Đang tải... (xem toàn văn)
1. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện để biểu hiện gen gp120 phân type B của HIV lưu hành ở Việt Nam.2. Đã biểu hiện thành công gen mã hóa protein gp120 ở vi khuẩn và đã tìm được điều kiện tối ưu để biểu hiện.3. Đã tinh sạch được kháng nguyên GP120 phân type B có độ tinh sạch. Sau khi tinh sạch kháng nguyên vẫn giữ được đặc tính kháng nguyên, phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng HIV tự nhiên trong huyết thanh bệnh nhân HIV dương tính.
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 1 BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Ý nghĩa AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome Amp Ampicillin APS Amonium persulphate Bp Base pair BSA Bovine Serum Albumin CBB Comassie Brillant Blue DNA Deoxyribonucleic acid Dntp 2’-deoxyribonucleoside 5’-triphosphate ĐC Đường chạy E.coli Escherichia coli EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EtBr Ethidium Bromite HIV Human Immunodeficency Virus IPTG Isopropylthio-β-D-Galactosidase Kb Kilo base KDa, Da Kilo Dalton, Dalton LB Lauria-betani medium LBA Lauria broth containing ampicillin mRNA Messeger RNA OD Optical density PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 2 PVDF Polyvinylidene difluoride RNA Ribonuclecin Acid SDS Sodium dodecyl sulphat SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphat-Polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris-Acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus TBS Tris Buffered Saline TE Tris-EDTA TEMED N,N,N’,N’ – Tetramethylenediamine TTBS Tween-Tris Buffered Saline Trx Thioredoxin v/p Vòng/phút v/v Thể tích/thể tích w/v Trọng lượng/thể tích X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D galactopyranosite Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 3 MỞ ĐẦU Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đương đầu với đại dịch HIV/AIDS. Virus HIV sau khi xâm nhiễm sẽ làm suy giảm miễn dịch khiến cơ thể không còn sức đề kháng với mọi bệnh tật, cơ thể suy kiệt dần và dẫn tới tử vong. HIV/AIDS không chỉ là nguyên nhân cướp đi hàng triệu sinh mạng trên thế giới mà còn là hiểm họa tác động nghiêm trọng đến mọi khía cạnh của đời sống xã hội làm ảnh hưởng tới kinh tế, văn hoá, xã hội, nòi giống của mỗi quốc gia. Kể từ khi phát hiện bệnh (6/1981) cho tới nay, AIDS đã cướp đi mạng sống của 40,3 triệu người trên thế giới và trở thành một trong những căn bệnh gây chết người nhiều nhất trong lịch sử nhân loại. Theo đánh giá của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), HIV/AIDS đang được xếp hàng thứ 3 trong các nguyên nhân gây tử vong (chiếm 7,5%) ở các nước đang phát triển. Việt Nam hiện đang được xếp vào danh sách các nước có tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS cao trên thế giới, và là nước có số người nhiễm HIV cao thứ 6 Châu Á. Số lượng người nhiễm HIV/AIDS gia tăng kéo theo nhu cầu chăm sóc và hỗ trợ ngày càng tăng. Cho đến nay vẫn chưa có vaccine phòng bệnh, mặt khác thuốc điều trị HIV/AIDS được sử dụng rất hạn chế vì giá thành quá cao, và sự gia tăng tính kháng thuốc. Việc chẩn đoán, sàng lọc chính xác các trường hợp dương tính để có hướng dự phòng và điều trị là một khâu mang tính then chốt trong phòng chống HIV. Các kit chẩn đoán HIV hiện nay phải nhập ngoại 100% với giá thành cao, rất khó kiểm soát độ nhạy, độ đặc hiệu, mất công vận chuyển tốn kém và không chủ động sản xuất để sử dụng trên diện rộng với hàng triệu mẫu máu cần kiểm tra. Để phù hợp với các phân type HIV lưu hành tại Việt Nam, cần nghiên cứu sản xuất các kit chẩn đoán dựa trên type virus tại nước ta. Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 4 Với đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên gp120 của virus HIV phân type B lưu hành tại Việt Nam”; chúng tôi hi vọng có thể phục vụ cho việc sản xuất các kit chẩn đoán HIV cho bệnh nhân tại Việt Nam có độ chính xác tuyệt đối và độ nhạy cao. Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 5 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải HIV/AIDS 1.1.1. Định nghĩa AIDS (Acquired Immuno Deficiency Syndrom) là một hội chứng của nhiều bệnh nhiễm trùng cơ hội (lao, viêm phổi, nấm, ung thư, viêm da, lở loét toàn thân hoặc suy kiệt - những bệnh này nặng dần lên có thể dẫn đến cái chết), mà người nhiễm HIV gặp phải do hệ miễn dịch của cơ thể bị tổn thương hoặc bị phá hủy nặng nề. AIDS được coi là giai đoạn cuối của quá trình nhiễm HIV. Tuy nhiên, mỗi người khi mắc AIDS sẽ có những triệu chứng khác nhau, tùy theo loại bệnh nhiễm trùng cơ hội mà người đó mắc phải, và khả năng chống đỡ của hệ miễn dịch mỗi người [24] [35]. Khi virus HIV xâm nhập vào trong cơ thể người, sẽ gây đáp ứng miễn dịch thứ phát do mất tế bào lympho T CD4 (hỗ trợ). Các tế bào CD4 + T-lymphocyte đóng một vai trò thiết yếu đối với sự hoạt động của hệ thống miễn dịch. Suy giảm miễn dịch do mất tế bào T CD4 dẫn đến nhiễm trùng cơ hội và ung thư. Ở người bình thường, lượng tế bào T CD4 tương đối cao. Khi virus HIV xâm nhập thì lượng tế bào này bắt đầu giảm xuống tuy nhiên vẫn giữ ở mức cao, trên 500 tế bào/mm 3 máu. AIDS là tất cả những người nhiễm HIV mà khi tế bào T CD4 < 200 tế bào/mm 3 máu, dù chưa có triệu chứng lâm sàng. Thời gian trung bình từ khi nhiễm HIV đến khi tiến triển thành AIDS là khoảng 12 - 13 năm. Một khi đã bị AIDS, nạn nhân thường chết sau 18-24 tháng [4]. 1.1.2. Sự xuất hiện của HIV/AIDS Năm 1959, tại Zaize - châu Phi, lần đầu tiên phát hiện HIV dương tính trong mẫu máu của bệnh nhân. Tháng 3/1981 nhiều trường hợp ung thư da Kaposi Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 6 được báo cáo ở New York; nguyên nhân của tình trạng này lúc đó chưa được biết. Tháng 6/1983, Luc Montagnien và Barré Sinousi đã phân lập được virus gây bệnh và đặt tên là LAV (Lymphadenopathy asoociated virus – virus liên quan đến bệnh hạch). Năm 1984, Robert Gallot đã phân lập được 1 virus có ái tính với Lympho T của người nên đặt tên là HTLV type III (Human lymphotrophic virus type III). Cùng năm đó Levy đã phân lập được 1 virus có liên quan đến hội chứng suy giảm miễn dịch và đặt tên là ARV (AIDS related virus). Đến năm 1986, cả 3 được thống nhất gọi là virus gây bệnh suy giảm miễn dịch trên người, viết tắt là HIV-1. Năm 1985, Barin và cộng sự phân lập được HIV thứ 2 ở Tây Phi, đặt tên là HIV-2. HIV-2 có những đặc tính rất giống với virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ viết tắt là SIV cũng ở Tây Phi [12][24]. Trên huyết thanh cất giữ và nay khi thử lại với HIV-1, HIV-2 thì huyết thanh của người mắc bệnh ở Zaire cất giữ từ năm 1959 đã dương tính với HIV-1. HIV- 1 cũng đã được phân lập trên 1 bệnh phẩm của bệnh nhân ở Zaire cất giữ từ năm 1976. Trên cơ sở nghiên cứu dịch tễ học thì HIV-2 có thể đã có ở Tây Phi từ năm 1966. Như vậy, có thể giả định HIV đã xuất hiện từ những năm 60 của thế kỷ này hoặc trước đó vài trục năm. Nhưng đến thập kỉ 80 mới bùng phát thành đại dịch HIV/AIDS [12][20]. 1.1.3. Tình hình dịch bệnh 1.1.3.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới Theo UNAIDS, ước tính đến cuối năm 2009, đầu năm 2010; trên thế giới có khoảng 65 triệu người đã nhiễm HIV/AIDS trong đó, khoảng 25 triệu người đã chết vì căn bệnh này; 40,3 triệu người đang chung sống với HIV/AIDS. Hàng năm có khoảng 1,8 triệu người đã tử vong do các bệnh liên quan đến AIDS. Con Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 7 số tử vong lên đến đỉnh điểm khoảng năm 2004, và do sự mở rộng của điều trị kháng virus, và giảm 19% từ năm 2004 đến năm 2009. Đến đầu năm 2010, có 16.600.000 trẻ mồ côi do AIDS. Khoảng một nửa số người nhiễm HIV ở độ tuổi 25. AIDS là nguyên nhân thứ hai gây tử vong nhiều nhất trong độ tuổi 20-24 trên thế giới [33]. Hình 1.1: Sơ đồ phân bố số lượng người nhiễm HIV/AIDS trên thế giới 2009 Tổng số người nhiễm HIV hàng năm vào khoảng 2,5 triệu. Mỗi ngày có gần 13.000 người nhiễm HIV trong đó có 50% là phụ nữ, 50% là thanh thiếu niên độ tuổi 15-24. Đặc biệt, theo báo cáo của Liên hợp quốc: Trong những năm trở lại đây, phụ nữ đang trở thành đối tượng có HIV ngày càng nhiều hơn nam giới, và nguy cơ mắc HIV ở phụ nữ ngày càng lớn hơn nam giới [33]. Các khu vực khác trên thế giới như Tây, Trung, Đông Âu, Trung Á và Bắc Mỹ Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 8 có tỉ lệ nhiễm mới là tương đối ổn định trong vòng 5 năm trở lại đây. Ở Châu Á có khoảng 1 triệu người nhiễm mới mỗi năm; chiếm 20% số trường hợp nhiễm mới trên toàn thế giới [15] [22]. Hình 1.2 : Sơ đồ số lượng người đang sống chung với HIV từ năm 1990-2009 trên thế giới 1.1.3.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam Tính đến ngày 31/12/2010, đại diện Cục Phòng chống HIV/AIDS Việt Nam cho biết: Số trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống là 183.938 người. Số bệnh nhân AIDS hiện tại là 44.938 người. Số người nhiễm HIV đã tử vong là 49.477 trường hợp [37]. Tính riêng trong 9 tháng đầu năm 2010, toàn quốc đã phát hiện được 9.128 người nhiễm HIV, 3.841 bệnh nhân AIDS và 1.498 người tử vong do AIDS. Việt Nam ước tính đến năm 2011 có khoảng 311.500 người bị nhiễm căn bệnh thế kỷ này [33]. Số lượng người nhiễm HIV/AIDS tập trung chủ yếu ở các thành phố lớn và điển Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 9 hình là thành phố Hồ Chí Minh với 42.454 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống, tiếp theo là Hà Nội với 16.830 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống, Thái Nguyên với 5.206 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống….[1] [2]. Cho đến hết 11/2010, đã có trên 74% số xã, phường và 97,8% số quận/huyện trong toàn quốc đã có số người nhiễm HIV/AIDS [3]. Phương thức lây truyền HIV ở nước ta chủ yếu là qua đường tình dục và tiêm chích ma túy. Phân tích hình thái nguy cơ lây nhiễm cho thấy, trong số những người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 9 tháng đầu năm 2010 có 49% bị nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và 10% không rõ đường lây [2][3]. Hình 1.3: Ước tính số trường hợp nhiễm HIV/AIDS tại TP.HCM và Việt Nam từ 2006-2010 1.1.4. Dịch tễ học 1.1.4.1. Đƣờng lây Cho đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện HIV có trong: tinh dịch, chất nhờn Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 10 âm đạo, máu, các yếu tố đông máu, huyết tương, nước bọt, nước tiểu, dịch não tủy, nước mắt và sữa mẹ. Tuy nhiên chỉ có 3 phương thức lây truyền được xác định là: - HIV qua đường tình dục khác giới chiếm 71%, qua đường tình dục đồng giới (nam) chiếm 15%. Nguy cơ lây nhiễm HIV tăng lên khi có bệnh lý gây viêm nhiễm ở bộ phận sinh dục, có vết sây xát xảy ra khi giao hợp hoặc có quan hệ tình dục với nhiều người. - Lây truyền qua đường máu: Do truyền máu và các sản phẩm của máu, ghép tạng… không kiểm soát được HIV, do dùng chung bơm, kim tiêm (nguy cơ cao với người tiêm chích ma túy), do dùng chung kim châm cứu, kim xăm da v…v… - Lây truyền từ mẹ sang con: Người mẹ nhiễm HIV có thể truyền cho con trong thời kỳ mang thai, trong khi đẻ và cũng được xác nhận có thể lây sau khi đẻ do trẻ bú sữa mẹ. Ngoài các phương thức lây truyền như trên, hiện nay chưa xác định được các phương thức lây khác như đường hô hấp, qua muỗi hoặc côn trùng đốt, hôn, dùng chung bát đũa……. [5]. 1.1.4.2. Cơ chế sinh bệnh HIV có ái tính chủ yếu với tế bào lympho T CD4 . Ngoài ra HIV còn có thể xâm nhập vào nhiều loại tế bào khác nhau như: Lympho bào B, đại thực bào, tế bào nguồn, tế bào hình sao, tế bào xơ non…v v… HIV gây hủy diệt các tế bào T CD4 , do vậy dẫn đến suy giảm miễn dịch bao gồm cả miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể. Các rối loạn chính trong đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS gồm: - Giảm tế bào lympho T toàn phần, đặc biệt là CD4 giảm nặng, tỷ lệ CD4/CD8 giảm (< 1). - Giảm chức năng các tế bào miễn dịch: giảm hoặc mất đáp ứng da, giảm khả năng tăng sinh tế bào đối với các chất gây phân bào và kháng nguyên, giảm [...]... nghiệp 2.3 Phƣơng pháp nghiên < /b> cứu < /b> 2.3.1 Nhân b n gen < /b> mã < /b> hóa < /b> protein gp120 < /b> phân < /b> type < /b> B của < /b> virus < /b> HIV < /b> b ng phƣơng pháp PCR Gen < /b> mã < /b> hóa < /b> protein gp120 < /b> phân < /b> type < /b> B (gp12 0B_ EX) được khuếch đại và gắn trình tự nhận biết của < /b> hai enzyme giới hạn BamH I và Xho I b ng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi GP120BAM và GP120XHO.Thành phần phản ứng được trình b y ở b ng: B ng 2.2: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ H2O... các hãng BioLab, BioRad, Fermentas Khoa Công nghệ sinh học 29 Khóa luận tốt nghiệp 2.2.2 Mồi nhân gen < /b> Các cặp mồi dùng trong nghiên < /b> cứu < /b> đã được chúng tôi thiết kế dựa trên trình tự gen < /b> gp120 < /b> của < /b> virus < /b> HIV-< /b> 1 phân < /b> type < /b> B Mồi được tổng hợp tại hãng Invitrogen, Mỹ có trình tự như trong b ng 2.1: B ng 2.1: Mồi đặc hiệu dùng để nhân đoạn gen < /b> mã < /b> hóa < /b> protein gp120 < /b> phân < /b> type < /b> B lưu hành ở Việt Nam Nhiệt Tên... trúc kháng < /b> nguyên < /b> dễ biến đổi [10] 1.2.3 Phân < /b> loại và phân < /b> type < /b> HIV < /b> là 1 virus < /b> có tính thay đổi cao, đột biến dễ dàng Điều này có nghĩa là ngay trong cơ thể của < /b> 1 người b nhiễm cũng có nhiều chủng HIV < /b> Dựa trên những điểm tương tự về di truyền, ta có thể phân < /b> loại vô số các chủng virus < /b> khác nhau đó thành type,< /b> nhóm và phân < /b> type < /b> Hình1.5: Sơ đồ phân < /b> type < /b> virus < /b> HIV < /b> Có 2 type < /b> HIV < /b> [21]: HIV-< /b> 1: Là loại virus.< /b> .. trình sống của < /b> virus < /b> HIV < /b> Sau thời gian b nhiễm virus,< /b> những tế b o b nhiễm virus < /b> sẽ di chuyển đến tổ chức lympho ngoại vi, tại đây virus < /b> nhân lên nhanh chóng Quá trình này diễn ra qua các giai đoạn theo sơ đồ vòng đời của < /b> virus < /b> HIV < /b> (Hình 1.10), bao gồm các giai đoạn: Giai đoạn b m và gắn kết vào mặt tế b o: HIV < /b> b m vào b mặt tế b o cảm thụ nhờ sự phù hợp giữa thụ thể đặc hiệu tế b o gp120 < /b> của < /b> virus < /b> Trong... b o chủ kìm hãm sự tái b n virus < /b> vào các virion mới hình thành [10] vpu : mã < /b> hóa < /b> protein vpu (Viral Protein U : protein U của < /b> virus)< /b> , có tác dụng tăng cường sự giải phóng virus < /b> khỏi tế b o, làm giảm sự biểu < /b> hiện < /b> của < /b> CD4, MHC I trên b mặt tế b o [10] vpr: mã < /b> hóa < /b> protein vpr (Viral Protein R : protein R của < /b> virus)< /b> , có tác dụng tăng cường sự tái b n virus < /b> trong các tế b o ban đầu, là tín hiệu định... thể của < /b> tế b o chủ và trở thành một tiền virus < /b> (provirus) Tiền virus < /b> này sẽ như một gen < /b> của < /b> tế b o và truyền sang cho thế hệ khác khi có sự phân < /b> b o, hoặc được phiên mã < /b> thành RNA thông tin, tổng hợp protein Khoa Công nghệ sinh học 13 Khóa luận tốt nghiệp của < /b> virus < /b> để hình thành một virus < /b> hoàn chỉnh [10] Mang đặc điểm của < /b> Lentivirus - Phát triển chậm - Không biến đổi tế b o nhưng lại làm tiêu hủy tế b o... thể của < /b> tế b o chủ DNA virus < /b> được tích hợp này sau đó có thể nằm yên không hoạt động trong giai đoạn tiềm tàng của < /b> quá trình xâm nhiễm HIV.< /b> Tiền virus < /b> cũng có thể phiên mã < /b> để tạo thành RNA genome và các mRNA dùng trong quá trình tạo thành virus < /b> mới.Trong quá trình phiên mã,< /b> nhờ RNA-pol II của < /b> tế b o, tiền virus < /b> được tích hợp sẽ được phiên mã < /b> thành các b n sao RNA B n phiên mã < /b> ban đầu có chiều dài gần b ng... dịch HIV < /b> nặng nề nhất; khoảng một nửa các trường hợp nhiễm hiện < /b> nay là do phân < /b> chủng này Khoa Công nghệ sinh học 15 Khóa luận tốt nghiệp Hình1.6: Phân < /b> b các phân < /b> type < /b> HIV-< /b> 1 M theo vùng địa lý ( 2008 ) Về mặt lịch sử, phân < /b> type < /b> B là phân < /b> type < /b> thường gặp nhất tại châu Âu, châu Mỹ, Nhật, và châu Úc Hiện < /b> nay ít nhất 25 % những trường hợp mới nhiễm tại châu Âu là do các phân < /b> type < /b> mới khác Ở Việt Nam, 97%... liệu di truyền để tạo thành 1 virus < /b> lai (hybrid) mới Những chủng nào gây nhiễm được cho người khác sẽ được gọi là CRFs (các thể tái tổ hợp lưu thông = circulating recombinant forms) Hiện < /b> nay đã phát hiện < /b> có đến 30 CRF [22] Các phân < /b> type < /b> HIV < /b> -1, CRF được phân < /b> b không đều trên thế giới, trong đó các phân < /b> type < /b> B và C phân < /b> b rộng rãi nhất Phân < /b> type < /b> C chủ yếu gặp tại miền đông và Nam Châu Phi, Ấn độ và... trị phát hiện < /b> sớm b nh 50-70% (+) ở giai đoạn sơ nhiễm Khi có hội chứng AIDS đầy đủ 50-70% (+) trở lại B nh tiến triển trầm lặng thì kháng < /b> nguyên < /b> P24 giảm dần theo thời gian - Dấu hiệu gián tiếp suy giảm miễn dịch [6][16] Khoa Công nghệ sinh học 28 Khóa luận tốt nghiệp Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên < /b> cứu < /b> Plasmid mang gen < /b> gp120 < /b> của < /b> phân < /b> type < /b> B lưu hành ở Việt Nam (mẫu . cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên gp120 của virus HIV phân type B lưu hành tại Việt Nam ; chúng tôi hi vọng có thể phục vụ cho việc sản xuất các kit chẩn đoán HIV cho b nh nhân tại Việt Nam. các phân type HIV lưu hành tại Việt Nam, cần nghiên cứu sản xuất các kit chẩn đoán dựa trên type virus tại nước ta. Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 4 Với đề tài: Nghiên cứu. hợp lưu thông = circulating recombinant forms). Hiện nay đã phát hiện có đến 30 CRF [22]. Các phân type HIV -1, CRF được phân b không đều trên thế giới, trong đó các phân type B và C phân b