ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Lan Anh SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƢ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở NGƢỜI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Lan Anh SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƢ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở NGƢỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Di truyền ung thƣ 3 1.1.1. Khái niệm ung thƣ 3 1.1.2. Gen ung thƣ và gen ức chế khối u 3 1.2. Hội chứng ung thƣ ruột kết 5 1.3. Hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch) 6 1.3.1. Đặc điểm di truyền của HNPCC 7 1.3.2. Đặc điểm lâm sàng và phổ khối u 9 1.3.3. Chẩn đoán lâm sàng 10 1.4. Cơ sở phân tử của HNPCC 11 1.4.1. Tính bất ổn định vi vệ tinh 12 1.4.2. Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai (MMR - Mismatch Repair) 13 1.4.3. Đột biến gen MMR và nguy cơ ung thƣ 18 1.4.4. Gen MLH1 20 1.5. Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu HNPCC 23 1.5.1. Kỹ thuật PCR 23 1.5.2. Kỹ thuật PCR phiên mã ngƣợc (RT-PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) 24 1.5.3. Kỹ thuật phân tích các trình tự lăp lại đơn giản (SSR - Simple Sequence Repeat) 24 1.5.4. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism) 25 1.5.5. Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn (SSCP: Single Strand Conformation Polymorphism) 26 1.5.6. Phƣơng pháp giải trình tự ADN 28 1.6. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài 29 1.6.1. Mục tiêu nghiên cứu 29 1.6.2. Nội dung nghiên cứu của đề tài 29 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Vật liệu nghiên cứu 30 2.1.1. Đối tƣợng và địa điểm nghiên cứu 30 2.1.2. Hóa chất 30 2.1.3. Thiết bị 31 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu 31 2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số 31 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 Lê Thị Lan Anh Cao học K18 1 2.2.3. Xác định độ tinh sạch và hàm lƣợng ADN tổng số 33 2.2.4. Kỹ thuật PCR 34 2.2.5. Phân tích đa hình sợi đơn (SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism) 35 2.2.6. Phản ứng cắt bằng enzym giới hạn 37 2.2.7. Giải trình tự gen 37 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Tách chiết ADN tổng số 38 3.2. Phản ứng PCR 39 3.2.1. Kết quả tối ƣu phản ứng PCR 39 3.2.2. Nhân bản các exon quan tâm bằng kỹ thuật PCR 42 3.3. Kết quả phân tích SSCP 46 3.4. Kết quả phân tích đột biến bằng PCR – RFLP 51 3.4.1. Kết quả xử lý exon 16 bằng enzym MspI 51 3.4.2. Kết quả xử lý exon 19 bằng enzym CviQI 54 3.4.3. Kết quả xử lý exon 18 bằng enzym CviQI 56 3.5. Kết quả giải trình tự ADN và so sánh trình tự 59 3.5.1. Phân tích trình tự exon 13 của mẫu mô từ bệnh nhân số 6 59 3.5.2. Kết quả phân tích trình tự exon 14 từ mẫu T19 60 3.5.3. Phân tích trình tự exon 18 từ mẫu T20 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 I. KẾT LUẬN 65 II. KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Độ thâm nhập của các đột biến MLH1 và MSH2 trong các bệnh nhân ung thƣ Bảng 2. Thống kê các bệnh ung thƣ liên quan đến HNPCC Bảng 3. Các gen MMR liên quan tới HNPCC Bảng 4. Cấu trúc các gen MMR Bảng 5. Tỉ lệ các đột biến thƣờng gặp trong hai gen MLH1 và MSH2 ở các bệnh nhân HNPCC Bảng 6. Các thành phần phản ứng PCR Bảng 7. Trình tự mồi tƣơng ứng của các exon 8, 13, 14, 16, 17, 18, 19 của gen MLH1 Bảng 8. Thành phần PAGE 12% cho 10 ml dung dịch Bảng 9. Thành phần tham gia phản ứng cắt exon 16, 18 và 19 gen MLH1 Bảng 10. Chu trình nhiệt PCR tối ƣu của exon 8, 13, 14, 16, 17, 18 và 19 gen MLH1 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Các con đƣờng hình thành ung thƣ đại trực tràng Hình 2. Các phân nhóm chính của ung thƣ ruột kết Hình 3. Sửa chữa bắt cặp sai ở trình tự vi vệ tinh Hình 4. Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai ở E.coli Hình 5. Sửa chữa ADN bắt cặp sai ở ngƣời Hình 6. Con đƣờng dẫn đến ung thƣ di truyền ở ngƣời thông qua đột biến các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) Hình 7. Tỷ lệ các loại đột biến phát hiện ở gen MLH1, MSH2 và MSH6 Hình 8. Vị trí của MLH1 trong NST số 3 Hình 9. Sơ đồ gen MLH1 Hình 10. Sơ đồ các protein đƣợc mã hóa bởi MLH1 Hình 11. Kết quả phân tích SSCP exon 5 của gen AR Hình 12. (A) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu mô. (B) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu máu Hình 13. Sản phẩm PCR exon 8 gen MLH1 với các nhiệt độ gắn mồi: 60 0 C, 60,5 0 C, 61 0 C, 61,5 0 C Hình 14. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 8 gen MLH1 Hình 15. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 13 gen MLH1 Hình 16. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 14 gen MLH1 Hình 17. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 16 gen MLH1 Hình 18. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 17 gen MLH1 Hình 19. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 18 gen MLH1 Hình 20. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 19 gen MLH1 Hình 21. (A), (B) Kết quả phân tích SSCP exon 8 gen MLH1 Hình 22. (A), (B) Kết quả phân tích SSCP exon 13 gen MLH1 Hình 23. (A), (B) Kết quả phân tích SSCP exon 14 gen MLH1 Hình 24. Kết quả phân tích SSCP exon 16 gen MLH1 Hình 25. Kết quả phân tích SSCP exon 17 gen MLH1 Hình 26. Kết quả phân tích SSCP exon 18 gen MLH1 Hình 27. Kết quả phân tích SSCP exon 19 gen MLH1 Hình 28. Kết quả PCR-RFLP các mẫu máu từ 20 thành viên của gia đình mắc hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền ở Nhật Bản Hình 29. Dự đoán kết quả phản ứng cắt exon 16 gen MLH1 bằng enzym MspI Hình 30. Sản phẩm cắt exon 16 và sản phẩm PCR exon 16 điện di trên gel agarose 2% Hình 31. Dự đoán sản phẩm cắt exon 19 bằng enzym CviQI Hình 32. Sản phẩm cắt exon 19 bằng enzym CviQI điện di trên gel polyacrylamide 12% Hình 33. Dự đoán sản phẩm cắt exon 18 gen MLH1 bằng enzym CviQI Hình 34. (A), (B), (C), (D) Sản phẩm cắt exon 18 bằng enzym CviQI điện di trên gel polyacrylamide 12% Hình 35. (A) Kết quả so sánh trình tự exon 13 của đối chứng và bệnh nhân số 6. (B) Trình tự ngƣợc của exon 13 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay thế tại vị trí 203 G>A Hình 36. (A) Kết quả so sánh trình tự exon 14 của đối chứng và bệnh nhân số 19. (B) Trình tự xuôi của exon 14 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay thế tại vị trí 176C>G và một đột biến thay thế ở vị trí 185T>A. Hình 37. So sánh trình tự exon 18 từ mẫu mô ung thƣ của bệnh nhân 20 và mô ngƣời bình thƣờng Hình 38. Kết quả so sánh trình tự exon 18 từ mẫu máu và mẫu mô của bệnh nhân số 19 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ADN ARN RNase APS BLB bp dNTP EDTA FAP HNPCC Kb LOH MMR MSI NST PCR RFLP RT-PCR SNP SSCP SSR TLB TAE TE TEMED Deoxyribonucleic Acid Ribonucleic Acid Ribonuclease Ammonium persulphate Blood Lysis Buffer base pair Deoxyribonucleotide Triphosphate Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Familial Adenomatous Polyposis Hereditary Non – Polyposis Colorectal Cancer Kilobase Loss of Heterozygosity Mismatch Repair Microsatellite Instability Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism Reverse Transcription PCR Single Nucleotide Polymorphism Single Strand Conformation Polymorphism Simple Sequence Repeat Tissue Lysis Buffer Tris – Acetic acid – EDTA Tris – EDTA N,N,N’,N’- tetramethylenediamine Axit deoxyribonucleic Axit ribonucleic Ribonuclease Dung dịch đệm phân giải tế bào máu cặp bazơ nitơ Deoxyribonucleotit triphotphat Hội chứng u tuyến polyp theo dòng họ Ung thƣ ruột kết không polyp di truyền Kilobazơ Mất tính dị hợp tử Sửa chữa bắt cặp sai Tính bất ổn vi vệ tinh Nhiễm sắc thể Phản ứng chuỗi nhờ polymeraza Tính đa hình độ dài đoạn giới hạn PCR phiên mã ngƣợc Tính đa hình đơn nucleotit Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn Trình tự lặp lại đơn giản Dung dịch đệm phân giải tế bào mô Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 Lê Thị Lan Anh Cao học K18 1 MỞ ĐẦU Trong hơn 20 năm qua, những phát minh to lớn của di truyền học phân tử đã góp phần thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học. Các kỹ thuật mới nhƣ tách dòng gen, tạo ADN tái tổ hợp, giải trình tự gen và nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh, trong đó có bệnh ung thƣ. Sự phát hiện ung thƣ là một bệnh di truyền đƣợc coi là một thắng lợi của sinh y học hiện đại. Nhiều nỗ lực nghiên cứu không ngừng nghỉ và hiệu quả đã giúp xác định chi tiết các biến đổi di truyền là nhân tố trực tiếp gây ung thƣ, bắt đầu từ sự hình thành các khối u, sau đó là sự tăng sinh và lan rộng của chúng. Tỷ lệ mắc bệnh ung thƣ có xu hƣớng gia tăng ở phần lớn các nƣớc trên thế giới. Hiện tại, qua thống kê cho thấy trên toàn cầu có khoảng 22,4 triệu ngƣời đang sống chung với bệnh ung thƣ. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ƣớc tính hàng năm trên thế giới có khoảng 10,1 triệu trƣờng hợp mới mắc ung thƣ. Các ung thƣ hàng đầu trên thế giới ở nam giới là ung thƣ phổi, dạ dày, đại trực tràng, tiền liệt tuyến, gan; Ở nữ giới là ung thƣ vú, đại trực tràng, cổ tử cung, dạ dày và phổi. Cũng theo Tổ chức Y tế Thế giới, ƣớc tính mỗi năm có khoảng trên 6,7 triệu ngƣời chết do ung thƣ. Tỷ lệ chết do ung thƣ chiếm 12% trong số các nguyên nhân gây tử vong ở ngƣời [28]. Riêng tại Việt Nam, mỗi năm phát hiện mới khoảng 200.000 ngƣời và khoảng 75.000 ngƣời chết vì bệnh ung thƣ [47]. Trong số các bệnh ung thƣ thƣờng gặp ở ngƣời, ung thƣ đại trực tràng là loại ung thƣ tƣơng đối phổ biến, chiếm khoảng 11,5% tổng số các trƣờng hợp ung thƣ và chiếm tới 15,2% tổng số các trƣờng hợp tử vong vì ung thƣ. Loại ung thƣ này thƣờng gặp nhiều hơn ở các nƣớc phát triển và có xu hƣớng tăng nhanh ở các nƣớc đang phát triển. Nguy cơ ung thƣ đại trực tràng tăng cao hơn ở những Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 Lê Thị Lan Anh Cao học K18 2 ngƣời có tiền sử viêm đại tràng hoặc trong gia đình, dòng họ có ngƣời bị ung thƣ đại trực tràng [3]. Ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer), còn đƣợc gọi là hội chứng Lynch chiếm 15% các trƣờng hợp ung thƣ đại trực tràng. Đây là hội chứng di truyền trội do gen trên nhiễm sắc thể thƣờng gây ra. Những đột biến gây bất hoạt ở tế bào mầm của một trong các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) bao gồm gen MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, dẫn đến sự thay đổi hoạt tính protein, làm bất hoạt hệ thống sửa chữa bắt cặp sai là nguyên nhân gây HNPCC. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các đột biến trong gen MLH1 chiếm khoảng 50% trong số các đột biến xác định đƣợc ở các gen MMR [2, 5]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen MLH1 đƣợc thực hiện ở rất nhiều quần thể ngƣời khác nhau. Tại Việt Nam, xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán ung thƣ nói chung và ung thu đại trực tràng nói riêng hầu nhƣ chƣa đƣợc thực hiện. Việc phát hiện những biến đổi di truyền trong các gen MMR liên quan đến ung thƣ đại trực tràng có khuynh hƣớng di truyền, nhằm đƣa ra những kết quả nghiên cứu bƣớc đầu về gen MLH1 ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng tại Việt Nam góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và mở ra hƣớng nghiên cứu về các gen MMR khác, ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thƣ ruột kết không polyp di truyền tại Việt Nam là rất cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ ruột kết không polyp di truyền ở ngƣời Việt Nam”. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Phân tích di truyền thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Khoa Sinh học và Phòng Sinh học thụ thể và phát triển thuốc thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên. [...]... số 6 gen liên quan đến HNPCC So với các gen khác thuộc hệ thống sửa chữa bắt cặp sai MMR, khả năng đột biến xảy ra ở gen MLH1 gây nên hội chứng Lynch là tƣơng đối cao (50%) Theo thống kê, hiện nay đã phát hiện hơn 225 đột biến trong gen MLH1 ở các bệnh nhân HNPCC, kiểu đột biến chủ yếu đƣợc tìm thấy là các đột biến thay thế (đột biến vô nghĩa, đột biến sai nghĩa, đột biến dịch khung) hoặc các đột biến. .. điểm di truyền của HNPCC HNPCC là một hội chứng di truyền trội trên nhiễm sắc thể thƣờng, gây nên bởi những đột biến dòng mầm gây bất hoạt ở những gen tham gia vào hệ thống sửa chữa bắt cặp sai (MMR): MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, trong đó chủ yếu là gen MLH1 và MSH2 [14] Đa số các đột biến ở gen MLH1 và MSH2 là đột biến vô nghĩa, nhầm nghĩa hoặc đột biến dịch khung cũng nhƣ các thay đổi ảnh hƣởng đến vị... ung thư ruột kết [11] Ung thƣ đại trực tràng di truyền lại đƣợc chia thành 3 nhóm chính: Sinh polyp u tuyến theo dòng họ (FAP), Ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hội chứng Lynch) và Hội chứng giống Lynch Hội chứng Lynch đƣợc lấy theo tên nhà khoa học đầu tiên công bố về căn bệnh này 1.3 Hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch) Ung thƣ ruột kết không polyp di truyền. .. của các gen này bao gồm đột biến dịch khung, đột biến vô nghĩa, nhầm nghĩa và trong trƣờng hợp của gen MLH1 và MSH2 Lê Thị Lan Anh 19 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 có thể liên quan đến mất các vùng mã hóa lớn (Hình 7) Hình 7 Tỷ lệ các loại đột biến phát hiện ở gen MLH1, MSH2 và MSH6 [14] Nhƣ vậy, gen MLH1 là gen quan trọng nhất trong nghiên cứu ung thƣ ruột kết không polyp di truyền. .. di truyền bởi những con đƣờng sửa chữa đột biến bị bất hoạt (Hình 6) [17] Hình 6 Con đường dẫn đến ung thư di truyền ở người thông qua đột biến các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) Tất cả các hệ thống sửa chữa ADN, bao gồm cả MMR gồm sự phối hợp hoạt Lê Thị Lan Anh 18 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 tính của nhiều protein Những đột biến gây bất hoạt ở tế bào mầm của một trong các gen: ... các gen ung thƣ ở các tế bào khối u là căn nguyên của phát sinh ung thƣ [17] 1.1.2 Gen ung thư và gen ức chế khối u Gen ung thƣ (oncogenes) có thể định nghĩa là dạng gen đột biến làm tăng nguy cơ ung thƣ hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thƣ Các gen ung thƣ cũng có thể đƣợc coi nhƣ các dạng alen đặc biệt của các gen bình thƣờng xuất hiện do kết quả của đột biến [3] Các cá thể đƣợc truyền các gen ung. .. và di truyền Trong đó, ung thƣ ruột kết rải rác (không di truyền) chiếm 65-85%, ung thƣ ruột kết gia đình chiếm tỉ lệ 10%-30% và ung thƣ đại trực tràng di truyền chiếm khoảng 5% trong tổng số các dạng ung thƣ ruột kết (Hình 2) Rải rác (không di truyền) rá truyề (65%–85%) 65%– Các hội chứng ung thư ruột hiếm gặp khác ( . Lê Thị Lan Anh SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƢ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở NGƢỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60. Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ ruột kết không polyp di truyền ở ngƣời Việt Nam . Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Phân tích di truyền thuộc Trung. 4. Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai ở E.coli Hình 5. Sửa chữa ADN bắt cặp sai ở ngƣời Hình 6. Con đƣờng dẫn đến ung thƣ di truyền ở ngƣời thông qua đột biến các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) Hình