i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ của các quý phòng ban trƣờng Đại học Nha Trang nói chung và Khoa Nuôi trồng thuỷ sản nói riêng; đặc biệt là sự hƣớng dẫn trực tiếp và tận tình của TS. Lê Minh Hoàng đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài này. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ này. Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến tất cả các thầy, cô giáo trong Khoa Nuôi trồng thuỷ sản – Trƣờng Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức cơ bản nhất làm cơ sở và nền tảng cho tôi thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2012 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thanh Thuỷ ii MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi TÓM TẮT vii MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá chép: 3 1.1.1. Hệ thống phân loại: 3 1.1.2. Phân bố: 3 1.1.3. Đặc điểm hình thái: 4 1.1.4. Đặc điểm sinh thái học 4 1.1.5. Đặc điểm sinh trƣởng 5 1.6.1. Tuổi và kích thƣớc thành thục: 5 1.6.2. Tập tính sinh sản: 5 1.6.3. Mùa vụ sinh sản: 6 1.6.4. Sức sinh sản: 6 1.6.5. Một số đặc điểm về tinh trùng cá: 6 1.2. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trong tủ lạnh 12 1.2.1. Trên thế giới: 12 1.3.2. Ở Việt Nam: 14 CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Địa điểm nghiên cứu: 15 2.2. Thời gian nghiên cứu: 15 2.3. Đối tƣợng nghiên cứu: 15 iii 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu: 15 2.4.1. Chọn cá đực và vuốt tinh: 16 2.4.2. Một số đặc điểm tinh dịch cá chép đƣa vào nghiên cứu: 17 2.4.3. Thí nghiệm ảnh hƣởng của chất bảo quản đến thời gian bảo quản trong tủ lạnh: 20 2.4.4. Thí nghiệm ảnh hƣởng của tỷ lệ pha loãng đến thời gian bảo quản tinh trùng trong tủ lạnh: 21 2.4.6. Thí nghiệm ảnh hƣởng của việc bổ sung kháng sinh đến thời gian bảo quản tinh trùng trong tủ lạnh: 21 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu: 21 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 3.1. Ảnh hƣởng của các chất bảo quản khác nhau lên thời gian bảo quản tinh trùng: 22 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ pha loãng đến thời gian bảo quản tinh trùng: 24 3.3. Ảnh hƣởng của việc bổ sung kháng sinh lên thời gian bảo quản tinh trùng: . 25 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 28 4.1. Kết luận: 28 4.2. Đề xuất ý kiến: 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1: Chiều dài và tốc độ tăng trƣởng của cá chép tại hạ lƣu sông Hồng [16] 5 Bảng 1.2: Thành phần tinh dịch của một số loài cá nƣớc ngọt 11 Bảng 2.1: Một số chỉ tiêu của cá chép đực đƣợc đƣa vào nghiên cứu 17 Bảng 2.2: Mật độ tinh trùng qua 3 đợt thí nghiệm 18 Bảng 2.3: Hoạt lực của tinh trùng cá chép đƣa vào thí nghiệm 19 Bảng 2.4: Thành phần của các chất bảo quản trong 100 ml nƣớc cất 20 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1.1: Hình dạng ngoài của Cá chép - Cyprinus carpio. 3 Hình 1.2: Cấu tạo tinh trùng cá [56] 7 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. CCSE (common carp sperm extender) 15 Hình 2.2: Vuốt tinh cá 16 Hình 2.3: Kiểm tra hoạt lực tinh trùng 20 Hình 3.1: Hoạt lực của tinh trùng (%) trong 5 chất bảo quản khác nhau 0,3 M glucose, 0,6 M sucrose, CCSE-1, CCSE-2 và CCSE-3 (Common Carp Solution Extender) đƣợc bảo quản ở 4 o C. Control: không pha loãng. 23 Hình 3.2. Hoạt lực của tinh trùng (%) với các tỷ lệ pha loãng khác nhau trong CCSE-2 bảo quản trong tủ lạnh ở 4 o C. Control: không pha loãng. 25 Hình 3.3. Hoạt lực của tinh trùng (%) bảo quản trong tủ lạnh ở 4 o C khi bổ sung kết hợp 25ppm penicillin + 25ppm streptomycin. Control: không pha loãng 27 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT M: mol. mM: mmol. CCSE: Common Carp Sperm Extender. GTTB: Giá trị trung bình. SD: Độ lệch chuẩn. ASTT: Áp suất thẩm thấu. ppm: Parts per million. TLTK: Tài liệu tham khảo. TT: Thứ tự. HSTT: Hệ số thành thục. s: Giây. vii TÓM TẮT Bảo quản tinh trùng cá trong tủ lạnh rất hữu ích cho nghiên cứu về gen và sinh sản nhân tạo cá. Mục đích của nghiên cứu này là tìm ra chất bảo quản, tỷ lệ pha loãng và kháng sinh tốt nhất cho bảo quản lạnh tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. Trong thí nghiệm về chất bảo quản, tinh trùng cá chép được bảo quản trong các chất bảo quản lần lượt là: 0,3 M glucose; 0,6 M sucrose, (common carp sperm extender) CCSE-1, CCSE-2 và CCSE-3. Thí nghiệm về tỷ lệ thì chất bảo quản được pha loãng ở các thang tỷ lệ 1:1, 1:3, 1:5 (tinh dịch: chất bảo quản). Trong trường hợp thí nghiệm về chất kháng sinh thì tinh trùng được pha loãng với tỷ lệ 1:3 với chất bảo quản CCSE-2 được bổ sung 25ppm peniciline và 25ppm streptomycine. Tất cả các thí nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 o C. Kết quả thu được từ các thí nghiệm cho thấy: điều kiện tốt nhất cho bảo quản lạnh tinh trùng cá chép trong tủ lạnh là bảo quản bằng chất bảo quản CCSE-2 ở tỷ lệ 1:3 ở nhiệt độ 4 o C trong đó tinh trùng có thể duy trì hoạt lực đến ngày thứ 17. Trong điều kiện bổ sung thêm kháng sinh thì hoạt lực tinh trùng có thể duy trì đến ngày thứ 29. Những kết quả này cho thấy rằng tinh trùng cá chép có thể bảo quản được trong tủ lạnh. Từ khoá: Cá chép, Cyprinus carpio, tinh trùng, bảo quản lạnh, chất bảo quản. 1 MỞ ĐẦU Cá Chép (Cyprinus carpio Linnaeus, 1758) là loài thuộc họ Cyprinidae - họ cá nƣớc ngọt lớn nhất [50] và đƣợc nuôi phổ biến trên toàn thế giới, sản lƣợng đạt 13% (3,4 triệu tấn) so với tổng sản lƣợng cá nƣớc ngọt toàn cầu [35]. Chúng thích nghi với các điều kiện và môi trƣờng sống khắc nghiệt do đó chúng phân bố rộng rãi trên toàn thế giới. Ngoài ra, cá chép có tốc độ tăng trƣởng nhanh, là loài có giá trị kinh tế, thịt cá thơm ngon nhất là sau mùa cá đƣợc vỗ béo nên đƣợc nhiều ngƣời nuôi và ngƣời tiêu dùng ƣa thích [29]. Đây là đối tƣợng nuôi quan trọng trong ao, hồ, đầm, ruộng, lồng bè. Cá có thể nuôi đơn hoặc nuôi ghép đều cho năng suất và hiệu quả rất cao. Chúng còn đƣợc nuôi để diệt ấu trùng muỗi, làm cá cảnh trong công nghệ di truyền màu sắc [29]. Tuy nhiên, hiện nay sản lƣợng cá chép tự nhiên đã và đang giảm sút hết sức nghiêm trọng do khai thác quá mức. Mặt khác do việc nhập giống, lai tạo cá ra các vùng nƣớc tự nhiên và lai tạp làm mất dần nguồn gen quý hiếm, bản địa của đàn cá chép Việt Nam. Do vậy việc lƣu giữ dòng thuần cá chép tại Việt Nam làm nguyên liệu cho chọn giống, lai tạo các thế hệ con lai kinh tế là hết sức cần thiết và mang ý nghĩa thực tiễn to lớn [14]. Một trong những phƣơng pháp giúp lƣu giữ dòng thuần cá nói riêng và các loài động vật thuỷ sản nói chung đó là bảo quản lạnh tinh trùng. Trong quá trình sản xuất giống nhân tạo, việc bảo quản lạnh tinh giúp cho quá trình thụ tinh đƣợc chủ động hơn, đơn giản trong việc vận chuyển cá bố mẹ từ nơi này đến nơi khác, phục vụ lai tạo giống mới, khắc phục khó khăn trong sản xuất nhân tạo một số loài cá do sự lệch pha giữa cá đực và cá cái đồng thời bảo vệ đƣợc nguồn gen. Ngoài ra, bảo quản lạnh tinh trùng còn có vai trò quan trọng trong việc hạn chế tối đa việc lƣu giữ cá đực, bảo tồn dòng thuần, hạn chế suy giảm do cận huyết trong quần đàn [53]. Bảo quản lạnh làm giảm hoạt động trao đổi chất của các tế bào tinh trùng và kéo dài thời gian sống của chúng [41]. Bảo quản lạnh tinh trùng cá là một kỹ thuật đơn giản cho phép tinh trùng luôn có sẵn tại các thời điểm khác nhau để tiến hành thụ tinh với trứng bằng cách tiêm hormon cho con cái, làm tăng năng suất sinh sản [47]. 2 Trƣớc tình hình đó cần có thêm nhiều nghiên cứu cụ thể về đặc điểm sinh sản của cá, đặc biệt là việc nghiên cứu thành phần tinh dịch của cá chép nhằm đƣa ra đƣợc những chất bảo quản, tỷ lệ pha loãng tốt nhất giúp cho quá trình bảo quản lạnh tinh trùng có hiệu quả cao nhất. Có rất nhiều công trình nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng của một số loài cá đã đƣợc công bố nhƣ cá hồi [59], cá tra [51], cá tầm [28], cá đù vàng [41] Tuy nhiên, nghiên cứu về bào quàn lạnh tinh trùng cá chép vẫn còn nhiều vấn đề cần phải đƣợc nghiên cứu nhằm gia tăng thời gian bảo quản. Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép (Cyprinus carpio Linnaeus, 1758) trong tủ lạnh” đƣợc thực hiện. Đề tài này đƣợc thực hiện với các nội dung chính sau: - Ảnh hƣởng của chất bảo quản lên thời gian bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. - Ảnh hƣởng của tỷ lệ pha loãng lên thời gian bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. - Ảnh hƣởng của việc bổ sung chất kháng sinh lên thời gian bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm tìm ra đƣợc: (1) chất bảo quản tốt nhất, (2) tỷ lệ pha loãng tối ƣu nhất và (3) hiệu quả của việc bổ sung chất kháng sinh cho thời gian bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. Thành công nghiên cứu này có thể giúp cho việc bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh tốt hơn và tăng hiệu quả kinh tế trong sinh sản nhân tạo cá chép. Do thời gian thực tập ngắn, cơ sở vật chất chƣa hiện đại và kiến thức về lĩnh vực này còn hạn chế nên đồ án tốt nghiệp không thể tránh khỏi thiếu sót. Rất mong quý thầy cô và bạn đọc đóng góp ý kiến để đồ án đƣợc hoàn thiện hơn. Trân trọng cảm ơn! Nha Trang, tháng 6 năm 2012 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thanh Thuỷ 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá chép: 1.1.1. Hệ thống phân loại: Hình 1.1: Hình dạng ngoài của Cá chép - Cyprinus carpio. Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Cypriniformes Họ: Cyprinidae Giống: Cyprinus Loài: C. carpio Tên tiếng Anh: Common carp. Tên tiếng Việt: Cá chép. 1.1.2. Phân bố: Trên thế giới: Cá chép phân bố rộng khắp các vùng trên toàn thế giới trừ Nam Mỹ, Tây Bắc Mỹ, Madagasca và châu Úc. Ở Việt Nam: Cá phân bố rộng trong sông ngòi, ao hồ, ruộng ở hầu hết các tính phía Bắc Việt Nam. Cá có nhiều dạng hình nhƣ: Cá chép trắng, chép cẩm, chép hồng, chép đỏ, chép lƣng gù, chép thân cao, chép Bắc Cạn v.v là loài cá có giá trị kinh tế cao. [...]... Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá Chép trong tủ lạnh đƣợc trình bày ở Hình 2.1 Tinh trùng cá Chép Pha loãng Tỷ lệ pha loãng tốt nhất cho bảo quản lạnh 1:1, 1:3, 1:5 Chất bảo quản Kháng sinh Nƣớc cất 0,3 M glucose, 0,6 M sucrose, CCSE (1, 2, 3) Peniciline và streptomycin Đánh giá các điều kiện tối ƣu cho bảo quản tinh trùng trong tủ lạnh Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. .. phá nào lớn cả Các nghiên cứu về bảo quản tinh trùng cá trong tủ lạnh vẫn còn hạn chế nghiên cứu tại Việt Nam Ngoài nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá Trê đen (Clarias fuscus Lacepede, 1803) trong tủ lạnh [13] thì ở Việt Nam không tìm thấy các nghiên cứu nào khác về lĩnh vực này Và đặc biệt hơn là chƣa có công trình nghiên cứu nào công bố về bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh Để góp phần cung cấp... (mOsm/kg) Để xác định chất bảo quản tốt nhất để bảo quản tinh trùng cá chép ta tiến hành bảo quản tinh trùng trong 5 chất bảo quản sau: CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3, 0,3 M glucose và 0,6 M sucrose ở tỷ lệ 1:3 (tinh dịch: chất bảo quản) Tinh trùng sau khi pha loãng trong các chất bảo quản đƣợc cho vào các tube và bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC, mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần Hoạt lực của tinh trùng đƣợc tiến hành... chất bảo quản và nồng độ chất chống đông thích hợp cho bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng Bên cạnh đó và gần đây nhất, sinh viên trƣờng Đại học Nha Trang đã bƣớc đầu nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép (Cyprinus carpio) trong nitơ lỏng [4, 9, 10] Kết quả của các nghiên cứu này mới chỉ bƣớc đầu áp dụng kỹ thuật bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng và chƣa có bƣớc đột phá nào lớn cả Các nghiên. .. Việt Nam: Việc nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng cá chép nói riêng và động vật thuỷ sản nói chung đã đƣợc thực hiện phổ biến ở Việt Nam Một số nghiên cứu về bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng (-196oC) đã đƣợc thực hiện ở các đối tƣợng nhƣ: cá chép, cá trắm cỏ, cá Mrigan, cá bỗng [2], cá Tra [12], cá trê đen (Clarisas fuscus) [7], cá mè trắng (Hypophthalmichthys molitrix) [8] Các nghiên cứu này đã tìm... 2.4.2.3 Mật độ tinh trùng: Theo một số nghiên cứu cho rằng mật độ tinh trùng có quan hệ mật thiết với thời gian bảo quản Mật độ tinh trùng thấp có thời gian bảo quản ngắn hơn so với tinh dịch có mật độ tinh trùng cao hơn ở cùng điều kiện bảo quản Để bảo quản tinh trùng đƣợc thời gian dài thì khi chọn mẫu tinh bảo quản ta nên chọn tinh có chất lƣợng tốt, mật độ tinh trùng cao Chất lƣợng tinh phụ thuộc... nhƣ nghiên cứu chuyên sâu về bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh là một việc làm hết sức cần thiết 15 CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm sinh lý của khoa Nuôi trồng Thuỷ sản – trƣờng Đại học Nha Trang 2.2 Thời gian nghiên cứu: Từ 20/02/2012 đến 02/6/2012 2.3 Đối tƣợng nghiên cứu: Cá chép (Cyprinus carpio L.) 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu: Nghiên. .. 2.3: tinh trùng đƣa vào nghiên cứu có chất lƣợng tƣơng đối cao và rất phù hợp cho nghiên cứu 20 2.4.3 Thí nghiệm ảnh hưởng của chất bảo quản đến thời gian bảo quản trong tủ lạnh: Các chất bảo quản đƣợc sử dụng để bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh gồm: 0,3 M Glucose; 0,6 M Sucrose, (common carp sperm extender) CCSE-1, CCSE-2 và CCSE-3 CCSE đƣợc pha chế dựa vào đặc tính dịch tƣơng của tinh trùng. .. động của tinh trùng đƣợc lƣu trữ Trong cùng 1 loài, Christensen và Tiersch [28] cải thiện thời gian lƣu trữ từ 3-8 ngày với việc kết hợp 2 kháng sinh trên với lƣợng 100 IU penicillin+100 Jg/ml streptomycin và 0,25 Jg/ml antimycotic amphotericin Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh hầu nhƣ chƣa có công trình nghiên cứu nào Vì thế, nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh rất... phần của chất bảo quản dựa trên thành phần có trong tinh dịch cá 0,3 M glucose đƣợc sử dụng để bảo quản tinh trùng của đa số các loài cá nƣớc ngọt, chẳng hạn đối với tinh trùng cá hồi Abant (Salmo trutta abanticus) khi bảo quản trong 0,3 M glucose có hoạt lực tốt hơn (65,0±3,9) khi bảo quản trong Ringer Solution (44,0±4,9) [37], tinh trùng cá chép kính (Ctenopharyngodon idella) bảo quản trong 0,3 M glucose . và kháng sinh tốt nhất cho bảo quản lạnh tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. Trong thí nghiệm về chất bảo quản, tinh trùng cá chép được bảo quản trong các chất bảo quản lần lượt là: 0,3 M glucose;. cho thời gian bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. Thành công nghiên cứu này có thể giúp cho việc bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh tốt hơn và tăng hiệu quả kinh tế trong sinh sản. lực tinh trùng có thể duy trì đến ngày thứ 29. Những kết quả này cho thấy rằng tinh trùng cá chép có thể bảo quản được trong tủ lạnh. Từ khoá: Cá chép, Cyprinus carpio, tinh trùng, bảo quản lạnh,