TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA VÙNG PROMOTER GENE RECK TRONG UNG THƯ KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy SVTH: Nguyễn Thị Thúy Tài Tp. Hồ Chí Minh, tháng 6/2014 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Mở TP.HCM, khoa Công nghệ sinh học đã giúp để em thực hiện đề tài này. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY và ThS. TRƯƠNG KIM PHƯỢNG đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và ân cần với những lời khuyên quý báu trong suốt quá trình em thực hiện đề tài. Em xin cảm ơn các thầy, (cô) ở phòng thí nghiệm Sinh học phân tử đã hướng dẫn và giúp để em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em xin cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, bạn bè đã luôn động viên, chia sẽ và giúp đỡ em trong thời gian học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn! Ngày , tháng 06, năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thúy Tài Mục Lục DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3 I. Tổng quan bệnh ung thư 3 I.1. Ung thư 3 I.2. Nguyên nhân gây ung thư 7 I.3. Ung thư vú 8 I.4. Ung thư cổ tử cung 8 II. Sự biến đổi “epigenetics” và methyl DNA 9 II.1. Sự biến đổi “epigenetics” 9 II.2. Đảo CpG 9 II.3. Sự methyl hóa DNA 10 III. Tổng quan về gene RECK và protein RECK 12 III.1. Gene RECK 12 III.2. Cấu trúc protein 13 III.3. Cơ chế giảm kiểm soát của RECK trong ung thư 14 III.4. Tình hình nghiên cứu về methyl hóa gene RECK 15 IV. Các phương pháp nghiên cứu về sự methyl hóa DNA 17 IV.1. MSP (Methylation-Specific PCR) : 17 IV.2. Phương pháp BSP (Bisulfite Sequencing PCR) 18 Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 I. VẬT LIỆU 19 II. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 II.1. Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico 19 II.2. Khảo sát thực nghiệm quy trình MSP trên gene RECK 20 Chương III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 28 I. Kết quả khai thác dữ liệu và khảo sát in silico 28 I.1. Khai thác dữ liệu 28 I.2. Kết quả khảo sát in silico 31 II. Kết quả nghiên cứu thực nghiệm 41 II.1. Nội dung nghiên cứu thực nghiệm 41 II.2. Kết quả tách chiết DNA 42 II.3. Thực hiện phản ứng MSP sử dụng DNA bệnh phẩm 42 II.4. Thử nghiệm MSP trên các mẫu DNA bệnh phẩm ung thư vú và ung thư cổ tử cung 44 II.5. Giải trình tự mẫu đại diện 50 Chuơng IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 I. Kết luận 52 II. Đề nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT WHO World Health Organization IARC International Agenecy for Research on Cancer NCBI National Center for Biotechnology Information IUUC Hiệp hội phòng chống ung thư thế giới RECK Reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs SAM S-denosyl-L-methionine BRCA Breast cancer susceptibility DNMT Enzym methyltransferase MMP Metalloproteinase matrix ECM Extracellular matrix TIMP Tissue inhibitor of metalloproteinase EGF Epidermal Growth Factor K-ras Kirsten-ras/ V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog GPI Glycosylphosphatidylinositol Asn Asparagin SPIs Serpins MSP Methylation-Specific PCR BSP Bisulfite sequencing PCR Q-MSP Quantitative methylation-Specific PCR MS-SSCA Methylation-sensitive single-strand conformation analysis OD Optical Density ii UV Ultraviolet, tia tử ngoại PCR Polymerase Chain Reaction Tm Nhiệt độ nóng chảy RNA Ribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid MF Mồi xuôi methyl MR Mồi ngược methyl UF Mồi xuôi unmethyl UR Mồi ngựơc unmethyl CCDN Cyclin D NSAID Non-steroidal anti-inflammatory drug ERK Extracellular signal-regulated kinase HER-2/neu Human Epidermal growth factor Receptor HDAC Histone deacetylase TSA Trichostatin A SDS Sodium Dodecyl Sulfate EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid HSC Hematopoietic Stem Cell SCC Somatic Cell Count iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR Bảng 3.1: Phương pháp sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK. Bảng 3.2: Tỉ lệ methyl hóa gene RECK trong các loại ung thư Bảng 3.3: Bộ mồi MSP (MR-MF; UR-UF) Bảng 3.4: Kết quả đánh giá mồi MSP (MF1-MR1; UF1-UR1) Bảng: 3.5: Kết quả đo OD Bảng 3.6: Kết quả khảo sát sự methyl hóa trên vùng promoter gen RECK đối với 6 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 3 mẫu u sợi tuyến Bảng 3.7: Kết quả khảo sát sự methyl hóa trên vùng promoter gen RECK đối với 15 mẫu bệnh phẩm xét nghiệm nhiễm HPV iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Tình hình ung thư trên thế giới Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh ung thư ở các khu vực trên thế giới Hình 1.3: Methyl hóa ADN và điều hòa biểu hiện gene Hình 1.4: Vị trí gene RECK Hình 1.5 Chức năng kiểm soát của RECK Hình 1.6: Cấu trúc protein RECK Hình 1.7: Cơ chế giảm kiểm soát RECK trong ung thư Hình 1.8. Phương pháp MSP Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt biến đổi bisufite Hình 2.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Hình 3.1: Tỉ lệ các phương pháp sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK Hình 3.2: Tần số methyl hóa gene RECK trung bình trong một số loại ung thư Hình 3.3: Vị trí, cấu trúc gene RECK và promoter gene RECK Hình 3.4: Trình tự đảo CpG3 và sự phân bố của một số nhân tố phiên mã Hình 3.5: Vị trí bắt cặp của bộ mồi MSP (MR-MF; UR-UF)trên đoạn trình tự đích Hình 3.6: Kết quả Annhyb cặp mồi MF-MR trên vùng promoter của gene RECK Hình 3.7: Kết quả Annhyb cặp mồi UR-UF trên vùng promoter của gene RECK Hình 3.8: Kết quả điện di mẫu B2 Hình 3.9: Kết quả khảo sát gradient nhiệt độ trên mẫu B1 v Hình 3.10: Kết quả khảo sát gradient nhiệt độ trên mẫu B2 Hình 3.11: Kết quả điện di mẫu B3 Hình 3.12: Kết quả điện di mẫu B4, B5, B6 Hình 3.13: Kết quả điện di mẫu BP4, BP5 Hình 3.14: Kết quả điện di mẫu C1, C2 Hình 3.15: Kết quả điện di mẫu: C3, C4, C5, C6 Hình 3.16: Kết quả điện di mẫu C9 Hình 3.17: Kết quả điện di mẫu C10, C11, C12 Hình 3.18: Kết quả điện di mẫu C13, C14, C15, C16 Hình 3.19: Kết quả giải trình tự. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization –WHO), ung thư là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người trên toàn thế giới. Hiện nay, trong số hơn 200 dạng bệnh ung thư khác nhau, ung thư vú và ung thư cổ tử cung là các loại bệnh ung thư thường gặp nhất [63, 18]. Theo báo cáo của tổ chức Y Tế Thế giới WHO có khoảng 8.2 triệu người chết vì ung thư trong năm 2012 và hơn 70% số ca tử vong là ở các nước có thu nhập thấp và thu nhập trung bình. Gene RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) nằm trên NST 9 ( 9p13.3), có kích thước là 88.023 bp, mã hóa cho lớp màng glycoprotein hình mỏ neo giúp ngăn chặn sự xâm lấn của khối u và sự hình thành mạch bằng cách ức chế sự phân giải protein của Maxtri metalloproteinase -9,2,14 ( MMP-9, 2, 14) [47]. Gene RECK biểu hiện nhiều ở các mô lành nhưng lại rất ít gặp ở những dòng tế bào ung thư hay dòng nguyên bào sợi bị biến đổi bởi gene gây ung thư. Ở trạng thái bình thường, RECK hoạt động có tác dụng kiềm chế khối u. Trong trường hợp vùng promoter bị methyl hóa thì hoạt động của RECK bị ức chế hoàn toàn dẫn đến khối u tăng sinh không kiểm soát và di căn sang các tế bào lành. Trên thế giới, nhiều nghiên cứu mức độ methyl hóa vùng promoter của gene RECK đã được công bố ở các loại ung thư khác nhau: ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư phổi, [36, 32, 29 ]. Do vậy, nhằm tìm hiểu mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK ở các tế bào ung thư (ung thư vú, ung thư cổ tử cung…) chúng tôi thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK trong ung thư”. Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để xác định gene RECK có phải là dấu chứng sinh học tiềm năng trong tiên lượng, chẩn đoán và hỗ trợ thông tin cho việc phòng chống và điều trị các bệnh ung thư nói chung, cụ thể là bệnh ung thư vú và ung thư cổ tử cung. . methyl hóa vùng promoter gene RECK ở các tế bào ung thư (ung thư vú, ung thư cổ tử cung…) chúng tôi thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp: Khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK trong. dụng để khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK Hình 3.2: Tần số methyl hóa gene RECK trung bình trong một số loại ung thư Hình 3.3: Vị trí, cấu trúc gene RECK và promoter gene RECK. cứu mức độ methyl hóa vùng promoter của gene RECK đã được công bố ở các loại ung thư khác nhau: ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư phổi, [36, 32, 29 ]. Do vậy, nhằm tìm hiểu mức độ methyl