Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN ĐỨC HÀO THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN ĐỨC HÀO THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Đức Hào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Lò Thanh Sơn, Trường Đại học Tây Bắc đã đóng góp những ý kiến quý báu và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệm để hoàn thành đề tài luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di truyền&Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư phạm –Đại học Thái Nguyên, cảm ơn các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các thí nghiệm của đề tài Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu trường THPT Phù Lưu, Tuyên Quang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoàn thành khoá học. Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn đã động viên khuyến khích giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn. Tác giả luận văn Nguyễn Đức Hào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi Các ký hiệu dùng trong luận văn vi MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Chọn giống đậu tương theo định hướng nâng cao khả năng chịu hạn 3 1.1.1. Chọn giống đậu tương chịu hạn bằng đột biến thực nghiệm 4 1.1.2. Chọn dòng đậu tương chịu hạn bằng công nghệ tế bào thực vật 5 1.1.3. Chọn dòng đậu tương chịu hạn bằng kỹ thuật chuyển gen 6 1.2. Gen liên quan đến tính chịu hạn và gen GmEXP1 ở cây đậu tương 7 1.2.1. Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương 7 1.2.2. Gen GmEXP1 và protein EXP1 ở cây đậu tương 10 1.2.3. Vector chuyển gen ở thực vật 11 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Vật liệu và thiết bị 14 2.1.1. Vật liệu 14 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 15 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 16 2.2. Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1. Phân lập gen 16 2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá 23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3. Phương pháp thiết kế vector 25 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1. Phân lập gen GmEXP1 bằng kỹ thuật RT-PCR 27 3.1.1. Nhân bản đoạn mã hoá của gen GmEXP1 27 3.1.2. Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmEXP1 27 3.1.3. Kiểm tra plasmid trước khi đọc trình tự 33 3.1.4. Kết quả đọc trình tự đoạn mã hoá của gen GmEXP1 34 3.2.2. Kết quả cắt mở vòng plasmid pRTRA7/3 40 3.2.3. Tạo plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp mang gen GmEXP1 41 3.2.4. Kết quả cắt plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp bằng HindIII 42 3.2.5. Kết quả cắt plasmid pCB301 bằng HindIII 43 3.2.6. Tạo vector chuyển gen pCB301 mang cấu trúc GmEXP1 44 3.2.7. Kết quả tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 45 3.3. Kiểm tra hoạt động của vector mang cấu trúc GmEXP1 trên cây thuốc lá mô hình 47 3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc GmEXP1 vào cây thuốc lá 47 3.3.2. Kết quả kiểm tra cây thuốc lá mang gen GmEXP1 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013 3 Bảng 2.1. Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 17 Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR 18 Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 18 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng colony – PCR 20 Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR 20 Bảng 2.6. Thành phần gắn gen GmEXP1 vào vector tách dòng pBT 21 Bảng 2.7. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 22 Bảng 2.8. Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 24 Bảng 3.1. Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen GmEXP1 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Ảnh hạt của giống đậu tương SL1 14 Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu 15 Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hoá gen GmEXP1 28 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm thôi gel đoạn mã hoá của gen GmEXP1 29 Hình 3.3. Ảnh khuẩn lạc 31 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR 32 Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp 33 Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid trước khi đọc trình tự 34 Hình 3.7. Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmEXP1 của giống đậu tương SL1 và AF516879 36 Hình 3.8. Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein EXP1 giữa giống SL1 và AF516879 37 Hình 3.9. Ảnh điện di sản phẩm cắt pBT/EXP1 38 Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 bằng NotI + NcoI 40 Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 bằng HindIII 42 Hình 3.12. Ảnh cắt pCB301 bằng HindIII 43 Hình 3.13. Hình điện di sản phẩm colony- PCR 45 Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR 47 Hình 3.15. Hình ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào cây thuốc lá 49 Hình 3.16. Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ lá cây thuốc lá 50 Hình 3.17. Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmEXP1 từ thuốc lá 51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi CÁC KÝ HIỆU DÙNG TRONG LUẬN VĂN BAP 6- benzyl amino purine bp Base pair DDT Dichloro-diphenyl-trichloroethane DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid đtg Đồng tác giả E. coli Escherichia coli GM Germination medium - Môi trường nảy mầm của hạt GMO Genetically modified organism - Sinh vật biến đổi gen GMP Genetically modified plant - Thực vật biến đổi gen HSG Heat Shock Granules HSP Heat Shock protein - Protein sốc nhiệt IBA Indole 3 - butyric acid IPTG Isopopyl -D-1 thiogalactopyranoside kb Kilo base LB Luria Bertani MS Môi trường nuôi cấy mô cơ bản theo Murashige và Skoog MSI Dung dịch I (muối đa lượng) dùng để pha môi trường MS MSII Dung dịch II (muối đa lượng) dùng để pha môi trường MS MSIII Dung dịch III (sắt) dùng để pha môi trường MS MSIV Dung dịch IV (muối vi lượng) dùng để pha môi trường MS MSV Dung dịch V (vitamin) dùng để pha môi trường MS NST Nhiễm sắc thể OD Optical density Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi RM Rooting medium - Môi trường ra rễ TAE Tris - Acetate - EDTA Taq Thermus aquaticus v/p vòng / phút X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside [...]... xúc của hệ rễ phục vụ tạo dòng đậu tương chuyển gen có hệ rễ phát triển, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành đề tài luận văn là: Thiết kế vector mang cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ phục vụ chuyển gen ở cây đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill)” 2 Mục tiêu nghiên cứu Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ đậu tương và chuyển vào cây thuốc... cDNA từ mRNA; 3.2 Nhân gen GmEXP1 từ cDNA, tách dòng và xác định trình tự đoạn mã hoá của gen GmEXP1 phân lập từ cây đậu tương; 3.3 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 và biến nạp vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.4 Chuyển gen GmEXP1 vào cây thuốc lá Nicotiana tabacum K326 và kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng PCR Số hóa bởi Trung tâm Học liệu... quy trình chuyển gen đối với một số giống đậu tương trong nước và nhập khẩu (Trần Thị Cúc Hòa (2007) [2], tạo cây chuyển gen mang cấu trúc gen P5CS của Nguyễn Thị Thuý Hường năm 2009 [3], … 1.2 Gen liên quan đến tính chịu hạn và gen GmEXP1 ở cây đậu tƣơng 1.2.1 Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc ứng dung... đến sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương Chính vì vậy nghiên cứu tuyển chọn giống đậu tương chịu hạn và nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương là rất cần thiết Theo hướng nghiên cứu này, Nguyễn Thị Thuý Hường và đtg (2009) đã phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam [3] Năm 2003, Lee và đtg đã phân lập được gen GmEXP1. .. hiện gen Sb-HRGP3 dài 1.353 bp ở đậu tương mã hoá hydroxyproline giàu glycoprotein hoạt động mạnh trong mô của vùng chuyển đổi cấu tạo sơ cấp sang cấu tạo thứ cấp của rễ Ở rễ thứ cấp, gen này hoạt động mạnh hơn so với các rễ chính Rất có thể, sự biểu hiện của gen Sb-HRGP3 liên quan đến việc chấm dứt sự kéo dài của rễ [9] Khi nghiên cứu về gen TCS (gen hai thành phần hệ thống có chức năng chống hạn) ở đậu. .. nhiều gen liên quan đến tính chịu hạn đã được phân lập như P5CS, DREB2, DREB5, TCS, CCTδ, Sb-HRGP3, GmEXP1, GmEXP2… đây sẽ là nguồn nguyên liệu làm cơ sở để tạo cây chuyển gen nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương 1.2.2 Gen GmEXP1 và protein EXP1 ở cây đậu tƣơng Lee và đtg (2003) đã nghiên cứu phân lập gen GmEXP1 từ mRNA của cây đậu tương với kích thước 1089 bp và năm 2011 ông và các cộng sự. .. hai gen EXP1 và EXPB2 liên quan đến sự tăng trưởng và phát triển của rễ Lee et al (2003) [23] lần đầu tiên xác định được mối liên quan của expansin với sự kéo dài rễ của cây đậu tương và cho biết mức độ biểu hiện của gen GmEXP1 rất mạnh trong khoảng thời gian hạt nảy mầm từ 1 ngày đến 5 ngày tuổi và giai đoạn kéo dài rễ diễn ra rất nhanh Phân tử mRNA của gen GmEXP1 có nhiều nhất trong phần đầu rễ, ... tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam (2011) [3] Hạn hán luôn là thử thách lớn đối với sự sinh trưởng, phát triển của cây đậu tương, ảnh hưởng lớn tới năng suất sinh học cũng như năng suất kinh tế của cây đậu tương Để khắc phục thực trạng trên thì việc nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương theo hướng tăng cường khả năng biểu hiện của gen liên quan đến tính chịu hạn là biện pháp... kết quả đã đạt được, đậu tương trở thành một trong những cây trồng biến đổi gen được thương mại hóa mạnh nhất Vào năm 1997, cây đậu tương kháng thuốc diệt cỏ glufosinate và gen tăng hàm lượng axit oleic lần đầu tiên được thương mại hóa Trong số diện tích đậu tương chuyển gen thì 75% được trồng ở Bắc Mỹ Riêng ở Mỹ, diện tích đậu tương kháng thuốc diệt cỏ chiếm 85% diện tích trồng cây đậu tương Còn ở. .. chống hạn) ở đậu tương các tác giả Dung Tien Le, Rie Nishiyama, Yasuko Watanabe và đtg (2011) nhận thấy, cơ chế kháng hạn là một trong hai cơ chế liên quan đến rễ và chồi Khảo sát hình thái của 29 hệ rễ cây đậu tương các tác giả đã có nhận xét là sự phát triển của bộ rễ có sự tương quan mật thiết với các cơ chế kháng hạn Sự thích nghi linh hoạt của hệ rễ là một yếu tố quan trọng để duy trì sự sống trong . bộ rễ phục vụ chuyển gen ở cây đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ đậu tương và chuyển. hệ rễ phục vụ tạo dòng đậu tương chuyển gen có hệ rễ phát triển, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành đề tài luận văn là: Thiết kế vector mang cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN ĐỨC HÀO THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill Chuyên