHOA HC: PGS.TS. Nguyễn Văn Ri HÀ NỘI – 2011 MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU ………………………………………………………………… 1 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ………………………………………………. 2 1.1. Giới thiệu chung về sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)……… 2 1.1.1. Cấu trúc phân tử ………………………………………………… 2 1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của các Sulfamit, Metronidazole …………. 2 1.1.3. Tính chất dược lý và phổ tác dụng của Sulfamit, Metronidazole 4 1.1.4. Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, Metronidazole 4 1.1.5. Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu ……… ……………… 7 1.2. Phƣơng pháp xác định………………………………………………. 9 1.2.1. Một số công trình nghiên cứu xác định Sas bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) …………………………………………… 9 1.2.2. Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ……………………………………. 13 1.2.3. Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ………. 14 Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… 16 2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu………………… 16 2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu ………………………………… 16 2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu …………………………………………… 16 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………… 17 2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC ……. 17 2.2.2. Phân tích định lượng bằng HPLC ………………………… 19 2.3. Giới thiệu chung về phƣơng pháp chiết pha rắn ….…………. 20 2.4. Hóa chất và dụng cụ…………………………………………… 21 2.4.1. Hoá chất ………………………………………………… 21 2.4.2. Dụng cụ ……………………………………………………… 22 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………. 23 3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký ………………………………………. 23 3.1.1. Chọn bước sóng của detector …………………………………… 23 3.1.2. Thăm dò khả năng tách của các Sulfamit trên cột RP-C18 ………. 26 3.2. Chọn pha tĩnh …………………………………………………… 28 3.3. Tối ƣu hóa pha động ………………………………………………… 28 3.3.1. Nồng độ đệm axetat của pha động ……………………………… 28 3.3.2. Độ pH cho dung dịch đệm axetat …………………………………. 30 3.3.3. Tỉ lệ thành phần pha động ……………………………………… 33 3.3.4. Tốc độ pha động 35 3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ………………………………… 38 3.4.1. Khảo sát lập đường chuẩn trong khoảng nồng độ 0,05 – 1,000ppm 38 3.4.2. Giới hạn phát hiện (LOD); Giới hạn định lượng (LOQ) 42 3.4.3. Độ đúng, độ lặp lại của phép đo …………………………………. 44 3.5. Mẫu thực, quy trình xử lý và kết quả phân tích ………………… 48 3.5.1. Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi ………………… 48 3.5.2. Phân tích mẫu thực ……………………………………………………… 51 KẾT LUẬN ………………………………………………………………. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 1 ACN Acetonitrin Axetonitrin 2 BNNPTNT Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn 3 CV Coeficient Variation Hệ số biến thiên 4 HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao 5 RP Reversed phase Hấp phụ pha đảo 6 LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện 7 LOQ Limit of Quantity Giới hạn định lượng 8 TT Thông tư 9 UV - Vis Untraviolet - Visibet Tử ngoại – Khả kiến DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1: Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng detector………………… 25 Bảng 3.2: Thời gian lưu và thứ tự ra pic của các chất phân tích……………… 27 Bảng 3.3: Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat của pha động…………… 29 Bảng 3.4: Hệ số dung tích ở các giá trị pH khác nhau…………………………. 31 Bảng 3.5: Hệ số dung tích phụ thuộc vào %ACN trong pha động…………… 33-34 Bảng 3.6: Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động 36 Bảng 3.7: Diện tích pic sắc ký phụ thuộc vào nồng độ các chất phân tích……… 38-39 Bảng 3.8: Bảng giá trị các F tính của các chất phân tích 42 Bảng 3.9: LOD, LOQ tính theo phương trình hồi quy 43 Bảng 3.10: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 0,08ppm) 45 Bảng 3.11: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 0,4ppm) 46 Bảng 3.12: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 0,8ppm) 47-48 Bảng 3.13: Chiều cao píc sắc ký mẫu tôm ở các nồng độ thêm chuẩn khác nhau 50 Bảng 3.14: Kết quả xác định hiệu suất thu hồi các chất phân tích……………… 51 Bảng 3.15: Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm rảo……………………. 52 Bảng 3.16: Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tôm rảo………………… 53 Bảng 3.17: Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm chân trắng……………. 54 Bảng 3.18: Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tôm chân trắng………………. 54 Bảng 3.19: Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm sú…………………… 55 Bảng 3.20: Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tôm sú…………………… 55 Bảng 3.21: Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm lớt……………………. 56 Bảng 3.22: Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tôm lớt………………………. 57 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein………………… 5 Hình 2.1: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy đủ……………………………… 19 Hình 3.1: Phổ hấp thụ trong vùng tử ngoại khả kiến của các Sas…………… 23-24 Hình 3.2: Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng detector……………… 25 Hình 3.3: Thời gian lưu của các sulfamit…………………………………… 26-27 Hình 3.4: Sự phụ thuộc của k’ vào nồng độ đệm axetat trong pha động…… 29 Hình 3.5: Píc sắc ký ở các giá trị nồng độ đệm khác nhau 29-30 Hình 3.6: Sự phụ thuộc của K’ vào pH của pha động 31 Hình 3.7: Sắc đồ sắc ký ở pH khác nhau 32 Hình 3.8: Sự phụ thuộc k’ vào tỉ lệ % ACN trong pha động 34 Hình 3.9: Sắc đồ píc sắc ký tại các tỉ lệ thành phần pha động khác nhau 34-35 Hình 3.10: Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động 36 Hình 3.11: Sắc đồ tốc độ khác nhau của pha động 37 Hình 3.12: Đường chuẩn của chất phân tích trong khoảng nồng độ 0,05-1,00ppm…. 39-40 Hình 3.13: Sắc đồ của các chất phân tích nồng độ khác nhau tại bước sóng 270nm… 40 Hình 3.14: Sắc đồ của các chất phân tích nồng độ khác nhau tại bước sóng 320nm… 41 Hình 3.15: Sắc đồ của 5 chất phân tích với nồng độ 0,01ppm………………… 43 Hình 3.16: Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,08ppm …. 45 Hình 3.17: Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,4ppm …… 47 Hình 3.18: Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,8ppm …… 48 Hình 3.19: Sơ đồ xử lý mẫu Tôm 49 Hình 3.20: Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu tôm 50 Hình 3.21: Đường chuẩn SGU trong mẫu tôm rảo khi phân tích thêm chuẩn…. 53 Hình 3.22: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong mẫu tôm rảo……… 53 Hình 3.23: Đường chuẩn SGU trong mẫu tôm chân trắng khi phân tích thêm chuẩn 54 Hình 3.24: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong mẫu tôm chân trắng 54 Hình 3.25: Đường chuẩn của SGU, SMP trong mẫu tôm sú khi phân tích thêm chuẩn 55 Hình 3.26: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU, SMP trong tôm sú………. 56 Hình 3.27: Đường chuẩn SGU trong mẫu tôm lớt khi phân tích thêm chuẩn… 57 Hình 3.28: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong tôm lớt……………. 57 MỞ ĐẦU Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ngại của hầu hết các cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới. Một số loại kháng sinh thông thường (chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) bản thân nó có thể gây ra tác động có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, một số loại khác như các kháng sinh nhóm nitrofurans qua quá trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh ra những hợp chất có độc tính cao đối với cơ thể sống. Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit (SAs) là nhóm kháng khuẩn có hoạt phổ rộng, được sử dụng nhiều trong trong nuôi trồng, chế biến nông thủy sản, v.v Việc sử dụng chất này một cách tùy tiện có thể dẫn đến tồn dư một lượng lớn quá giới hạn cho phép trong cơ thể động vật. Khi người tiêu dùng sử dụng thực phẩm có dư lượng lớn sulfamit hay các chất kháng sinh trong thời gian dài gây ra một loạt các phản ứng như rối loạn đường tiết niệu, rối loạn tạo máu, rối loạn chuyển hóa porphyrin. Cho nên việc xác định chính xác lượng các sulfamit, các chất kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và lượng tồn dư trong sản phẩm từ động vật là rất quan trọng. Dựa trên thực tế đó, trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit như sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis, phương pháp này có độ chọn lọc, độ nhạy tốt và được trang bị ở nhiều cơ sở kiểm nghiệm của nước ta, có tính khả thi và ứng dụng vào thực tế cao. Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.2. Giới thiệu chung về sulfamit (SAs), metronidazole(MTD) 1.1.1. Cấu trúc phân tử [3,6] Họ SAs có cấu trúc phân tử tổng quát: R 2 N SO 2 NH R 1 Khi thay thế các nhóm R 1 , R 2 bằng các gốc khác nhau, chúng ta có các SAs khác nhau.Vì thế có cả một họ SAs. Khi R 2 = H thì sulfamit mới có hoạt tính kháng khuẩn. Khi R 2 # H, thì chất đó là tiền thuốc. R 1 có thể là mạch thẳng, dị vòng. Tuy nhiên nếu R 1 là dị vòng thì hiệu lực kháng khuẩn mạnh hơn, thông thường các dị vòng 2-3 dị tố. Cấu trúc Metronidazole(MTD): Là một thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt đối với vi khuẩn kỵ khí và động vật nguyên sinh. MTD là một trong những thành phần có mặt trong thức ăn chăn nuôi, thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản (với tên thương mại là Enro DC). 1.1.3. Tính chất vật lý và hoá học của các Sulfamit, Metronidazole [3] 1.1.2.1. Tính chất vật lý SAs ở dạng tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt, không mùi, thường ít tan trong nước, tan trong dung dịch axít, tan trong dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin). [...]... trình phân tích và ứng dụng quy trình nghiên cứu để phân tích một số mẫu tôm 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu Trong luận văn này đối tượng phân tích là các mẫu tôm, có thành phần nền rất phức tạp Vì vậy chúng tôi chọn phương pháp HPLC (High Performance Liquid Chromatograghy - Sắc ký lỏng hiệu nâng cao) để khảo sát các điều kiện tách và định lượng các chất 2.6.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp HPLC... tôi lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp HPLC hấp phụ pha ngược, detector ghép nối là detector UV-Vis 2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu Với mục tiêu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu tách và xác định đồng thời các Sas, MTD bằng HPLC sử dụng cột chiết pha ngược dùng detector UVVis Vì vậy để xây dựng được một quy trình phân tích tốt, chúng tôi đã nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề... đề xuất và các điều kiện phản ứng đã được tối ưu hóa Các giới hạn phát hiện cho các hợp chất sulfamit đã được cải thiện rất nhiều sau khi bước dẫn xuất hoá Dư lượng sulfamit trong mô động vật được chiết bằng acetonitrile và tinh chế bằng cách chiết pha rắn với C18 Phương pháp này có độ nhạy cao và lặp lại tốt và hiệu suất thu hồi trung bình trên 70% Các giới hạn phát hiện cho hầu hết các sulfamit có... tĩnh là các chất phân cực đã được silan hoá bề mặt tạo thành các vật liệu nhồi kém phân cực Pha động trong hệ này là các dung môi phân cực Khác với hệ pha thường dùng cho các chất không phân cực hay ít phân cực, hệ này có thể phân tích nhiều loại chất với độ phân cực khác nhau Do các ưu điểm như xác định được nhiều loại chất, hiệu quả tách tốt, dung môi ít tốn kém hơn NP – HPLC nên ngày nay sắc ký lỏng... = f(C) Sử dụng các quan hệ đó có thể xác định nồng độ chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hay phương pháp thêm chuẩn Dùng phương pháp đường chuẩn thì nhanh, đơn giản Còn khi thành phần mẫu phức tạp, lượng chất cần xác định nhỏ thì người ta dùng phương pháp thêm chuẩn Đối với các pic tách rời nhau hoàn toàn thì biểu diễn mối tương quan của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích cho kết quả... tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ sấy, máy sinh khí nitơ, cột chiết pha rắn, và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát các điều kiện sắc ký 3.1.1 Chọn bƣớc sóng của detector Phương pháp nghiên cứu được lựa chọn là HPLC ghép nối detector UV – Vis Việc đo để phát hiện các chất phân tích hay hợp chất của nó vẫn dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất... tín hiệu phân tích thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) để định lượng các chất Thông thường trong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều cao pic hoặc diện tích H = k.Cb S = k.Cb Trong đó: H - chiều cao pic sắc ký của chất S - diện tích pic sắc ký của chất k - hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký b - hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng:... tác theo cơ chế rây phân tử  Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau:  Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP - HPLC và hấp phụ pha ngược RP HPLC)  Sắc ký trao đổi ion (EX - HPLC)  Sắc ký rây phân tử (Gel - HPLC) Đối với hệ NP - HPLC, pha tĩnh là các chất phân cực, pha động là dung môi không và kém phân cực Ngược lại trong hệ RP - HPLC, pha tĩnh kém phân cực, thông thường... pháp chiết pha rắn [9] Khi lượng chất phân tích có trong mẫu quá nhỏ, bước làm giàu chất phân tích qua cột chiết pha rắn là rất cần thiết Hơn nữa, mẫu thực phẩm là loại mẫu có nền rất phức tạp, ngoài chất phân tích còn có rất nhiều các chất béo khác nên cần phải chiết pha rắn để lấy các chất phân tích một cách định lượng từ dung dịch, loại tạp chất và thu hồi toàn bộ nó Sau khi làm sạch chất phân tích. .. v.v 1.2 Phƣơng pháp xác định 1.2.1 Một số công trình nghiên cứu xác định Sas bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là các lĩnh vực của hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có . KHOA HO ̣ C TƢ ̣ NHIÊN Bùi Minh Thái NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ Chuyên nga ̀ nh: Hóa Phân Tích M số: 60 44 29 LUÂ ̣ N VĂN THA ̣ C SI ̃ . trình nghiên cứu xác định Sas bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) …………………………………………… 9 1.2.2. Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng. ĐA ̣ I HO ̣ C KHOA HO ̣ C TƢ ̣ NHIÊN BÙI MINH THÁI NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LUÂ ̣ N VĂN THA ̣ C SI ̃ KHOA HO ̣ C HÀ