Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM VŨ THỊ HẢI NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN TRẦN MỘNG XN (CYMBIDIUM LOWIANUM) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NI CẤY IN VITRO. LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP THÁI NGUN - 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM VŨ THỊ HẢI NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN TRẦN MỘNG XN (CYMBIDIUM LOWIANUM) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NI CẤY IN VITRO. CHUN NGÀNH: LÂM HỌC MÃ SỐ: 60.62.02.01 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS: DƢƠNG MỘNG HÙNG THÁI NGUN - 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận văn này là hồn tồn trung thực, có thực tiễn; chƣa đƣợc bảo vệ ở bất kỳ một hội đồng khoa học hay học vị nào. Tơi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn dều đã đƣợc cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong Luận văn này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Vũ Thị Hải Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Với mong muốn góp phần cơng sức cho sự phát triển giống lan Trần mộng xn, tơi đã th (Cymbidium lowianum) Trong thời gian làm đề tài và viết bản luận văn này, ngồi sự cố gắng lỗ lực của bản thân, tơi đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ. Nhân dịp này tơi xin chân thành cảm ơn về sự giúp đỡ q báu đó. Trƣớc tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo hƣớng dẫn khoa học PGS. TS Dƣơng Mộng Hùng đã trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức q báu cho tơi trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thiện đề tài. Tơi xin cảm ơn các thầy, cơ giáo và Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nơng – Lâm Thái Ngun, Trung tâm học liệu Đại học Thái Ngun đã tạo những điều kiện thuận lợi, cung cấp những tài liệu cần thiết cho tơi hồn thành các nội dung và chƣơng trình mà luận văn đặt ra. Tơi xin cảm ơn Ban giám đốc và cán bộ cơng nhân viên của Vƣờn Quốc gia Hồng Liên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong nghiên cứu, thu thập số liệu và thừa kế các số liệu sẵn có để hồn thành tốt luận văn. Cuối cùng tơi xin cảm ơn các đồng nghiệp trong Bộ phận ni cấy mơ tế bào thực vật, bạn bè và ngƣời thân trong gia đình đã động viên, giúp đỡ tơi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn. Xin trân thành cảm ơn! Thái Ngun, năm 2013 Tác giả luận văn Vũ Thị Hải Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC 1 CHƢƠNG I TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4 1.1 Khái niệm về nhân giống in vitro 4 1.2 Giới thiệu về họ lan 4 n 8 1.4 Thành tựu đạt đƣợc trong ni cấy mơ hoa lan 9 1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới 9 1.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam 10 1.5 Cơ sở khoa học của ni cấy mơ in vitro 12 1.5.1 Dựa trên tính tồn năng của tế bào 12 1.5.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 12 1.6 Quy trình nhân giống in vitro 13 1.6.1 Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ 13 1.6.2 Giai đoạn 2: Ni cấy khởi động 14 1.6.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh 14 1.6.4 Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hồn chỉnh 14 1.6.5 Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngồi điều kiện tự nhiên 15 1.7 Các phƣơng thức nhân giống vơ tính in vitro 15 1.7.1 Hoạt hóa chồi nách 15 1.7.2 Tạo chồi bất định 15 1.7.3 Tạo phơi vơ tính 16 1.8 Một số trƣờng hợp thƣờng gặp trong q trình ni cấy in vitro . 16 1.8.1 Tính bất định về mặt di truyền 16 1.8.2 Sự nhiễm mẫu 16 1.8.3 Sự hóa nâu 17 1.8.4 Hiện tượng thủy tinh hóa 17 1.9 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhân giống in vitro 18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ iv 1.9.1 mẫu cấy 18 1.9.2 Mơi trường ni cấy 18 1.9.2.1 Mơi trường vật lý 18 1.9.2.2 Mơi trường hóa học 19 1.9.3 Các chất điều hòa sinh trưởng 21 1.9.3.1 Auxin 21 1.9.3.2 Gebberelin 22 1.9.3.3 Các Xytokinin 22 1.9.3.4 Ethylene 22 1.9.3.5 Các chất ức chế tăng trưởng 23 1.9.3.6 Kết luận 23 1.9.4 Điều kiện vơ trùng 23 1.9.5 Phòng ni 24 CHƢƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Nội dung nghiên cứu 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phương pháp luận 27 2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể 27 2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp khử trùng vật liệu đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 27 2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của mơi trường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 28 2.2.2.3 Thí nghiệm 3:Nghiên cứu ảnh hưởng của mơi trường ni cấy và nồng độ chất ĐHST Ki và BA đến khả năng tạo protocom 29 2.2.2.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi 30 2.2.2.5 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ 31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ v 2.2.2.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm 32 2.2.3. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 33 2.2.3.1 Phương pháp thu thập số liệu 33 2.2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng của biện pháp khử trùng vật liệu đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 36 3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của mơi trƣờng và nồng độ chất điều hồ sinh trƣởng BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 40 3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ chất ĐHST Ki và BA đến khả năng nhân protocom 43 3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi 46 3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ 49 3.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vƣờn ƣơm 53 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1. Kết luận 59 4.2. Tồn tại 59 4.3. Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 63 Phụ lục 1: Mơi trƣờng Murashige- Skoog (MS, 1962) 63 Phụ lục 2: Mơi trƣờng MS cải tiến (MS*) 64 Phụ lục 3: Mơi trƣờng Vacin &Went (VW) 65 Phụ lục 4: Phân tích kết quả khử trùng mẫu cấy. 66 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ vi Phụ lục 5: Phân tích kết quả ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy. 70 Phụ lục 6: Phân tích kết quả ảnh hƣởng của mơi trƣờng và nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng BA, Ki đến khả năng nhân Protocom. 73 Phụ lục 7: Phân tích kết quả ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA, KI đến khả năng nhân nhanh chồi. 74 Phụ lục 8: Phân tích ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/ cây và chiều dài rễ 75 Phụ lục 9: Phân tích kết quả ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vƣờn ƣơm 77 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Cơng thức khử trùng cho từng loại mẫu 28 Bảng 2.2. Ảnh hƣởng của mơi trƣờng hóa học và nồng độ chất ĐHST đến khả năng tái sinh của hạt lan. 29 Bảng 2.3 Ảnh hƣởng của mơi trƣờng và nồng độ chất ĐHST Ki, BA đến khả năng tạo protocom. 30 Bảng 2.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể chồi. 31 Bảng 2.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến sự ra rễ 32 Bảng 3.1a: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu quả lan bằng HgCl2 36 Bảng 3.1b: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu quả lan bằng cồn 37 Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của 2 loại mơi trƣờng và nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 40 Bảng 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ chất ĐHST Ki và BA đến khả năng nhân protocom. 43 Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi. 47 Bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ. 50 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con tại vƣờn ƣơm. 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TT Tên biểu đồ Trang 1 Biểu đồ 3.1a: Ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ chất ĐHST Ki và BA đến tỷ lệ mẫu tái sinh 44 2 Biểu đồ 3.1b: Ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ chất ĐHST Ki và BA đến hệ số nhân thể chồi 45 3 Biểu đồ 3.1c: Ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ chất ĐHST Ki và BA đến chiều cao trung bình của thể chồi 45 4 Biểu đồ 3.2: Ảnh hƣởng phối hợp của chất ĐHST BA và Ki đến HSNC 47 5 Biểu đồ 3.3a: Ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ 50 6 Biểu đồ 3.3b: Ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến số rễ trung bình/ cây 51 7 Biểu đồ 3.3c: Ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến chiều dài trung bình của rễ 51 [...]... phƣơng pháp ni cấy mơ in vitro - Tìm hiểu ảnh hƣởng của một số yếu tố của mơi trƣờng ni cấy lên sự tạo protocom và sự sinh trƣởng, phát triển của lan Trần Mộng Xn - Xây dựng hƣớng dẫn nhân giống cho lan Trần Mộng Xn bằng phƣơng pháp ni cấy mơ in vitro Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 3 - Ứng dụng kết quả nghiên cứu để triển khai nhân giống đại trà, cung cấp cây giống cho cơng tác bảo... ít giống lan Sapa có hoa đẹp nở đúng dịp tết nên nó đã thực sự thu hút ngƣời tiêu dùng trong và ngồi nƣớc Nhƣng khả Xuất phát từ u cầu thực tế trên, chúng tơi triển khai nghiên cứu đề tài:“ Nghiên n (Cymbidium lowianum) in vitro * Mục tiêu nghiên cứu - Tìm ra các tác nhân khử trùng và nồng độ khử trùng thích hợp - Xác định mơi trƣờng phù hợp để nhân giống lan Trần Mộng Xn bằng phƣơng pháp ni cấy. .. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái niệm về nhân giống in vitro Nhân giống in vitro hay ni cấy mơ đều là thuật ngữ miêu tả các phƣơng thức ni cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa mơi trƣờng xác định ở điều kiện vơ trùng Mơi trƣờng có các chất dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối khống, vitamin, các hoocmon tăng trƣởng và đƣờng Phƣơng pháp ni cấy mơ cho phép tái sinh chồi hoặc các cơ quan từ... đến nay nhân giống in vitro đã thành cơng đối với nhiều chi khác thuộc họ lan, nhƣ: Hồ Điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), Hồng Thảo (Dendrobium), Kim Tuyến (Anoectochilus) và các giống lai của chúng Đó cũng là cơ sở cho những thành cơng của nhiều cơng trình ni cấy mơ tế bào về sau 1.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam Ở nƣớc ta hiện nay đã có một số cơng trình nghiên cứu khá thành cơng về nhân giống lan Năm... về nhân giống lan Năm 2002, tác giả Phạm Thị Liên đã nghiên cứu nhân giống Invitro thành cơng cho một số lồi địa lan ở khu vực phía Bắc Việt Nam và đƣa ra quy trình nhân giống cho lồi Địa lan Hạc đính nâu nhƣ sau: Khử trùng mẫu bằng dd HgCl2 0,1% trong 15 phút Đƣa mẫu đã khử trùng vào mơi trƣờng F + 3% đƣờng saccaro + 0,8% Agar + BAP 1,0 mg/l + Kinetin 0,7% mg/l + IBA 0,5mg/l Mơi trƣờng F + 3% đƣờng... nhân nhanh ngƣời ta thƣờng dùng xytokinin với nồng độ 10-6 – 10-4 [2] Trong một tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thì có thể kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thơng thƣờng cytokynin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi và ngƣợc lại, auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự tạo rễ Các hợp chất thƣờng đƣợc sử dụng là: + 6-Benzyla amino purin (BAP) + Kinetin (Ki) + Zeatin (Z) +Thidiazuron (TDZ) Trong số các... triển hình thái của cây in vitro Khi tiến hành nhân giống in vitro cần tiến hành các biện pháp cân bằng CO2, tạo mơi trƣờng thích hợp cho cây có thể hấp thu và vận chuyển dinh dƣỡng 1.9.2.2 Mơi trường hóa học Mơi trƣờng hóa học là nguồn cung cấp các chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự tăng trƣởng và phân hóa mơ trong suốt q trình ni cấy in vitro Cho đến nay có rất nhiều mơi trƣờng ni cấy đƣợc tìm ra nhƣng... đảm bảo sinh trƣởng phát triển bình thƣờng của cây [14] d Các vitamin Ni cấy in vitro khi chồi tái sinh vẫn tổng hợp đƣợc vitamin nhƣng khơng đủ cho nhu cầu, do vậy phải bổ sung vitamin vào mơi trƣờng ni cấy đặc biệt là vitamin B Tuỳ thuộc vào các loại mơ ni cấy và giai đoạn ni cấy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 21 mà hàm lƣợng vitamin bổ sung vào khác nhau Hai loại vitamin B1 và... tâm Giống và Cơng nghệ sinh học – trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã tiến hành Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhychostylis gigantea) bằng phƣơng pháp ni cấy trong ống nghiệm đạt kết quả tốt Khử trùng quả lan trong 3 phút bởi cồn 70% + 5phút HgCl2 0,1% Mơi trƣờng gieo hạt tốt nhất: Knudson + 30 g/l đƣờng+ 100 g/l khoai tây + 100ml/l nƣớc dừa +7 g/l agar + 0,3 mg/l Kinetin Mơi trƣờng nhân. .. ức chế sinh trƣởng nhƣng nó vẫn đƣợc dùng trong ni cấy mơ tế bào Khi IBA tƣơng tác với BAP sẽ cho hệ số nhân chồi cao hơn khi chỉ dùng BAP riêng rẽ [2] 1.9.3.6 Kết luận Nhƣ vậy, trong ni cấy in vitro sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vƣợt qua các sự cân bằng giữa chất điều hòa với nhau và trong số đó có hai chất chính mà vai trò tạo sinh cơ quan là cơ bản: auxin và xytokinin - Nếu tỷ lệ auxin/ xytokinin cao . TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM VŨ THỊ HẢI NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN TRẦN MỘNG XN (CYMBIDIUM LOWIANUM) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NI CẤY IN VITRO. LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP. NGUN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM VŨ THỊ HẢI NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN TRẦN MỘNG XN (CYMBIDIUM LOWIANUM) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NI CẤY IN VITRO. CHUN NGÀNH: LÂM HỌC MÃ SỐ: 60.62.02.01. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Nội dung nghiên cứu 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phương pháp luận 27 2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể 27 2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh