TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN Bộ Môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản NGUYỄN THỊ BÉ HẬU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TRÊN CÁ KÈO (Pseudapocryptes lanceolatus) BỆNH XUẤT HUYẾT NUÔI Ở TỈNH BẠC LIÊU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN Bộ Môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản NGUYỄN THỊ BÉ HẬU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TRÊN CÁ KÈO (Pseudapocryptes lanceolatus) BỆNH XUẤT HUYẾT NUÔI Ở TỈNH BẠC LIÊU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs. Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2012 i LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ cùng toàn thể quý thầy cô Khoa Thuỷ Sản đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và thực hiện luận văn này. Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý chân thành cho em thực hiện tốt đề tài, hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học này. Xin gởi lời cám ơn đến cô cố vấn Nguyễn Thị Thu Hằng và quý thầy cô, các anh chị trong khoa Thủy sản và bộ môn Sinh học & Bệnh Thuỷ sản đã giảng dạy và hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập cũng như trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường đại học. Xin chân thành cảm ơn chị Dung, anh Hoàng, anh Văn và chị Hà đang công tác ở tỉnh Bạc Liêu đã tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian đi thu mẫu và điều tra tại địa phương. Và xin chân thành biết ơn sâu sắc gia đình và những người thân của em đã tạo mọi điều kiện, sự động viên, tình yêu thương về vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Gửi lời cảm tạ đến tập thể lớp BHTS khóa 34 đã hết lòng ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ trong suốt thời gian qua. Xin chân thành cám ơn! ii TÓM TẮT Cá kèo (Pseudapocryptes lanceolatus) là một trong những đối tượng nuôi tiềm năng mới có giá trị kinh tế cao, khi nghề nuôi được thâm canh hóa với việc tăng mật độ nuôi thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và là mối nguy hiểm nhất cho nghề nuôi. Đề tài được thực hiện nhằm xác định vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi ở Bạc Liêu làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng và trị bệnh trên cá kèo nuôi thương phẩm. Mẫu bệnh phẩm được thu tại ao nuôi cá có các dấu hiệu bệnh lý bất thường như bơi lờ đờ, tấp mé, bỏ ăn, không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với tiếng động. Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài của cá bệnh là màu sắc nhợt nhạt, xuất huyết trên thân, trên bụng, nắp mang và thường xuất huyết ở các gốc vi ngực, vi bụng, vi lưng và vi hậu môn, các khối u trên bề mặt cơ thể, mắt lồi, mờ đục và phù ra. Những dấu hiệu bên trong được ghi nhận là xoang bụng chứa đầy dịch nhờn, gan xuất huyết hoặc tái nhạt, tỳ tạng bị sưng to hoặc teo nhỏ và xuất huyết, thận xuất huyết và bị nhũn, mật sưng to. Kết quả phân tích vi sinh cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập được là vi khuẩn hình cầu, gram dương, không di động, catalase và oxidase âm tính và có khuẩn lạc dạng tròn, nhỏ, màu trắng trong hoặc trắng đục. Kết quả định danh bằng kít API 20 STREP 10 chủng vi khuẩn đặc trưng đã định danh được 5 loài vi khuẩn Streptococcus iniae, S. agalactiae, S. phocae, Lactococcus raffinolactis, Enterrococcus faecium. iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1 1.1 Giới thiệu 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 2 1.3 Nội dung của đề tài 2 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu 3 2.1.1 Phân loại 3 2.1.2 Đặc điểm hình thái 3 2.1.3 Phân bố và tập tính sống 4 2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng 4 2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng 4 2.1.6 Mùa vụ sinh sản 5 2.2 Một số bệnh vi khuẩn trên cá Biển 5 2.2.1. Bệnh do Vibrio 5 2.2.2. Bệnh do Pseudomonas 6 2.2.3. Bệnh do Streptococcus 6 2.2.4. Bệnh do Flexibacter 6 2.2.5. Bệnh do Photobacter 7 2.2.6. Bệnh vi khuẩn trên thận (Bacterial Kidney Disease – BKD) 7 2.2.7. Bệnh Mycobacteriosis 7 2.2.8. Bệnh furuculosis ở cá 8 2.2.9. Bệnh Piscirickettsiosis 8 iv CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 9 3.2 Vật liệu nghiên cứu 9 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 9 3.2.2 Dụng cụ và hóa chất 9 3.3 Phương pháp nghiên cứu 10 3.3.1 Nhuộm Giemsa 10 3.3.2 Phân lập và định danh vi khuẩn 10 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 14 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 4.1 Thông tin về bệnh xuất huyết ở cá kèo 15 4.2 Dấu hiệu bệnh lý 17 4.3 Kính phết 19 4.4 Kết quả phân lập vi khuẩn 20 4.5 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa 20 4.5.1 Hình thái vi khuẩn 20 4.5.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 21 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đề xuất 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC 34 v DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 4.1 Thông tin về ao nuôi cá kèo 15 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của 20 chủng vi khuẩn đại diện 23 vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 4.1 Ao nuôi cá kèo 17 Hình 4.2 Mẫu cá khỏe (A); Gan cá bị nhợt nhạt (B); gan cá bị xuất huyết và thận bị nhũn (C); gan cá bị nhầy còn thận sưng to và xuất huyết (D); cá kèo bị xuất huyết trên các vây và toàn thân (E); cá bị cong thân (F); cá kèo tấp mé (G) 18 Hình 4.3 Mẫu kính phết thận cá kèo 19 Hình 4.4 Kết quả phân lập vi sinh 20 Hình 4.5 Hình dạng vi khuẩn 21 Hình 4.6 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu OF 22 Hình 4.7 Kết quả test muối 6.5% và nitrat 22 Hình 4.8 Kết quả tan huyết 24 Hình 4.9 Cá bị xuất huyết nặng 25 Hình 4.10 Kết quả test của vi khuẩn Streptococcus iniae 25 Hình 4.11 Cá bị lồi mắt và xuất huyết 26 Hình 4.12 Kết quả test của vi khuẩn Streptococcus agalactiae 26 Hình 4.13 Cá xuất huyết và gan nhạt màu 27 Hình 4.14 Kết quả test của vi khuẩn Streptococcus phocae 27 Hình 4.15 Gan cá xuất huyết 28 Hình 4.16 Kết quả test của vi khuẩn Lactococcus raffinolactis 28 Hình 4.17 Dấu hiệu bệnh cá và kết quả test của Enterrococcus faecium 28 Hình 4.18 Hình 4.18 Ngưng kết miễn dịch 29 1 CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu Hiện nay ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới rất phát triển, đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Chính vì thế, nguồn lợi thủy sản ngày càng cạn kiệt do đánh bắt, khai thác bừa bãi, vì vậy mô hình nuôi công nghiệp ngày càng phổ biến ở nước ngoài, trong nước và đặc biệt là Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Trước kia người nuôi chỉ chú trọng đến con tôm, do nó mang lại lợi nhuận cao, mặt khác nuôi tôm cũng mang lại rủi ro không nhỏ cho người nuôi. Nhận ra được mối trở ngại đó, và biết được nguồn thu nhập từ việc nuôi cá biển cũng không kém nên nhiều hộ nuôi đã dùng ao nuôi tôm chuyển sang nuôi cá, một số loài có giá trị kinh tế cao được chọn nuôi như cá kèo, cá chẽm, cá chình,vv. Từ năm 2000 đến nay nguồn lợi cá kèo rất được quan tâm và tiến hành nhiều nghiên cứu xung quanh vấn đề đánh giá nguồn lợi, biến động quần thể, khai thác cá kèo giống, thử nghiệm nuôi, đặc điểm sinh học, tập tính di cư, … (Võ Thành Toàn, 2005). Hàng năm sản lượng khai thác cá kèo trong tự nhiên cao và chiếm vị trí quan trọng ở ĐBSCL, cá kèo có thịt thơm ngon được nhiều người ưa chuộng, cá có thể được ăn tươi hoặc phơi khô. Do khai thác nhiều mà cung không đủ cầu nên ngày càng thúc đẩy người nuôi chuyển sang nuôi cá kèo, tại Bạc Liêu diện tích nuôi tôm sú đã và đang chuyển sang mô hình nuôi cá kèo ở mật độ thấp và mật độ cao vào mùa mưa, gần 50% số hộ nuôi chuyên tôm đã chuyển sang hình thức nuôi cá kèo (Trương Hoàng Minh và Nguyễn Thanh Phương, 2011). Cá kèo là một đối tượng kinh tế mới vì vậy các nhà nghiên cứu chỉ mới quan tâm đến vấn đề nuôi, con giống, đặc điểm sinh học, tập tính di cư,….họ chưa đặc biệt quan tâm đến các bệnh trên cá kèo, do cá thu gom ngoài tự nhiên nên khả năng bị bệnh là rất cao, chính vì thế vấn đề bệnh trên cá kèo là một vấn đề hết sức nóng bỏng cần được quan tâm. Trong số các bệnh thường gặp ở cá kèo có bệnh nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas, bệnh trắng đuôi do vi khuẩn Pseudomonas dermoalba, bệnh mất nhớt do vi khuẩn Pseudomonas dermoalba gây ra (Nguyễn Khải Định, 2008). Tuy nhiên thông tin chi tiết về bệnh đặc biệt là bệnh xuất huyết ở cá kèo còn rất hiếm. Nhằm cung cấp thông tin về các bệnh cũng như xác định vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá kèo nuôi ở tỉnh Bạc Liêu làm cở sở cho các nghiên cứu phòng và trị bệnh cá kèo thương phẩm giúp nghề nuôi cá kèo ngày càng hiệu quả, bền vững nên đề tài “Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn phân lập từ cá 2 kèo (Pseudapocryptes lanceolatus) bệnh xuất huyết nuôi ở tỉnh Bạc Liêu” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài Xác định đặc điểm bệnh học của vi khuẩn phân lập từ cá kèo nuôi ở Bạc Liêu làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng và trị bệnh trên cá kèo nuôi thương phẩm. 1.3 Nội dung của đề tài 1. Thu thập thông tin về bệnh lý bệnh do vi khuẩn trên cá kèo nuôi ở Bạc Liêu. 2. Xác định đặc điểm vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa. [...]... (2011), ở hai Tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu, diện tích nuôi tôm sú đã và đang chuyển sang mô hình nuôi cá kèo ở mật độ thấp và mật độ cao vào mùa mưa Gần 50% số hộ nuôi chuyên tôm đã chuyển sang hình thức nuôi cá kèo với mật độ cao và có trên 50% số hộ chuyển qua hình thức nuôi cá kèo ở mật độ thấp Cùng với nghiên cứu của Nguyễn Tấn Nhơn (2008) khảo sát 61 hộ nuôi cá kèo ở các tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu và... độ cá kèo giống có liên quan chặt chẽ với lượng mưa, độ mặn, lưu tốc dòng chảy và độ trong 2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng Trần Đắc Định và ctv (2002) nghiên cứu về đặc điểm sinh trưởng của cá kèo ở vùng ven biển tỉnh Bạc Liêu cho thấy trên tổng số mẫu 508 mẫu cá thu được có chiều dài tổng của cá từ 10,1-20,3cm Theo Võ Thành Toàn (2005) thì qua kết quả phân tích các tham số tăng trưởng của 1.264 mẫu cá. .. người nuôi 16 Hình 4.1 Ao nuôi cá kèo 4.2 Dấu hiệu bệnh lý Cá kèo nuôi công nghiệp tại Bạc Liêu được thu ngẫu nhiên 8-10 con/ao có các dấu hiệu bệnh lý bất thường như bơi lờ đờ, tấp mé, bỏ ăn, không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với tiếng động Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài như màu sắc nhợt nhạt, xuất huyết trên thân, trên bụng, nắp mang và thường xuất huyết ở các vi như vi ngực, vi bụng, vi lưng, vi hậu... biệt dùng trong vi c phân loại các liên cầu khuẩn, do liên cầu khuẩn có khả năng tiết ra chất hemolysin gây tan huyết Phương pháp: Vi khuẩn được phân lập trên mẫu cá bệnh, phải được xác định là loài vi khuẩn gram dương, hình cầu, vi khuẩn nuôi trên đĩa TSA (+1,5% NaCl) Khi vi khuẩn đã thuần, dùng que cấy nhặt 1 khuẩn lạc và cấy lên đĩa môi trường Blood (+1,5% NaCl) Sau 48 giờ ở 30-32oC vi khuẩn phát triển... mật độ nuôi bình quân là 80 con/m2 Nghiên cứu của Trần Ngọc Hải và Nguyễn Tấn Nhơn (2009) nuôi cá kèo ở Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau mật độ nuôi trung bình 80 con/m2 Trước xu hướng chuyển từ diện tích nuôi tôm sang nuôi cá kèo thì hiện nay tổng diện tích nuôi cá kèo tại Bạc Liêu là rất lớn 342,22 ha (Hoàng Trang - TTKNKN Bạc Liêu, 2011) cùng với mật độ nuôi cao trung bình 200 con/m2 nên dịch bệnh thường... là bùn hay bùn cát 2.2 Một số bệnh vi khuẩn trên cá biển Theo Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du (2010) các bệnh nguy hiểm thường gặp trên động vật nuôi biển là những bệnh sau: 2.2.1 Bệnh do Vibrio 5 Tác nhân chủ yếu là vi khuẩn V anguillarum, V ordalii, V Salmonicida và V Vulnificus Ở khu vực Đông Nam Á, bệnh xảy ra chủ yếu trên cá mú, cá chẽm Biểu hiện bệnh lý là xuất huyết, đốm đỏ, lở loét, vây bị... thực bào vi khuẩn vì vậy khi vi khuẩn tấn công số 19 lượng bạch cầu tăng lên để bảo vệ cơ thể tránh sự tấn công của vi khuẩn làm hại đến sức khỏe vật chủ 4.4 Kết quả phân lập vi khuẩn Mẫu cá lờ đờ, tắp mé, có biểu hiện bất thường và mẫu cá khỏe được thu ngẫu nhiên tại ao nuôi thương phẩm ở tỉnh Bạc Liêu, được tiến hành phân lập vi sinh trên gan, thận, tỳ tạng lên môi trường TSA (+1,5% NaCl), ủ ở 30-32oC... loài cá nước ngọt và cá biển Tác nhân là vi khuẩn Mycobacterium là vi khuẩn hiếu khí không di động, có dạng hình que, sinh trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy Bệnh xảy ra ở vùng Thái Bình Dương và Đại Tây Dương, ở cá lóc, cá bơn, và cá chẽm Biểu hiện: những nốt màu trắng xám trên lách, thận và gan Cá bị mất thăng bằng, tổn thương và xuất huyết trong cơ Vi khuẩn có giai đoạn ủ bệnh thời gian dài, làm cá. .. sinh hóa của vi khuẩn Quan sát hình dạng khuẩn lạc Một khuẩn lạc do nhiều tế bào vi khuẩn hợp thành và có đặc điểm hình thái khác nhau tùy theo từng loài vi khuẩn Khuẩn lạc có thể có các hình dạng như to, nhỏ, nhỏ li ti, trên mặt agar thì khuẩn lạc có thể nổi, bằng, khuyết xuống Quan sát màu sắc khuẩn lạc Trên môi trường phân lập tổng quát trypticase soy agar (TSA) hay nutrient agar (NA) thì khuẩn lạc... Kết quả test của vi khuẩn Streptococcus agalactiae c) Streptococcus phocae (chủng vi khuẩn A1F2 và A2F3) 26 Mẫu cá phân lập được loài vi khuẩn Streptococcus phocae có dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết ở vây hậu môn, vây bụng, gan nhạt màu và cong thân Khi quan sát tiêu bản tươi mô thận của cá bệnh sẽ thấy vi khuẩn nằm rải rác hoặc tập trung thành từng đám trên vùng mô phết kính bên cạnh các tế bào biến . nuôi ở tỉnh Bạc Liêu được thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài Xác định đặc điểm bệnh học của vi khuẩn phân lập từ cá kèo nuôi ở Bạc Liêu làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng và trị bệnh trên cá. huyết ở cá kèo còn rất hiếm. Nhằm cung cấp thông tin về các bệnh cũng như xác định vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá kèo nuôi ở tỉnh Bạc Liêu làm cở sở cho các nghiên cứu phòng và trị bệnh. Sinh Học và Bệnh Thủy Sản NGUYỄN THỊ BÉ HẬU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TRÊN CÁ KÈO (Pseudapocryptes lanceolatus) BỆNH XUẤT HUYẾT NUÔI Ở TỈNH BẠC LIÊU