TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHẠM LAN HƢƠNG TÌM HIỂU BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY TRÊN TÔM SÚ GIỐNG (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2013 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHẠM LAN HƢƠNG TÌM HIỂU BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY TRÊN TÔM SÚ GIỐNG (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGs.Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2013 i LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ Thầy, Cô trƣờng Đại học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy trong thời gian em học ở đây. Đặc biệt chân thành cảm ơn cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hƣớng dẫn em thực hiện luận văn tốt nghiệp. Cũng xin cảm ơn đến các anh chị ở bộ môn Bệnh Thủy sản và các bạn lớp Bệnh học thủy sản K35 và đã giúp đỡ và động viên trong khoảng thời gian học tập tại trƣờng. ii TÓM TẮT Đề tài đƣợc thực hiện nhằm tìm hiểu sự xuất hiện của bệnh AHPNS và sự tƣơng quan của AHPNS và các mầm bệnh khác trên tôm sú giống. Sau khi tiến hành kiểm tra 111 mẫu tôm sú giống ở các tỉnh ĐBSCL phát hiện 50% số tôm bị nhiễm MBV khi soi tƣơi và tỷ lệ cƣờng độ nhiễm nhẹ, trung bình và nặng lần lƣợt là 33%, 12% và 2%. Có đến 46% tôm nhiễm một loài vi khuẩn hình cầu, Gram âm. Hầu hết tôm của các tỉnh đều bị nhiễm khuẩn cao từ 31% đến 100%. Không phát hiện ký sinh trùng và vi khuẩn qua các mẫu kính phết nhuộm Giemsa. Có 16/35 mẫu nhiễm virus chiếm tỷ lệ 46%. Tỷ lệ mẫu nhiễm các loại virus MBV, IHHNV, WSSV lần lƣợt là 17%, 26% và 3% và không phát hiện YHV/GAV. Đặc biệt có hiện tƣợng nhiễm kép MBV- IHHNV. Phát hiện đƣợc 6 mẫu có xuất hiện thể ẩn MBV trên gan tụy tôm sú giống, 2 mẫu có dấu hiệu hoại tử gan tụy và 2 mẫu xuất hiện cả dấu hiệu của hoại tử gan tụy và thể ẩn MBV khi quan sát tiêu bản mô. Biểu hiện của hoại tử gan tụy là mất cấu trúc tế bào hay tập trung tế bào máu ở giữa ống gan tụy. Có 2 mẫu tôm có dấu hiệu hoại tử gan tụy bị nhiễm vi khuẩn, 3 mẫu có dấu hiệu hoại tử gan tụy bị nhiễm virus, trong đó có 1 mẫu nhiễm IHHNV, 2 mẫu nhiễm MBV, đặc biệt có một mẫu nhiễm cả vi khuẩn và MBV. iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH HÌNH v DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU 1 CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 2 2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam hiện nay 2 2.3 Sơ lƣợc về AHPNS 3 2.3.1 Phân bố và thiệt hại 3 2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý 4 2.3.3 Đặc điểm bệnh lý 4 2.3.4 Các nghiên cứu và nhận định 5 2.3.5 Phƣơng pháp phòng và quản lý bệnh 7 2.4 Phƣơng pháp kính phết 8 2.5 Phƣơng pháp PCR 9 2.6 Phƣơng pháp mô học 9 CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9 3.1 Thời gian thực hiện đề tài 9 3.2 Địa điểm thực hiện 9 3.3 Vật liệu nghiên cứu 9 3.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 9 3.3.2 Dụng cụ 9 3.3.3 Hóa chất 9 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 10 3.4.1 Phƣơng pháp nhuộm nhanh phát hiện MBV (Lightner et al., 1983) 10 3.4.2 Phƣơng pháp nhuộm Gram, Giemsa quan sát vi khuẩn 10 3.4.3 Phƣơng pháp mô học (Lightner, 1996) 11 3.4.4 PCR 12 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Tỷ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm sú giống khi kiểm tra bằng phƣơng pháp soi tƣơi 20 4.1.1 Tỷ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm sú giống ở ĐBSCL 20 4.1.2 Tỷ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm sú giống của từng tỉnh 21 4.2 Kết quả kính phết 23 4.2.1 Nhuộm Gram quan sát vi khuẩn 23 4.2.2 Nhuộm Giemsa 25 4.3 Kết quả PCR 25 4.3.1 Kết quả PCR phát hiện MBV, IHHNV, WSSV, YHV/GAV 26 4.4 Kết quả mô học 27 4.5 Sự tƣơng quan giữa hoại tử gan tụy và các mầm bệnh trên tôm giống 32 4.6 Chất lƣợng tôm giống 33 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề xuất 34 PHỤ LỤC 35 iv TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 v DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Tôm chân trắng ở Việt Nam: tôm bên phải nhiễm AHPNS, tôm bên trái bình thƣờng (nguồn: D Lightner). 4 Hình 2.2 Gan tụy tôm chân trắng teo và nhợt nhạt, biểu hiện của AHPNS (nguồn: D Lightner). 4 Hình 2.3 A: Tế bào gan tụy bị tróc; B: thiếu hoạt động phân bào trong tế bào E; C: không có tế bào B, F và R; D: nhân tế bào trƣơng to; E: Tế bào máu tập trung; và F: nhiễm khuẩn thứ cấp (Nguồn: Eduado và Mohan, 2012 trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012). 5 Hình 2.4 Mô gan tụy dạng hoại tử 1 và 2 (nguồn: Lê Hữu Tài và ctv) 5 Hình 3.1 Minh họa kết quả chạy PCR chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000 18 Hình 4.1 Thể ẩn MBV khi soi tƣơi (40X) 20 Hình 4.2 Vi khuẩn trong mẫu kính phết gan tụy khi quan sát ở vật kính 100X 24 Hình 4.3 Kết quả PCR phát hiện MBV, WSSV, IHHNV, YHV/GAV 26 Hình 4.4 Ống tiểu quản gan tụy còn bình thƣờng hình sao và Ống tiểu quản gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc hình sao (10X) 29 Hình 4.5 Các ống gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc hình sao (10X) 30 Hình 4.6 Ống gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc hình sao (40X) 30 Hình 4.7 Cấu trúc ống gan tụy bị hoại tử với sự tập trung của tế bào máu ở giữa ống gan tụy (10X) 31 Hình 4.8 Cấu trúc ống gan tụy bị hoại tử với sự tập trung của tế bào máu ở giữa ống gan tụy (40X) 31 Hình 4.9 Các ống gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc và thể ẩn MBV (10X) 32 Hình 4.10 Các ống gan tụy bị hoại tử mất cấu trúc và thể ẩn MBV (40X) 32 Đồ thị 4.1 Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm MBV trên tôm sú giống có nguồn gốc tại ĐBSCL 21 Đồ thị 4.2 Tỷ lệ tôm sú giống nhiễm MBV của từng tỉnh 22 Đồ thị 4.3 Tỷ lệ tôm nhiễm vi khuẩn của từng tỉnh 25 vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện IHHNV (Yang et al., 2006) 10 Bảng 3.2 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện MBV (Belcher and Young, 1998) 10 Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện WSSV (Kimura, 1996 có chuẩn hóa bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2011) 13 Bảng 3.4 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình PCR phát hiện IHHNV (Yang et al., 2006) 14 Bảng 3.5 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV (Yang et al., 2006) 15 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện WSSV (Kimura, 1996 có chuẩn hóa bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2011) 15 Bảng 4.1 Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm MBV trên tôm sú giống có nguồn gốc từ các tỉnh ĐBSCL 21 Bảng 4.2 Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm MBV trên tôm sú giống có nguồn gốc từng tỉnh 22 Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn 23 Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm các mầm bệnh virus trên tôm giống 27 Bảng 4.5 Kết quả chẩn đoán bệnh trên tôm sú giống 32 vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AHPNS Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome BL Bạc Liêu BT Bến Tre CM Cà Mau CT Cần Thơ ctv cộng tác viên dd dung dịch ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long EMS Early Mortality Syndrome EtBr Ethidium bromide GAV Gill Associated Virus HTGT Hoại tử gan tụy HPV Hepatopancreatic Parvo Virus H&E Hematoxyclin và Eosin IHHNV Hypothermal and Hematopoietic Necrosis Virus MBV Monodon Baculo Virus MG Malachite green PCR Polymerase Chain Reaction ST Sóc Trăng TG Tiền Giang TSV Taura syndrome virus TV Trà Vinh WSSV White Spot Syndrome Virus YHV Yellow Head Virus 1 CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU Châu Á là khu vực nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới nhƣng nghề nuôi trồng thủy sản nơi đây liên tục gặp phải các dịch bệnh nguy hiểm gây ra những tổn thất to lớn. Trong vài thập niên qua một số dịch bệnh nhƣ phát sáng, hội chứng đốm trắng, đầu vàng, hội chứng Taura đã từng tàn phá nghề nuôi tôm nƣớc lợ của khu vực. Gần đây một căn bệnh mới xuất hiện đƣợc gọi là hội chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndrome-EMS) hay còn gọi là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome-AHPNS) đƣợc báo cáo là đã gây ra thiệt hại đáng kể cho ngƣời nuôi tôm ở Trung Quốc, Việt Nam, Malaysia và Thái Lan (Leaño và Mohan, 2012). Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng nuôi tôm nƣớc lợ chủ yếu của cả nƣớc. Trong đó tôm sú là đối tƣợng nuôi chính từng mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nƣớc và góp phần cải thiện đời sống cho nhiều nông dân. Những năm gần đây, do việc thả nuôi ồ ạt không có quy hoạch cộng với việc suy thoái môi trƣờng đã làm cho dịch bệnh xuất hiện ngày càng nhiều gây thiệt hại nghiêm trọng, trong đó phải kể đến các bệnh nhƣ hội chứng đốm trắng, đầu vàng, bệnh gây kết dính mang, bệnh còi, phân trắng…Trƣớc sự diễn biến phức tạp của dịch bệnh đặc biệt là sự xuất hiện của AHPNS mà đến nay vẫn chƣa biết tác nhân càng làm cho nghề nuôi tôm nƣớc lợ gặp nhiều khó khăn. Tôm nhiễm EMS/AHPNS có dấu hiệu hoại tử gan tụy (HTGT) sau khi thả giống từ 10-45 ngày và tỷ lệ tôm chết cao có thể lên đến 100% (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012). Đặc biệt tôm chết rất nhanh sau khi xuất hiện dấu hiệu hoại tử 2-3 ngày (Lê Hữu Tài và ctv, 2012). Có và một vài nơi nông dân thả tôm lặp lại 2-3 lần sau khi cải tạo ao nuôi nhƣng tôm vẫn chết. Phần lớn tôm chết khi còn nhỏ và chƣa đạt kích cỡ thƣơng phẩm. Do tác nhân đến nay vẫn chƣa đƣợc xác định và mức độ nguy hiểm của bệnh nên việc tìm hiểu sự xuất hiện AHPNS trên tôm giống có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán phát hiện bệnh, đó là lý do đề tài “Tìm hiểu bệnh hoại tử gan tụy trên tôm sú giống (Penaeus monodon)” đƣợc thực hiện. Mục tiêu đề tài: Tìm hiểu sự xuất hiện của AHPNS và sự tƣơng quan của AHPNS và các mầm bệnh khác trên tôm sú giống. Nội dung đề tài: Xác định bệnh AHPNS trên tôm sú giống bằng cách kiểm tra vi sinh vật trên tôm bằng phƣơng pháp kính phết, mô học và kiểm tra một số virus thƣờng gặp trên tôm bằng phƣơng pháp PCR. [...]... MBV trên tôm sú giống khi kiểm tra bằng phƣơng pháp soi tƣơi 4.1.1 Tỷ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm sú giống ở ĐBSCL Kết quả phát hiện trên các mẫu nhiễm MBV ở các mẫu tôm giống cho thấy có các thể ẩn hình cầu dạng chùm hay dạng đơn lẻ bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite Green (Hình 4.1) phù hợp với kết quả nhuộm MG của Lightner, 1996 Hình 4.1 Thể ẩn MBV trên gan tụy tôm sú giống (40X) nguồn gốc giống. .. dụng con giống đảm bảo chất lƣợng, nuôi theo đúng quy trình kỹ thuật nhƣng tôm vẫn chết, thậm chí tôm nuôi tới 60-90 ngày tuổi, gần đến vụ thu hoạch vẫn bị chết mà không biết nguyên nhân (Thu Hiền, 2013) 2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý Bệnh đƣợc ghi nhận xuất hiện trên hai loài tôm sú và tôm thẻ sau khi thả giống 10-45 ngày Bệnh gây tỉ lệ chết cao có thể lên đến 100% Tôm bệnh có dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn, gan tụy teo... Về sản xuất giống năm 2012, nhu cầu giống tôm sú khoảng 35-40 tỷ con, tôm thẻ chân trắng 15-20 tỷ con, trong khi cả nƣớc sản xuất đƣợc hơn 37 tỷ tôm sú giống và gần 30 tỷ tôm thẻ chân trắng giống Hiện có 1.529 cơ sở sản xuất giống (giảm 319 cơ sở) Số lƣợng giảm so với năm 2011 nhƣng quy mô một số cơ sở sản xuất giống lớn hơn (Thu Hiền, 2012) Năm 2012 nhiều nơi nuôi tôm nƣớc lợ bị dịch bệnh trên diện... khuẩn ở tôm giống bị hội chứng hoại tử gan tụy ở tất cả các vùng nuôi tôm, trong đó vi khuẩn Vibrio chiếm thành phần chủ yếu và phổ biến nhất là các loài V parahaemolyticus, V harveyi, V vulnificus 53,8% mẫu tôm giống thu ở các trại giống khu vực miền Trung nhiễm vi khuẩn Vibrio (Vụ Nuôi trồng thủy sản, 2012) Nhƣ vậy có thể thấy rằng có nhiều loại vi khuẩn đƣợc tìm thấy trên tôm có dấu hiệu hoại tử Vì... có tỷ lệ nhiễm thấp hơn nhiều so với Cần Thơ ( . ẩn MBV trên gan tụy tôm sú giống, 2 mẫu có dấu hiệu hoại tử gan tụy và 2 mẫu xuất hiện cả dấu hiệu của hoại tử gan tụy và thể ẩn MBV khi quan sát tiêu bản mô. Biểu hiện của hoại tử gan tụy là. hiểm của bệnh nên việc tìm hiểu sự xuất hiện AHPNS trên tôm giống có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán phát hiện bệnh, đó là lý do đề tài Tìm hiểu bệnh hoại tử gan tụy trên tôm sú giống. tài: Tìm hiểu sự xuất hiện của AHPNS và sự tƣơng quan của AHPNS và các mầm bệnh khác trên tôm sú giống. Nội dung đề tài: Xác định bệnh AHPNS trên tôm sú giống bằng cách kiểm tra vi sinh vật trên