ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Thu Trang NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở LÚA VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÃ TUẤN NGHĨA Hà Nội – Năm 2011 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Lê Thị Thu Trang iii ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN MỤC LỤC Lời cam đoan i Mục lục ii Danh mục bảng v Danh mục hình minh họa vi Danh mục chữ viết tắt vii MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Sự hình thành và đặc tính của đất mặn 4 1.2. Giới thiệu chung về đặc điểm vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam 5 1.2.1. Đồng bằng sông Cửu Long 6 1.2.2. Đồng bằng Sông Hồng 6 1.3. Cơ sở di truyền tính chịu mặn ở lúa 7 1.3.1. Cơ chế chịu mặn của cây lúa 7 1.3.2. Di truyền tính chịu mặn 10 1.4. Công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn 11 1.4.1. Phương pháp truyền thống 11 1.4.2. Áp dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống lúa chịu mặn 12 1.5. Đa dạng di truyền 14 1.6. Chỉ thị trong đánh giá đa dạng di truyền 15 1.6.1. Chỉ thị hình thái 16 1.6.2. Chỉ thị hoá sinh 17 1.6.3. Chỉ thị phân tử ADN 18 1.7. Thành tựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa 28 1.7.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hình thái 28 1.7.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hoá sinh 29 1.7.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị ADN 30 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Lê Thị Thu Trang iv ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN 2.1. Vật liệu 33 2.2. Phương pháp nghiên cứu 38 2.2.1. Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa 38 2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa 40 2.2.3. Nhận dạng di truyền các giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR 41 2.2.4. Phân tích số liệu 43 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. Kết quả đánh giá tính chịu mặn của các giống/dòng lúa 44 3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm 44 3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong điều kiện nhà lưới 54 3.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số 60 3.3. Kết quả phản ứng PCR và phân tích đa hình trên gel polyacrylamide 61 3.4. Quan hệ di truyền liên quan đến tính chịu mặn của các giống/dòng lúa 73 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 PHỤ LỤC 93 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Lê Thị Thu Trang v ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN Danh mục bảng Bảng 2.1: Bảng 2.2: Bảng 2.3: Bảng 2.4: Bảng 2.5: Bảng 3.1: Bảng 3.2: Bảng 3.3: Bảng 3.4: Bảng 3.5: Bảng 3.6: Danh sách 40 mẫu giống/dòng lúa trong nghiên cứu…… Danh sách các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu……… Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trưởng và phát triển (IRRI,1997)…………………………………………… Thành phần phản ứng SSR- PCR……………………………. Thành phần gel polyacrylamide 8% Các chỉ tiêu theo dõi xử lý mặn 40 giống/dòng lúa nghiên cứu trong dung dịch Yoshida có NaCl với EC=6dS/m, EC= 16dS/m………………………………………………………. Kết quả đánh giá cấp điểm chống chịu mặn của các giống/dòng lúa nghiên cứu (EC = 6dS/m và EC = 16dS/m). Tỷ lệ sống sót của các giống/dòng lúa nghiên cứu trồng trong đất với EC=6dS/m, EC=12dS/m………………………… … Kết quả đánh giá cấp điểm chống chịu mặn của các giống/dòng lúa nghiên cứu (EC = 6dS/m và EC = 12dS/m)… Tần số alen của 20 locut SSR………………………………… Đa hình các locut SSR ở các giống lúa nghiên cứu………… Trang 34 36 40 42 43 47 51 56 58 70 72 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Lê Thị Thu Trang vi ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN Danh mục hình Hình 1.1: Hình 1.2: Hình 1.3: Hình 1.4: Hình 3.1: Hình 3.2: Hình 3.3: Hình 3.4: Hình 3.5: Hình 3.6: Hình 3.7: Hình 3.8: Hình 3.9: Hình3.10: Hình 3.11: Hình 3.12: Hình ảnh lúa ngập mặn……………………………………… Các cơ chế chịu mặn ưu thế ở lúa…………………………… Nguyên lý phản ứng PCR…………………………………… Đa hình ADN SSR giữa hai cá thể có motif (AT) n…………………… Thí nghiệm thanh lọc mặn các giống/dòng lúa nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm… ………… Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % mức chống chịu mặn của 40 giống/dòng lúa nghiên cứu trong dung dịch Yoshida có NaCl với E=6dS/m và EC=16dS/m…………………………… Thí nghiệm xử lý mặn các giống/dòng lúa trồng trong đất……. Biểu đồ biểu diễn % tỷ lệ sống sót của các giống/dòng lúa nghiên cứu trồng trong đất có NaCl với EC=6dS/m, EC=12dS/m………………… Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % mức chống chịu mặn của 40 giống/dòng lúa nghiên cứu trồng trong đất có NaCl với EC=6dS/m và EC=12dS/m……………………………………. Kết quả tách chiết ADN tổng số lúa…………………………… Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM339………………………………………………… Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM261…………………………………………………. Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM140………………………………………………… Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM201………………………………………….………. Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM202 ……………………………………………… Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ Trang 5 8 19 25 44 53 54 55 60 61 61 61 62 62 62 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Lê Thị Thu Trang vii ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN Hình 3.13: Hình 3.14: Hình 3.15: Hình 3.16: Hình 3.17: Hình 3.18: Hình 3.19: Hình 3.20: Hình 3.21: Hình 3.22: Hình 3.23: Hình 3.24: Hình 3.25: thịSSR- RM206…………………………………………………. Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR-RM208……………………………………………………. Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR-RM214……………………………………………………. Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR-RM3412…………………………………………………… Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM518………………………………………………… Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR-RM231………………………………………………… Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR-RM237………………………………………………… Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR-RM493…………………………………………………… Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR-RM1233………………………………………………… Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR-RM5963………………………………………………… Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR-RM10745…………………………………… Biến động kích thước của các alen tại locut SSR khảo sát……. Kết quả phản ứng PCR của 40 giống/dòng lúa với 20 cặp mồi SSR……………………………………………………………. Sơ đồ cây phân loại 40 giống/dòng lúa bằng phương pháp UPGMA……………………………………………………… 63 63 63 64 64 64 65 65 65 66 66 67 68 75 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Lê Thị Thu Trang viii ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN Bảng chữ viết tắt AFLP APS AP- PCR CAPs Cs CSGE CTAB DAF DNA dNTPs EDTA EST EthBr ISSR MAS PCR PIC RAPD RFLP SNP SSR STMS STS TAE TEMED VNTR Amplification Fragment Length Polymorphism Amonium persulfate Arbitrary Primed polymerase Chain Reaction Cleaved Amplification Polymorphism Sequence Cộng sự Conformation Sensitive Gel Electrophoresis Cetyl trimethylammonium bromide DNA Amplification Fringerprinting Deoxyribonucleic acid Deoxy nucleotide triphosphates Ethylenediaminetetraacetic acid Expressed sequence tag Ethidium bromide Inter-simple sequence repeat Molecular Assisted Selection Polymerase Chain Reaction Polymorphism Information Content Random Aplification Polymorhism DNA Restriction Fragment length Polymorphism Single Nucleotide Polymorphism Simple sequence repeat Sequence-tagged microsatellite site marker Sequence- tagged site Tris-Acetic acid- EDTA N,N,N’,N’- Tetraethyl methylendiamine Variable Number of Tandem Repeat Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Lê Thị Thu Trang 1 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN MỞ ĐẦU Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực chiếm vị trí quan trọng hàng đầu ở nhiều nước trên thế giới và là cây trồng chủ đạo trong nền nông nghiệp Việt Nam [7,8]. Tuy nhiên, cây lúa lại là cây trồng nhạy cảm với độ mặn. Năng suất lúa tại nhiều khu vực trồng lúa đang giảm dần do mặn làm tổn hại mà trong đó nước mặn xâm thực vào nước tưới và đất trồng lúa là một trong những nguyên nhân quan trọng. Ước tính diện tích đất bị nhiễm mặn trên toàn thế giới lên tới 1 tỷ ha. Chỉ riêng Châu Á khoảng 21,5 triệu ha đất bị nhiễm mặn (Flower và Yeo, 1995). Ở Việt Nam diện tích đất canh tác ngập mặn khoảng 200.000ha [1]. Mặt khác do tập quán và nhu cầu mở rộng canh tác đổi mới ngành nghề như nuôi trồng thuỷ sản vô tình làm tăng thêm diện tích đất ngập mặn cũng như độ mặn tăng lên khoảng từ 0,3-0,4% thậm chí còn cao hơn cả chục lần [14]. Hơn nữa, nghề trồng lúa ở vùng nhiễm mặn đang phải đối mặn với sự tác động của biến đổi khí hậu. Theo báo cáo về Chỉ số rủi ro khí hậu toàn cầu năm 2010 do tổ chức Germanwatch công bố tại Đan Mạch thì Việt Nam là một trong 10 quốc gia bị thiệt hại nhiều nhất do biến đổi khí hậu gây ra, các quốc gia khác đó là: Bangladesh, Myama, Honduras, Nicaragoa, Haiti, Ấn Độ, Cộng hoà Đôminica, Philippines và Trung Quốc. Theo kết quả nghiên cứu và dự báo của Uỷ ban liên chính phủ về biến đổi khí hậu của Liên hiệp quốc (IPPC) và Ngân hàng thế giới thì trong vòng 100 năm tới, nước biển sẽ dâng 1m, nhiệt độ sẽ tăng thêm 2 độ C. Nếu nước biển dâng cao 1m thì vùng đồng bằng sông Cửu Long sẽ có 1,5- 2 triệu ha đất nông nghiệp bị ngập nước, còn ở vùng đồng bằng sông Hồng sẽ có 1668 km 2 đất bị ngập, trong đó có khoảng 0,3- 0,5 triệu ha đất chủ yếu là đất lúa bị ngập. Trước những biến đổi nghiêm trọng đó, trồng các giống lúa chống chịu tốt với mức nhiễm mặn cao sẽ là giải pháp để khắc phục các hiện tượng trên. Các biện pháp như xây dựng công trình thuỷ lợi bao đê ngăn chặn hay bón các loại phân hữu cơ vào đất (bón vôi, thạch cao để cải thiện cấu trúc đất, cày sâu cải thiện tính thoát nước tốt nhằm giảm đóng váng trên mặt đất) thường tốn kém và hiệu quả không cao Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Lê Thị Thu Trang 2 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN [31]. Tuy nhiên phần lớn các giống lúa có khả năng chịu tốt thì năng suất lại thấp, tính thích nghi kém. Do đó, hướng lai tạo tập trung vào chuyển gen chống chịu mặn ở giống lúa chịu mặn tốt và một số giống lúa mang đặc tính ưu việt về năng suất, chất lượng đang được phát triển. Thông thường phải mất đến 3-4 năm lai tạo để chuyển gen. Ngoài ra, một khó khăn thường gặp trong lai tạo giống mới là đôi khi có mối liên hệ khá chặt chẽ giữa tính trạng chống chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn thường được lai chuyển vào các con lai cùng một lúc. Các gen điều khiển tính trạng mong muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai. Do đó lai tạo tính trạng chống chịu mặn có thể kéo dài đến 10- 15 năm để phát triển một giống lúa mới [29]. Vì vậy, phương pháp lai tạo truyền thống thường khó, mất nhiều thời gian và không hiệu quả. Ngày nay, nhờ tiến bộ của công nghệ sinh học nên công tác chọn tạo giống đã trở lên hiệu quả hơn. Trong đó, ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, SSR, RFLP, AFLP được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa dạng di truyền và xác định được sự khác biệt về mặt di truyền của quần thể giống khởi đầu, từ đó xác định các cặp lai có khoảng cách di truyền phù hợp có thể cho ưu thế lai cao nhất. Việc tiếp cận ở mức độ phân tử cho phép đánh giá các giống bố mẹ một cách chính xác, không bị tác động bởi điều kiện ngoại cảnh, rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả công tác lai tạo. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa Việt Nam” với mục tiêu chính là xây dựng cơ sở dữ liệu ADN và tính chịu mặn của các giống/dòng lúa nghiên cứu nh ằm góp phần quan trọng cho việc khai thác nguồn gen chịu mặn và định hướng cho chọn tạo giống lúa chịu mặn ở Vi ệt Nam. Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã tiến hành những nội dung nghiên cứu sau: 1. Đánh giá khả năng chịu mặn của các mẫu giống/dòng lúa nghiên cứu. 2. Nhận dạng di truyền các mẫu giống/dòng lúa nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử SSR. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Lê Thị Thu Trang 3 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN 3. Phân tích, đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR. Kết quả của đề tài góp phần tạo cơ sở khoa học để xây dựng phương pháp đánh giá đa dạng di truyền và phân loại nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở các giống/dòng lúa, hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn mới có năng suất cao, chất lượng tốt. [...]... tiêu chọn lọc giống lúa chịu mặn Lê Thị Thu Trang 9 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học 1.3.2 Di truyền tính chịu mặn Nghiên cứu di truyền về tính kháng mặn ở lúa cho thấy rằng nó được điều khiển bởi nhiều gen và muốn chọn tạo giống lúa chịu mặn có hiệu quả, cần phải nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền nhằm xác định rõ các gen điều khiển tính chịu mặn, từ đó giúp chúng... trồng lúa ở Việt Nam Những năm gần đây, xu hướng chuyển đổi từ trồng lúa sang nuôi tôm nước lợ nhiễm mặn ở các tỉnh ven biển đã làm cho một số vùng lúa lân cận trở nên bị nhiễm mặn, gây ảnh hưởng xấu đến sản lượng lúa 1.3 Cơ sở di truyền tính chịu mặn ở lúa 1.3.1 Cơ chế chịu mặn của cây lúa Lúa là cây lương thực thích hợp nhất trên đất mặn, dù nó luôn được đánh giá là nhiễm mặn trung bình với mặn Vì... nhóm gen cộng tính và hệ số di truyền tính chống chịu của tính trạng này rất thấp [80] Ở giai đoạn trưởng thành, tính trạng chiều cao cây, năng suất của lúa trong điều kiện mặn được điều khiển bởi nhóm gen cộng tính [57] Khi phân tích di truyền số lượng về tính trạng chống chịu mặn được thông qua hàm lượng Na+, K+; tỷ lệ Na+/K+ và điểm chống chịu mặn cho thấy nó được kiểm soát bởi 2 nhóm gen cộng tính. .. động canh tác như thay thế giống truyền thống bằng giống lúa lai làm mất dần đi nguồn gen hoang dại (có thể mang những tính trạng quý chưa biết đến) là nguồn vật liệu quý cho công tác chọn tạo giống; cao hơn nữa làm mất đi sự đa dạng di truyền của cây lúa và có thể ảnh hưởng đến đa dạng sinh học Chính vì vậy, nghiên cứu đa dạng di truyền lúa nhằm bảo tồn các giống lúa đặc sản và hỗ trợ công tác chọn... trong cùng một loài Mặc dù là cấp độ thấp nhất, nhưng đa dạng di truyền lại có vai trò vô cùng quan trọng trong tiến hoá và thích nghi của các sinh vật, mọi biến động ở cấp độ đa dạng di truyền đều có tác động đến những cấp độ cao hơn và cuối cùng là ảnh hưởng đến đa dạng sinh học [76] Đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở nguồn gen và kiểu gen trong mỗi loài Mỗi loài có một bản đồ nhiễm sắc thể... thị rất phù hợp cho nghiên cứu đa dạng di truyền và đa dạng quần thể bởi có số lượng lớn (mỗi 1000bp hệ gen có một SNP) và có thể áp dụng các phương pháp tự động trong phát hiện và phân tích [69] SNP được áp dụng phổ biến trong nghiwn cứu di truyền học ở người (trong chuẩn đoán bệnh và nghiên cứu đáp ứng thuốc) Đến nay, SNP đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền thực vật [69]... trong đánh giá đa dạng di truyền Chỉ thị di truyền là một thuộc tính hay một đặc điểm có thể đo đếm được và có khả năng di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Chỉ thị di truyền nhất thiết thiết phải đảm bảo hai tiêu chuẩn: (i) phải khác biệt giữa bố và mẹ, (ii) phải được truyền lại chính xác cho thế hệ sau [68] Các nhà di truyền và chọn giống luôn quan tâm đến chỉ thị di truyền vì tính ưu việt của nó... chỉ thị RM223 liên kết với gen chịu mặn với khoảng cách là 6.3cM trên nhiễm sắc thể số 8 RM223 nhân bản đoạn DNA kích thước 120bp, liên kết với gen chống chịu mặn, từ giống Đốc Phụng và sản phẩm PCR có kích thước 160bp từ giống nhiễm IR28 Hai chỉ thị OSR1 và RM315 liên kết với QTL chịu mặn ở lúa, định vị trên nhiễm sắc thể số 1 [63] 1.5 Đa dạng di truyền Đa dạng sinh học là vấn đề rất được quan tâm hiện... lúa chịu mặn, trong đó 15 giống/dòng lúa có khả năng chịu mặn cao và 10 giống/dòng lúa có khả năng chịu mặn trung bình đang được sử dụng trong công tác chọn lọc giống lúa chịu mặn [8] Bên cạnh đó Viện Di truyền Nông nghiệp đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một số giống lúa địa phương vùng đồng bằng ven biển Bắc bộ Kết quả gây đột biến nguồn Coban (Co60) đã chọn được các giống lúa. .. trên bông chịu tác động lớn bởi tác động của môi trường và 3 tính trạng này đóng góp phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trường mặn [61] Qua nhiều nghiên cứu di truyền phân tử tính kháng mặn, bản đồ QTL( Quantitative Trait Loci) /gen được xây dựng trên cơ sở chỉ thị AFLP và STS cho thấy, gen chủ lực điều khiển tính trạng chống chịu mặn định vị trên nhiễm sắc thể số 1 Bên cạnh gen chủ lực . trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa 28 1.7.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hình thái 28 1.7.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hoá sinh 29 1.7.3. Nghiên cứu đa. 1.3. Cơ sở di truyền tính chịu mặn ở lúa 7 1.3.1. Cơ chế chịu mặn của cây lúa 7 1.3.2. Di truyền tính chịu mặn 10 1.4. Công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn 11 1.4.1. Phương pháp truyền thống. HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Thu Trang NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở LÚA VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN