i LI CM N u tiên, con xin cm n ba má đư sinh con ra, dy d, nuôi nng cho con n hc nên ngi K đn, em xin gi li cm n chơn thƠnh đn tt c thy cô trong khoa Công ngh sinh hc đư truyn đt cho em kin thc trong sut quá trình hc tp. Em xin gi li cm n sơu sc đn cô Lê Th Kính đư hng dn em thc hin đ tài. Em cm n anh Hi, ch Trang, anh Khánh cng nh các ch trong t Nuôi Cy Mô ca Trung Tâm Nghiên Cu Ging Cây Trng Min Nam đư luôn giúp đ em trong thi gian qua. ii Mc lc I. TNG QUAN 1 1.1. Tình hình nghiên cu nuôi cy bao phn lúa. 1 1.1.1. Tình hình nuôi cy bao phn lúa trên th gii 1 1.1.2. Tình hình nuôi cy bao phn  Vit Nam 4 1.2. C s khoa hc ca nuôi cy in vitro 6 1.2.1. Tính toƠn nng ca t bào 6 1.2.2. S phân hoá và phn phân hoá t bào 7 1.2.3. C ch di truyn thông qua các th h t bào 8 1.2.4. Môi trng nuôi cy (môi trng dinh dng) 9 1.2.5. iu kin vô trùng 10 1.2.6. iu kin ánh sáng và nhit đ 10 1.2.7. Vt liu nuôi cy 11 1.3. Các yu t nh hng đn quá trình nuôi cy bao phn lúa 12 1.3.1. Kiu gen ca cây cho bao phn 12 1.3.2. Giai đon phát trin ca bao phn 12 1.3.3. iu kin sinh lý ca cây cho bao phn 13 1.3.4. Nhit đ và thi gian x lỦ đòng 13 1.4. Các giai đon chính trong nuôi cy bao phn 14 1.4.1. Khái nim nuôi cy bao phn 14 1.4.2. Các giai đon chính 15 1.5. K thut đn bi in vitro và công tác ging cây trng 17 1.5.1. Cơy đn bi 17 1.5.2. K thut đn bi trong công tác chn to ging cây trng 18 II. VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 22 iii II.1 Vt liu. 22 II.1.1 a đim và thi gian thí nghim 22 II.1.2 Vt liu 22 II.2 Phng pháp nghiên cu. 22 II.2.1 Kho sát kh nng to mô so (callus) ca mt s kiu gen (thí nghim 1).22 II.2.2 Kho sát kh nng tái sinh cơy ca mt s kiu gen (thí nghim 2). 23 II.2.3 Xác đnh cơy đn bi vƠ đn bi kép. 25 III. KT QU VÀ THO LUN 26 III.1 Kho sát kh nng to mô so ca mt s kiu gen (thí nghim 1). 26 III.2 Kho sát kh nng tái sinh cơy ca mt s kiu gen (thí nghim 2). 28 III.3 Xác đnh cơy đn bi vƠ đn bi kép. 34 IV. KT LUN VÀ  NGH 40 IV.1 Kt lun 40 IV.2  ngh 40 iv Mc lc Hình nh, Bng và Biu đ Hình 1: Chiu dƠi đng lúa cn thu khong 20 cm 24 Hình 2: V trí ly bông lúa t đng lúa 24 Hình 3: Gié lúa thích hp cho nuôi cy bao phn (A), bao phn tách ri (B) (3x) 25 Hình 4: on bông lúa chun b đem cy bao phn 25 Hình 5: Mô so phát sinh t bao phn lúa trên môi trng N6 sau 1 tháng nuôi cy 26 Hình 6: Mô so phát sinh t bao phn lúa s đc chuyn vƠo môi trng tái sinh MS 28 Hình 7: Quá trình phát trin mô so ca t hp lai LL5 29 Hình 10: Mô so cht (t hp lai LL3) 32 Hình 11: Cây bch tng ậ LL5 (2 tun tui) 33 Hình 12: Cơy bình thng ậ LL5 (2 tun tui) 33 Hình 13: Cây bch tng ậLL5 (1 tháng tui) 34 Hình 14: Cơy bình thng ậ LL5 (1 tháng tui) 34 Hình 15: Cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 (A) và LL2 (B) 1 tháng tui34 Hình 16: Cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 45 ngày tui 35 Hình 17: cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 2 tháng tui 35 Hình 18: Cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 3 tháng tui 36 Hình 19: Chun b thu ht 36 Hình 20: S khác bit v kh nng sinh trng và phát trin gia cơy đn bi vƠ đn bi kép, (A) cơy đn bi kép ậ t hp lai LL5, (B) cơy đn bi ậ t hp lai khác 37 Hình 21: S khác bit v hoa ca cơy đn bi kép ậ t hp lai LL5 (A) vƠ cơy đn bi ậ t hp lai khác (B) 38 Bng 1: Bng b trí nghim thc 22 Bng 2: nh hng ca kiu gen đn kh nng to mô so 26 v Bng 3: nh hng ca kiu gen đn kh nng to cây tái sinh 29 Biu đ 1: nh hng ca kiu gen đn kh nng to mô so 27 Biu đ 2: nh hng ca kiu gen đn kh nng phát trin ca mô so 30 Biu đ 3: nh hng ca kiu gen đn s bit hóa ca mô so 31 Biu đ 4: nh hng ca kiu gen đn kh nng to cây tái sinh 33 Bng vit tt Cs: cng s IAA: Indole-3-acetic acid NAA: 1-Naphthaleneacetic acid BA: 6-Benzylaminopurine 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid vi T VN  Cây lúa (Oryza sativa L.) lƠ cơy lng thc gi vai trò quan trng hƠng đu. Mi nm, khong 1/2 dân s th gii s dng lúa go lƠm lng thc chính. Lúa đc trng ph bin  các nc Châu Á, Châu Phi, Châu M La Tinh. i vi các nc Chơu nh: n , Trung Quc, Indonesia, Bangladesh, Myanmar, Thái Lan và Vit Nam thì lúa go lƠ cơy lng thc đc bit quan trng trong đi sng con ngi. Trong nhng nm gn đơy, cùng vi đƠ tng dơn s, s phát trin mnh m ca nn công nghip vƠ đô th hoá nông thôn làm cho din tích đt trng trt ngày càng thu hp li.  đáp ng đ nhu cu lúa go ca ngi tiêu dùng vƠ an ninh lng thc quc gia, các nhà to ging phi tìm cách lƠm tng nng sut, sn lng lúa trên din tích đt trng không th m rng. Phng án s dng các bin pháp k thut thâm canh trên nhng ging lúa cao sn, chu thâm canh là thích hp nht. Bng phng pháp lai to truyn thng các nhà to ging đư có nhiu thành công vi nhng ging mi có nng sut và sn lng cao. Song vic s dng phng pháp này tuy có to ra nhng t hp lai nng sut cao nhng đ thun cha n đnh. Mt khác, nu áp dng phng pháp lai to truyn thng thì phi mt khong 10 v (4-5 nm) mi có đc dòng thun. Trong nhng nm gn đơy, vic ng dng bin pháp nuôi cy bao phn to các dòng đn bi kép, nhanh chóng to các ging lúa thun có nng sut cao, chng chu tt, đư thu đc nhiu kt qu. ó lƠ phng pháp to dòng thun nhanh (1 nm) và hiu qu nht.  thành công trong vic to các dòng thun bng k thut nuôi cy chúng ta phi xác đnh đc nhng yu t v kiu gen, môi trng dinh dng, các tác nhân vt lý, hoá hc… Trong đó, kiu gen là yu t đc nhiu nhà khoa hc đt lên hƠng đu (Sharmin S. 2003, Sharmin S.2004) do nó nh hng rt ln đn kh nng to mô so cng nh s lng, cht lng cây tái sinh. Tuy nhiên, đó lƠ nhng nghiên cu  nc vii ngoài, trong khi các ging lúa  nc ta phát trin  nhit đ, điu kin sinh trng khác nhau. Do đó, yu t kiu gen cn đc kho sát li nhm xác đnh phng pháp nuôi cy bao phn có hoàn toàn thích hp cho tt c các kiu gen ca lúa  nc ta hay không, hay ch ti u cho mt s kiu gen thôi. Xut phát t nhng vn đ trên, chúng tôi tin hành thc hin đ tài: Kho sát kh nng phát sinh mô so (callus) và tái sinh cây bng phng pháp nuôi cy bao phn in vitro trên mt s t hp lai ca lúa (Oryza sativa L.)”. 1 I. TNG QUAN 1.1. Tình hình nghiên cu nuôi cy bao phn lúa. 1.1.1. Tình hình nuôi cy bao phn lúa trên th gii Nm 1968 Nishi vƠ cng s là nhng tác gi đu tiên thƠnh công trong lnh vc nuôi cy bao phn trên nhng cây mt lá mm sau khi công b kt qu tái sinh cây lúa hoàn chnh t mô so. Sau đó, hƠng lot các tác gi cng công b nhng kt qu kh quan nh: Chu et. al (1975), Chen (1977),. Kt qu to cơy đn bi và lng bi thun thu đc ch yu  loài ph Japonica, đi vi loài ph Indica thì kt qu cha cao. Các ging lúa có ngun gc h ph Indica là nhng ging lúa khó tính trong vic nuôi cy bao phn.  tin ti thành công, các nhà khoa hc đư vƠ đang tìm cách xác đnh s nh hng ca các yu t có tác đng trc tip hoc gián tip đn quá trình nuôi cy. Các yu t đó lƠ: Kiu gen ca cây cho phn, giai đon phát trin ca cây trong thi đim ly mu, thành phn môi trng nuôi cy, các yu t vt lý nh nhit đ, ánh sáng * nh hng ca kiu gen cây cho bao phn: S thay đi ca tn s to mô so và kh nng tái sinh ca mô so  phn hoa ph thuc phn ln vào kiu gen ca cây. Kt qu quan sát ca Sharmin S. (2004) cho thy s khác bit ca các kiu gen kéo theo s khác bit trong kh nng nuôi cy lúa. Kiu gen loài ph Indica phát trin và to mô so kém so vi loài ph Japonica. Theo Mathias và Fukki (1986) kh nng tái sinh ca cây lúa trong nuôi cy t bào b chi phi bi s tng tác t bào cht, nhân ca chính nó. * nh hng ca giai đon phát trin ca cây trong thi đim ly mu Các tác gi Oono (1975), Lin (1976), Chen (1977) cho thy: mu bao phn đc ly vào thi đim các tiu bào t trong bao phn đang  giai đon đn bƠo mun là tt nht. Bao phn  giai đon t th không có kh nng phát trin trong môi trng nuôi cy in vitro, Bao phn  giai đon đn bƠo sm phát trin kém. 2 Ht phn ch có th phát trin tt khi đư tách ra khi t t (giai đon đn bƠo gia đn đn bƠo mun). *nh hng ca nhit đ và thi gian x lý đòng Kêt qu nghiên cu ca Zhou vƠ Cs (1983) đư cho thy rng: X lỦ đòng  nhit đ thp rt có hiu qu trong nuôi cy bao phn lúa. iu kin lnh lƠm tng kh nng to cây xanh.  Chaleff và Cs (1975) x lỦ đòng  6 o C trong 5 ngày  Hu vƠ Cs (1978) đư x lỦ đòng lúa  nhit đ 10 0 C trong thi gian 4 - 8 ngày.  Matitin vƠ Drimo Millo (1981) đư tin hành x lỦ đòng lúa  nhit đ 2 ậ 4 o C trong thi gian 48h.  Gupta vƠ Borthakeu (1987) đư x lỦ đòng lúa  nhit đ 10 0 C trong thi gian 11 ngày.  Guapta, Quimio và Zapata (1990) x lỦ đòng  6-8 o C trong thi gian 8 ngày.  Rush và cng s (1982) đư tin hành x lỦ đòng lúa  nhit đ 40 o C trong thi gian 15 phút.  Nm 1886, Torrizo x lỦ đòng  35 o C trong 15 phút cng cho kt qu kh quan. Nói chung, đư có nhiu thí nghim nghiên cu v s nh hng ca nhit đ và thi gian x lỦ đòng đn kt qu nuôi cy bao phn lúa. Kt qu nghiên cu ca các tác gi cho thy rng x lỦ đòng  nhit đ khác nhau s cho nhng kt qu nuôi cy khác nhau * nh hng ca nng đ Cacbon đn quá trình to mô so và tái sinh cây. Nng đ cacbon có th lƠm thay đi t l hình thành mô so và kh nng tái sinh cây trong nuôi cy bao phn lúa. Chen (1978) cho bit đng có tác dng lƠm thay đi áp sut thm thu ca môi trng nuôi cy. Nng đ đng trong môi trng nuôi cy t 6 - 8% s lƠm tng c hai quá trình hình thành mô so và tái sinh tip theo. 3 Nm 1988 Kim vƠ Paghavan thông báo rng: T l hình thành mô so t bao phn s gim đi khi nng đ đng trong môi trng nuôi cy cao (8 -12%) * nh hng ca cht điu hoà sinh trng đn quá trình to mô so và tái sinh cây. Trong k thut nuôi cy bao phn lúa, các cht điu hoà sinh trng có th s dng  dng đn hay kt hp theo nhng t l khác nhau Nm 1980, Khi nuôi cy bao phn lúa Japonica, Yang và cng s đư s dng kt hp NAA 4mg/l + 2,4D 1mg/l + IAA 2mg/l + Kinetin 3mg/l . Kt qu cho thy rng nu môi trng to mô so có cha 2,4D nng đ 1mg/l thì mô so d dàng tái sinh thành cây. Theo Wasakd (1982): IAA xúc tin quá trình hình thành r, S kt hp các auxin: IAA, NAA, Kinetin mt cách hp lý s xúc tin mnh m quá trình phân hoá t bào và tái sinh cây xanh. Nhìn chung, các cht tham gia vào môi trng nuôi cy bao phn lúa nh cht điu hoà sinh trng, mui, đng, st, Vitamin đu có s nh hng ln nhau và nh hng chung đn kt qu ca quá trình nuôi cy. * nh hng ca các yu t vt lý trong môi trng Các yu t vt lý ca môi trng bao gm:  Trng thái vt lý ca môi trng  dng rn hay lng   pH môi trng   m không khí  Ánh sáng và nhit đ ca phòng nuôi cy Các yu t trên tác dng trc tip đn s hình thành mô so và kh nng tái sinh chi. Kt qu nghiên cu lúa mì ca Bjarmsta (1989) cho thy rng x lý ánh sáng cng đ cao s kìm hãm quá trình to mô so nhng li kích thích quá trình to cây [...]... t ng d a vào s phân hóa và ph n phân hóa c a t a t bào th c v ng i ta th tính u khi n s phát sinh hình thái c a mô nuôi c y, ng b sung vào môi ng nuôi c y 2 nhóm ch u ti t sinh tr ng th c v t là auxin và cytokinin N u t l auxin/cytokinin th p thì s phát sinh hình thái theo h ng t o ch i; n u t l này cao thì t o thành r , còn khi t l này cân b ng thì s phát sinh theo h ng t o mô s o (Lê Tr n Bình, 2004)... i và dòng thu n cây lúa Nh k thu t nuôi c y bao ph n có th rút ng n th i gian ch n gi ng m i xu ng t n 6 th h và t o ra hàng lo t các dòng thu n m i Thành t u nuôi c y mô h a 19 h n nhi u tri n v tách r i i v i ch n t o gi ng lúa là tái sinh cây lúa t nuôi c y h t ph n c 2d c Japonica và Indica do Raina và Irfan công b c tái sinh t 80.000 h t ph n nuôi c 3.5 cm R t nhi ng kính c tái sinh t h t ph n... lai nào có kh m ng t o mô s o t t s cho r ng mô s c l i Trong thí nghi m này thì t h p lai LL5 cho s ng mô s o cao nh t và t h p lai LL 3 cho s ng mô s o th p nh t K t qu thí 27 nghi m trên phù h p v i nh nh nghiên c u c a Sarmin S., 2004 khi tác gi cho r ng ki u gen ng tr c ti p n kh o mô s o (Hình 6) Hình 6: Mô s o phát sinh t bao ph n lúa s sinh MS c chuy ng tái 28 B ng 3: ng c a ki n kh o cây tái. .. u nuôi c y nh nh sinh ng, ch i, bao ph n, gieo qua h t, thân m 11 1.3 Các 1.3.1 Ki u gen c a cây cho bao ph n nuôi c y có nh h ng r t l n k t qu nuôi c y Nuôi c y bao ph n c a các gi ng lúa thu c loài ph Japonica (k c không x lý l nh tr t t l thành cây th ng h p y bao ph n c a các gi ng lúa thu c loài ph Indica Chen và Lin (1981) còn th y r ng t l bao ph n t o callus, kh l cây xanh /cây b ch t ng và. .. t o thành cây lúa t h t ph n b ng ph pháp nuôi c y in vitro Sau nhi n hành nghiên c u v nuôi c y bao ph H u H và Nguy n ng k t lu n sau: - Trong mô túi ph n có ch t c ch - Gi a phôi dinh d nh h ng t i s phát tri n h t ph n ng và h t ph n ho c là gi a các phôi v i nhau luôn luôn có s c nh tranh làm c ch quá trình tái sinh cây - Trong môi ng nuôi c y, phôi dinh d ph n tách r i d ng nh b i phát tri n... loài Lan, môi ng MS thích h p cho 9 các loài cây thân th o và m t s loài cây thân g sinh tr ng nhanh nh Keo, B ch ng WMP ch thích h p cho các loài cây thân g (Tr Tu thu c vào t lo i môi it ng c th , trong m n nuôi c y, mà l a ch n ng thích h p thì m i có k t qu kh quan Thông th d ng môi ng H5 và môi 97) ng, ng i ta hay s ng N6 cho nuôi c y bao ph n lúa (Sharmin S., 2004) Nuôi c y in vitro là nuôi c u... trong phòng nuôi c y 1.4 Khi m u c y trong ng nghi sinh Yêu c u c n này là tái sinh m c nhi u mô s o thì ti n hành c y tái ng s phát tri n c a mô nuôi c y 15 c u khi n ch y u d a vào t ng nuôi c nghi ng s d ng ch l c a các h p ch t tái sinh m u nuôi c y trong ng nh, ch i nách, mô s 1.4 t o h s nhân ch i cao nh t, ti n hành c y chuy n các ch m c tái sinh ng m i ng nhân t o các ch ng: tb ng th ch u khi... phòng nuôi cây 1.2 Ánh sáng và nh tr là hai y u t chính có nh h n quá trình sinh ng c a mô nuôi c y (Thái Xuân Du, 2001) 1.2.6.1 Ánh sáng: S phát sinh hình thái c a mô nuôi c y ch u nh h gian chi u sáng, c ánh sáng và ch t l ng t các y u t nh : th i ng ánh sáng.Th i gian chi u sáng tác n quá trình phát tri n c a mô nuôi c y Th i gian chi u sáng thích h p v s các loài cây là 12 18 h/ngày 10 C n s phát sinh. .. c a bao ph n t i th nh h là tr ng r t quan tr c và gi n k t qu nuôi c m tách r i ra và nuôi c iv n h t ph n m ng nuôi c n ph n ng t t nh t u ki n n ng trong môi n 9% (Chen, 1978) Các tác gi Oono (1975), Lin (1976) và Chen (1977) cho th y: M u bao ph n c l y vào th m các ti u bào t trong bao ph là t t nh t Bao ph n n t th không có kh nuôi c y in vitro Bao ph n th phát tri n t n n trong môi ng m phát. .. trình nuôi c y in vitro Môi ng nuôi c y là ngu n cung c p các ch t c n thi t cho s phân chia và phân hoá c a mô t bào trong su t quá trình nuôi c y Vì v y, môi ch t dinh d ng nuôi c y bao g m các nguyên t ng, ngu n các bon, các axitamin, các ch s ch t ph gia Thành ph n dinh d tr ng ph ng, các ch t c n thi t i v i h u h t các loài th c v t, Môi ng, vi l ng dinh d ng t t nh ng, hàm l u hoà sinh tr ng và . lúa chun b đem cy bao phn 25 Hình 5: Mô so phát sinh t bao phn lúa trên môi trng N6 sau 1 tháng nuôi cy 26 Hình 6: Mô so phát sinh t bao phn lúa s đc chuyn vƠo môi trng tái. tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 45 ngày tui 35 Hình 17: cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 2 tháng tui 35 Hình 18: Cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa. (callus) và tái sinh cây bng phng pháp nuôi cy bao phn in vitro trên mt s t hp lai ca lúa (Oryza sativa L.)”. 1 I. TNG QUAN 1.1. Tình hình nghiên cu nuôi cy bao phn lúa. 1.1.1.