TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ KIM TRONG ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC GAN TỤY CỦA TÔM DƢỚI TÁC ĐỘNG CỦA NÔNG DƢỢC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2012 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ KIM TRONG ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC GAN TỤY CỦA TÔM DƢỚI TÁC ĐỘNG CỦA NÔNG DƢỢC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGs. Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2012 i LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn tôi xin chân thành cảm ơn: Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức chuyên môn và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị trong bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã hƣớng dẫn, giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn. Xin cảm ơn tập thể lớp Bệnh học thủy sản K34, các bạn đã giúp đỡ và trao đổi kiến thức trong quá trình học tập. ii TÓM TẮT Thí nghiệm cảm nhiễm của tôm sú với Decis và WSSV đƣợc thực hiện nhằm tìm hiểu những biến đổi mô bệnh học ở cơ quan gan tụy tôm và một số chỉ tiêu miễn dịch dƣới ảnh hƣởng của Decis có chứa hoạt chất Deltamethrin và sự cảm nhiễm WSSV. Thí nghiệm đƣợc bố trí với 5 nghiệm thức gồm nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức có nồng độ Decis 0,001 µg/L có tiêm 0,1 ml WSSV sau 24 giờ, nồng độ Decis 0,01 µg/L có tiêm WSSV sau 24 giờ, nồng độ Decis 0,1 µg/L có tiêm WSSV sau 24 giờ và nghiệm thức chỉ tiêm WSSV sau 24 giờ. Kết quả thu mẫu đƣợc ở thời gian 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ sau khi gây cảm nhiễm, sau khoảng 54 giờ tôm chết ở các nghiệm thức có Decis và WSSV. Các chỉ tiêu phân tích miễn dịch máu tôm kết quả cho thấy giá trị tổng bạch cầu giảm khác biệt có ý nghĩa sau khi tiêm WSSV. Giá trị của RES ở các nghiệm thức có Decis và WSSV tăng dần qua 24 giờ và 48 giờ, khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) tại 48 giờ so với lúc 0 giờ. Giá trị SOD ở các nghiệm thức có nồng độ Decis khác nhau tăng khác biệt có ý nghĩa ở 24 giờ, sau đó giảm ở 48 giờ sau khi tiêm WSSV, riêng nghiệm thức chỉ tiêm WSSV thì nồng độ SOD tăng dần từ 0 giờ đến 48 giờ và khác biệt có ý nghĩa lúc 48 giờ so với 0 giờ. Giá trị PO tăng cao ở các nghiệm thức có Decis lúc 24 giờ, qua 48 giờ hàm lƣợng PO giảm xuống khác biệt có ý nghĩa thấp hơn giá trị lúc 0 giờ. Bên cạnh đó khi phân tích mô học cơ quan gan tụy của tôm sú và tôm càng xanh cảm nhiễm với Decis và WSSV kết quả mô học cho thấy ống gan tụy của hai loại tôm đều bị hoại tử, quan sát thấy có sự hiện của thể vùi WSSV trong dạ dày và mang của tôm sú, biểu hiện sƣng phồng mang ở tôm càng xanh. iii MỤC LỤC Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách bảng iv Dang sách hình v PHẦN I 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.1Giới thiệu 1 1.2 Mục tiêu đề tài 2 1.3 Nội dung đề tài 2 PHẦN II 3 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Phƣơng pháp mô học 3 2.2 Sơ lƣợc các nghiên cứu về mô gan tụy của tôm. 4 2.3 Sơ lƣợc những nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên tôm 6 2.4 Đáp ứng miễn dịch trên giáp xác. 6 2.4.1 Quá trình thực bào 7 2.4.2 Quá trình phong tỏa 7 2.4.3 Hệ thống Prophenoloxydase (proPO) 8 2.4.4 Chất chống oxy hóa 8 2.4.5 Sản sinh chất kháng khuẩn 8 2.5 Một số nghiên cứu về thuốc trừ sâu ảnh hƣởng đến động vật thủy sản 8 2.5.1 Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu lên cá 8 2.5.2 Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu lên tôm 9 2.6 Sơ lƣợc về thuốc trừ sâu Decis 10 2.6.1 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa học của Decis 11 2.6.2 Sơ lƣợc về thuốc trừ sâu Decis 2,5 EC dùng nghiên cứu 12 PHẦN III 13 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 13 3.2 Vật liệu nghiên cứu 13 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 13 3.2.2 Dụng cụ 13 3.2.3 Hóa chất 13 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 13 3.3.1 Phƣơng pháp nuôi dƣỡng tôm 13 3.3.2 Bố trí thí nghiệm và thu mẫu 13 3.3.3 Pha nồng độ thuốc dùng thí nghiệm 14 3.3.5 Phƣơng pháp mô học 16 3.3.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 19 iv PHẦN IV 20 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Kết quả miễn dịch tôm sú cảm nhiễm với Decis và WSSV 20 4.1.1 Kết quả của quá trình gây cảm nhiễm 20 4.1.2 Kết quả các chỉ tiêu miễn dịch của tôm với Decis và WSSV 20 4.2 Kết quả mô bệnh học của tôm cảm nhiễm với Decis và WSSV. 23 4.2.1 Đặc điểm mô học cơ quan gan tụy của tôm 23 4.2.2 Những biến đổi mô học trên gan tụy của tôm. 24 PHẦN V 28 5.1 Kết luận 28 5.2 Đề xuất 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC 32 v DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Các dạng bạch cầu ở giáp xác và chức năng trong đáp ứng miễn dịch 7 Bảng 3.1 Quy trình xử lý mẫu tự động 17 Bảng 3.2 Nhuộm mẫu theo phƣơng pháp Mayer’s Hematoxyline & Eosin 18 vi DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu 15 Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lƣợng tổng bạch của tôm sú giữa các nghiệm thức và các ngày thu mẫu. 20 Hình 4.2 Biểu đồ so sánh hoạt tính Respiratory burst của tôm sú giữa các nghiệm thức và giữa các ngày thu mẫu. 21 Hình 4.3 Biểu đồ so sánh hoạt tính superoxide dismutase của tôm càng xanh giữa các nghiệm thức và giữa các ngày thu mẫu 22 Hình 4.4 Biểu đồ so sánh hoạt tính Phenloloxidase của tôm sú giữa các nghiệm thức và các ngày thu mẫu. 23 Hình 4.5 Cấu tạo ống tiểu quản gan tụy tôm sú bình thƣờng ở mặt cắt ngang (H&E) Mẫu nghiệm thức đối chứng 23. Hình 4.6 Cấu tạo ống tiểu quản gan tụy tôm càng xanh bình thƣờng ở mặt cắt ngang. 24 Hình 4.7 Cơ quan gan tụy tôm sú bị hoại tử mất cấu trúc ( ) (10X) 25 Hình 4.8 Các tế bào máu bao xung quanh ống gan tụy bị hoại tử (40X) 25 Hình 4.9 Thể vùi WSSV trên tôm sú (100X). 26 Hình 4.10 Gan tụy tôm càng xanh bị hoại tử (10X). 26 Hình 4.11 Sợi mang tôm càng xanh sƣng phồng ( ), sợi mang bình thƣờng ( )(10X). 27 1 PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1Giới thiệu Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với tổng diện tích có khả năng nuôi trồng thủy sản khoảng 1,1 triệu ha, là vùng nuôi thủy sản trọng điểm chiếm 55% tổng diện tích nuôi của cả nƣớc (Đào Bá Cƣờng, 2010). Trong đó diện tích nuôi tôm chiếm khoảng 550.000 ha, tập trung chủ yếu ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang, Trà Vinh và Bến Tre (Cục NTTS, 2009). Tính đến hết tháng 7/2010 tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 2,49 tỷ USD. Cơ cấu xuất khẩu thủy sản của Việt Nam chủ yếu tập trung các mặt hàng: tôm, cá Tra, cá Basa, mực và các sản phẩm cá. Nhìn chung, xuất khẩu các mặt hàng này chiếm 97% kim ngạch thủy sản cả nƣớc, trong đó xuất khẩu tôm chiếm cao nhất 37,4% (Tổng cục Hải Quan, 2010), trong khi đó cá Tra và cá Basa chiếm 32% (ABS, 2010). Trong các đối tƣợng nuôi, tôm sú đƣợc xem là đối tƣợng nuôi chủ lực của Việt Nam do giá trị xuất khẩu cao mang lại nguồn thu ngoại tệ đáng kể. Bên cạnh những giá trị đạt đƣợc về mặt kinh tế thì nghề nuôi tôm ở ĐBSCL đang phải đối mặt với nguy cơ suy thoái môi trƣờng và dịch bệnh xảy ra hàng năm. Một trong những nguyên nhân gây chết hàng loạt tôm nuôi ở ĐBSCL nhƣ bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại tử gan tụy (HPV)… Từ giữa năm 2010 đến nay, hội chứng hoại tử gan tụy trên tôm sú diễn biến khá phức tạp ở ĐBSCL và gây thiệt hại lớn cho ngƣời nuôi đặc biệt ở hai tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Số: 5330/TB-BNN-VP) tính đến tháng 10/2011 diện tích thiệt hại tôm ở ĐBSCL khoảng 80.000 ha. Tôm chết có các biểu hiện nhƣ: gan nhạt màu, nhũn, sƣng, gan bị teo, dai và sậm màu, quan sát tiêu bản mô học thấy có biểu hiện hoại tử. Theo kết quả nghiên cứu của viện nuôi trồng thủy sản II: một trong những nguyên nhân gây tôm chết hàng loạt và hội chứng hoại tử gan tụy trên tôm nuôi thời gian qua ở ĐBSCL là do việc sử dụng hóa chất nông dƣợc. Phần lớn các hộ bị thiệt hại thƣờng dùng các sản phẩm có thành phần nông dƣợc là Deltamethrin, Cypermethrin để diệt giáp xác và cải tạo ao nuôi, thậm chí một số hộ còn sử dụng trực tiếp các loại thuốc bảo vệ thực vật nhƣ: Padan, visher… Theo quan niệm của ngƣời nuôi tôm việc sử dụng các hóa chất để phòng trị bệnh, tiêu diệt địch hại, kích thích tôm lột xác lớn nhanh là việc cần thiết và sử dụng rất phổ biến. Theo Nguyễn Thị Phƣơng Nga (2004) chi phí thuốc và hóa chất sử dụng trong ao nuôi chiếm khoảng 20,8-21%. Do đó nhằm giảm chi phí thuốc, hóa chất ngƣời nuôi đã sử dụng thuốc trừ sâu để diệt tạp, giáp xác và kích thích tôm lột xác. Trong đó thuốc trừ sâu Decis chứa hoạt chất Deltamethrin đƣợc đƣợc ngƣời nuôi sử dụng khá phổ biến (Nguyễn Hữu Đức, 2007). Độc tính của Deltamethrin thƣờng gây chết sinh vật ở nồng độ rất thấp. 2 Hiện nay đã có một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của Deltamethrin đối với đặc điểm sinh lý, sinh trƣởng của tôm và cá nhƣng nghiên cứu về đặc điểm mô học thì chƣa có. Chính vì vậy, đề tài “Đặc điểm mô bệnh học gan tụy của tôm dƣới tác động của nông dƣợc” đƣợc thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài Tìm hiểu những biến đổi mô học gan tụy của tôm dƣới tác động của thuốc trừ sâu Decis có chứa hoạt chất Deltamethrin. 1.3 Nội dung đề tài - Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của Deltamethrin lên tôm ở nhiều nồng độ khác nhau. - Xác định những biến đổi mô học của gan tụy dƣới ảnh hƣởng của Deltamethrin. [...]... 2.1 Phƣơng pháp mô học Là phƣơng pháp mô tả những đặc điểm biến đổi bệnh lý đặc trƣng dƣới mức độ vi thể ở các cơ quan mô bệnh học và đặc điểm mô học bình thƣờng, từ kết quả của kỹ thuật mô học cùng với kết quả của các phƣơng pháp khác để đánh giá mức độ phù hợp và chính xác của bệnh Quy trình nhuộm Hematoxyline và Eosin trên mô đƣợc thực hiện theo Lightner và ctv (1996) và hình ảnh mô thu thập qua... quan đến tôm cá bệnh thì thƣờng có những kết luận sai lầm vì những hình thái tổn thƣơng của vài bệnh có thể giống nhau và gây lầm lẫn trong chẩn đoán Phƣơng pháp mô học nghiên cứu cấu trúc mô ở mức độ hiển vi và mô bệnh học là một chuyên môn hẹp của phƣơng thức mô học đề cập tới quá trình phát triển bệnh Mô bệnh học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trƣờng hợp bệnh chỉ... bằng việc kết hợp hai phƣơng pháp này ông mô tả rất cụ thể các đặc điểm mô học của các tác nhân gây bệnh trên tôm sú, năm 2000 ông cũng ứng dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu đề tài bệnh đỏ mang trên tôm bố mẹ Phƣơng pháp mô học cũng đƣợc Hòa (2001) ứng dụng trong việc xác định cƣờng độ cảm nhiễm MBV Bùi Quang Tề (2003) ứng dụng kỹ thuật mô học vào chuẩn đoán bệnh tôm và đƣa ra phƣơng pháp phòng trị Phạm... nghiên cứu mô bệnh học trên gan tụy và mang tôm càng xanh khi tiếp xúc với endosulfan Kết quả biến đổi mô bệnh học trên gan tụy và mang bao gồm: sự tích tụ của các tế bào máu trong khe của các xoang, ống gan tụy bị hoại tử; tấm mang không bình thƣờng bị phát triển quá mức, bị hoại tử Theo Nguyễn Khắc Lâm (2004) nghiên cứu về bệnh “phân trắng teo gan trên tôm sú nuôi thƣơng phẩm tại Ninh Thuận Tôm bệnh thƣờng... minh sự hiện diện của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú, tôm thẻ và tôm he Nhật Bản bằng việc quan sát tiêu bản mô học dƣới kính hiển vi quang học và điện tử Năm 1998 Sudha và ctv bằng phƣơng pháp mô học đã xác định mối quan hệ giữa các loài virus gây nhiễm trên các loài tôm biển Ấn Độ Nguyễn Văn Hảo (1999) nghiên cứu bệnh tôm trên tôm sú nuôi tại Trà Vinh bằng phƣơng pháp mô học và PCR, bằng việc... Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau Tôm bệnh có dấu hiệu hoạt động yếu, tấp bờ, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% trong 2-3 ngày, gan tụy tôm bệnh nặng bị hoại tử, khi tôm yếu và chết gan tụy thối rữa rất nhanh Bằng các phƣơng pháp chuẩn đoán mô bệnh học, kính hiển vi điện tử, sinh học phân tử trên tôm bệnh có các biểu hiện: gan tụy bị hoại tử và có thể chứa các giọt mỡ, một số tế bào trên mô hình ống trƣơng to chứa... 4.4 Biểu đồ so sánh hoạt tính Phenloloxidase của tôm sú giữa các nghiệm thức và các ngày thu mẫu 4.2 Kết quả mô bệnh học của tôm cảm nhiễm với Decis và WSSV 4.2.1 Đặc điểm mô học cơ quan gan tụy của tôm Gan tụy nằm ở phần đầu cơ thể, có dạng hình khối, có nhiều ống nhỏ hay còn gọi là ống tiểu quản kết lại rồi tập trung ở thành ống đổ vào ruột giữa Tuyến gan tụy giữ vai trò quan trọng trong quá trình... Những biến đổi mô học trên gan tụy của tôm Quan sát trên tất cả mẫu mô tôm sú ở nghiệm thức có nồng độ Decis cao nhất (0,1 µg/L) của 2 lần thu mẫu: sau 24 giờ và sau 48 giờ Kết quả mô học ở lần thu mẫu sau 24 giờ cho thấy có hiện tƣợng hoại tử trên các ống tiểu quản gan tụy Sau 48 giờ mẫu mô của cơ quan gan tụy có hiện tƣợng hoại tử nặng hơn so với 24 giờ, làm mất cấu trúc của các ống gan tụy (Hình... lúc 0 giờ - Đặc điểm mô bệnh học chung của tôm sú và tôm càng xanh khi cảm nhiễm với Decis và WSSV là ống gan tụy đều bị hoại tử xuất hiện thể vùi trên mang và dạ dày của tôm sú, biểu hiện phồng mang trên tôm càng xanh 5.2 Đề xuất - Bố trí thí nghiệm nghiên cứu lại việc cảm nhiễm của tôm sú với Decis và WSSV để có thể thu mẫu đến 96 giờ nhằm xác định chính xác hơn các chỉ tiêu miễn dịch của tôm sú - Trƣớc... tác nhân gây ra bệnh “phân trắng, teo gan gồm: vi khuẩn, virus, tảo độc, nguyên sinh động vật Vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio gây hoại tử gan tụy với tần suất 80%, virus HPV với tần suất 36%, tảo lam là loại tạo có chất độc với tần suất 45,5% và môi trƣờng ao nuôi không tốt cũng là nguyên nhân gây ra bệnh Theo FAO (2005) đặc điểm mô bệnh học của bệnh gan tụy do vi khuẩn có biểu hiện: khối gan tụy teo lại . hƣởng của Deltamethrin đối với đặc điểm sinh lý, sinh trƣởng của tôm và cá nhƣng nghiên cứu về đặc điểm mô học thì chƣa có. Chính vì vậy, đề tài Đặc điểm mô bệnh học gan tụy của tôm dƣới tác động. Phƣơng pháp mô học Là phƣơng pháp mô tả những đặc điểm biến đổi bệnh lý đặc trƣng dƣới mức độ vi thể ở các cơ quan mô bệnh học và đặc điểm mô học bình thƣờng, từ kết quả của kỹ thuật mô học cùng. NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2012 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ KIM TRONG ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC GAN TỤY CỦA TÔM DƢỚI TÁC ĐỘNG CỦA NÔNG