ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THANH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KÉO DÀI RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG Glycine max (L.) Merrill LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THANH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KÉO DÀI RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG Glycine max (L.) Merrill Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Thanh Phương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và NCS.Lò Thanh Sơn, giảng viên Trường Đại học Tây Bắc đã nhiệt tình giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện thí nghiệm của đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể thầy cô thuộc Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi trong học tập, nghiên cứu và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè cùng toàn thể gia đình đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên, ngày 12 tháng 4 năm 2013 Tác giả Nguyễn Thanh Phương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt iv Danh mục các bảng v Danh mục các hình vi MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) 3 1.1.1. Vị trí, nguồn gốc, phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cây đậu tương 4 1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam 7 1.2. ẢNH HƯỞNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG 11 1.3. GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀ GEN GmEXP1 CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 14 1.3.1. Gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tương 14 1.3.2. Gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của cây đậu tương 19 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 24 2.1.1. Vật liệu 24 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 25 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử 26 2.2.2. Phương pháp xác định và phân tích trình tự nucleotid của gen 33 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. KẾT QUẢ NHÂN BẢN ĐOẠN MÃ HÓA CỦA GEN GmEXP1 TỪ HỆ GEN CỦA HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG SL3 VÀ DT84 34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv 3.2. TÁCH DÒNG VÀ SO SÁNH XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN MÃ HÓA CỦA GEN GmEXP1 CỦA HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG SL3 và DT84 36 3.2.1 Kết quả tách dòng cDNA 36 3.2.2. Kết quả xác định trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen GmEXP1 39 3.3. SỰ ĐA DẠNG CỦA GEN EXP1 Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ MỘT SỐ LOẠI CÂY TRỒNG KHÁC 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Tài liệu tiếng Việt 51 Tài liệu tiếng Anh 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT ABA Abcisis acid Bp Cặp bazơ cDNA Sợi bổ sung DNA(ComplementaryDNA) tổng hợp từ mARN nhờ Enzym phiên mã ngược DT84 Giống đậu tương DT84 DNA Deoxyribonucleic Acid DREB Dehydration- Responsive Element Binding dNTP Deoxy ribo nucleotid triphosphates DEPC Diethyl pyrocarbonate Đtg Đồng tác giả EXP Expansin HSP Heat Shock protein - Protein sốc nhiệt Kb Kilo bazơ = 1000 bp LB Luria Bertani LEA Late embryogenesis abundant LTP Lipid Transfer Protein (Protein vận chuyển lipid) MGPT Môi giới phân tử - Molecular chaperone P5CS Pyrroline- 5- Carboxylate Synthetase PCR Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi polymerase RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse trancriptase- Polymerase chain reaction(PCR ngược) SL3 Giống đậu tương Sông Mã- Sơn La. TAE Tris acetat EDTA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam giai đoạn 2005- 2011 9 Bảng 1.2. Tình hình nhập khẩu đậu tương của Việt Nam giai đoạn 2009-2011 10 Bảng 2.1. Nguồn gốc của các giống đậu tương nghiên cứu 24 Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi sử dụng để nhân gen Gm EXP1 27 Bảng 2.3. Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 27 Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR 28 Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 28 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT 30 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng colony – PCR 32 Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR 32 Bảng 3.1. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotid đoạn mã hóa c ủa gen GmEXP1 ở 3 giống đậu tương 42 Bảng 3.2. Vị trí sai khác trong trình tự aminoacid của protein do gen GmEXP1 mã hóa ở 3 giống đậu tương 44 Bảng 3.3. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác của trình tự đoạn mã hóa của gen EXP1 của 8 giống phân tích 47 Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác của trình t ự amino acid mã hóa bởi gen EXP của 8 giống cây trồng 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1. Trình tự của vùng mã hóa của gen GmEXP1 ở đậu tương 21 Hình 1.2. Sơ đồ về gen và protein EXP1 ở cây đậu tương 22 Hình 1.3. Trình tự amino acid vùng bảo thủ DPBB của protein EXP1 22 Hình 1.4. Trình tự amino acid của vùng Pollen allerg của protein EXP1 23 Hình 2.1. Hạt của hai giống đậu tương nghiên cứu 24 Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT 30 Hình 3.1 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR 35 Hình 3.2. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel 35 Hình 3.3. Đĩa nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh 36 Hình 3.4. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc 37 Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra kết quả tách plasmid tái tổ hợp 38 Hình 3.6. Ảnh điện di cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym BamHI 38 Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen GmEXP1 giữa giống đậu tương SL3 và DT84 với đoạn mã hoá của gen GmEXP1 giống có mã số AF516879 trong Ngân hàng gen qu ốc tế 41 Hình 3.8. So sánh trình tự amino acid mã hoá bởi gen GmEXP1 của giống đậu tương SL3, DT84 với giống AF516879 công bố trong Ngân hàng gen 43 Hình 3.9. So sánh trình tự amino acid của vùng DPBB ở 5 giống đậu tương 45 Hình 3.10. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các giống đậu tương dựa tr ên cơ sở trình tự amino acid của vùng DPBB của protein EXP1 45 Hình 3.11. So sánh trình tự amino acid của vùng Pollen allerg trong trình tự amino acid của protein EXP 5 giống đậu tương 46 Hình 3.12. Sơ đồ hình cây biểu hiện mối quan hệ di truyền của 8 giống cây trồng được thiết lập trên cơ sở dữ liệu trình tự đoạn mã hóa gen EXP1 48 Hình 3.13. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng protein EXP của 8 giống cây trồng phân tích 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây loại trồng ngắn ngày có vị trí quan trọng trong cơ cấu cây nông nghiệp ở nước ta. Đậu tương được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế. Trong hạt đậu tương rất giàu hàm lượng protein (từ 32% - 52% ) và chứa nhiều amino acid không thay thế (lysin, triptophan, metionin, leucin ), 12% -25% lipit và các vitamin (B1, B2, C, D, E, K ). Hạt đậu tương cung cấp nguồn dinh dưỡng phong phú, cần thiết cho người và động vật. Một đặc tính quan trọng nữa của đậu tương đó là khả năng cải tạo đất do hệ rễ của chúng có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm. Chính vì vậy trồng đậu tương ngoài việc đem lại hiệu quả kinh tế còn góp phần vào công cuộc cải tạo đất trồng trọt. Sản lượng đậu tương trên thế giới đạt hàng trăm triệu tấn /năm. Trong khi đó ở Việt Nam chỉ đạt vài trăm nghìn tấn /năm. Để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và chế biến ngành công nghiệp chế biến của nước ta vẫn phải nhập khẩu đậu tương từ các nước trên thể giới đặc biệt là Mỹ. Thực trạng này cũng chứng tỏ một điều là diện tích gieo trồng, năng suất và sản lượng đậu tương của nước ta còn thấp so với các nước trong khu vực và trên thế giới. Một trong những nguyên nhân làm sụt giảm năng suất cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng chính là hạn hán. Việt Nam nằm trong khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề của biến đổi khí hậu, hơn nữa nhiều tỉnh miền núi của nước ta có địa hình dốc cho nên tình trạng hạn hán cục bộ xảy ra rất phổ biến. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chịu hạn kém, vì thế hạn hán xảy ra sẽ làm giảm năng suất của đậu tương. Chính vì vậy công tác tuyển chọn giống đậu tương có kiểu gen chịu hạn ngày càng được quan tâm nghiên cứu. Hai cơ chế chính liên quan đến khả năng chiụ hạn của cây đậu tương, đó là sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu và sự phát triển bộ rễ. Khả năng thu nhận Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... của gen GmEXP1 liên quan đến khả năng kéo dài của rễ ở cây đậu tương; 3.3 So sánh trình tự đoạn mã hóa của gen GmEXP1, trình tự amino acid trong protein do gen GmEXP1 mã hóa của một số giống đậu tương nghiên cứu với trình tự gen đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế; 3.4 Phân tích tính đa dạng về trình tự nucleotide đoạn mã hóa của gen EXP1 và trình tự amino acid của protein EXP1 ở cây đậu tương và... của cây phụ thuộc chủ yếu vào bộ rễ Vì vậy hướng nghiên cứu về khả năng đâm xuyên, lan toả của hệ rễ và tìm hiểu về cơ sở di truyền phân tử của sự phát triển hệ rễ liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương là vấn đề đang được quan tâm và mang tính thời sự Xuất phát từ lí do trên chúng tôi lựa chọn và tiến hành đề tài: Nghiên cứu trình tự gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của cây đậu tương. .. tiêu nghiên cứu Xác định được điểm sai khác về trình tự nucleotide của gen GmEXP1 và trình tự amino acid của protein do gen GmEXP1 mã hóa phân lập từ một số giống đậu tương có khả năng chịu hạn khác nhau 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Khuếch đại đoạn mã hóa của gen GmEXP1 liên quan đến khả năng kéo dài rễ của một số giống đậu tương bằng kỹ thuật RT-PCR; 3.2 Tách dòng và xác định trình tự đoạn mã hóa của gen. .. trưởng của rễ chính giảm còn các rễ phụ lại được phát triển mạnh Những kết quả nghiên cứu cho thấy rằng gen GmEXP1 có liên quan đến sự kéo dài rễ của cây đậu tương Phân tử mRNA của gen GmEXP1 thường được các khu vực hóa với các lớp tế bào biểu bì và nằm ở dưới vùng kéo dài của rễ sơ cấp ở đậu tương, mRNA của gen GmEXP1 tập trung nhiều nhất trong phần đầu rễ, nơi xảy ra sự kéo giãn tế bào Nghiên cứu của. .. khi nghiên cứu biểu hiện của gen GmEXP1 cây thuốc lá cho thấy gen GmEXP1 ã làm tăng sự phát triển rễ của cây thuốc lá chuyển gen và ít chịu tác động từ môi trường ngoài [26] Các kết quả nghiên cứu cho thấy gen GmEXP1 đóng một vai trò quan trọng trong việc phát triển rễ của cây đậu tương, đặc biệt là trong quá trình kéo dài của rễ chính và rễ thứ cấp Ở cây đậu tương thì gen GmEXP1, GmEXP2 và các expansin... trong sự biểu hiện mất nước của tế bào [34] 1.3.2 Gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của cây đậu tương Những năm gần đây, trên thế giới có nhiều nghiên cứu đi sâu tìm hiểu vai trò của gen expansin liên quan đến sự kéo dài bộ rễ tham gia vào khả năng chịu hạn của thực vật và đã có những đóng góp đáng kể Các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng expansin là một họ protein có chức năng mở rộng thành tế bào... rễ sơ cấp và thứ cấp Gen GmEXP1 biểu hiện ở các tế bào trong lớp biểu bì và các lớp tế bào cơ bản của khu vực kéo dài của rễ chính Các kết quả nghiên cứu về gen GmEXP1 đã gợi ý rằng sự biểu hiện của gen GmEXP1 xảy ra trong thời gian và vị trí xác định của quá trình phát triển của rễ cây đậu tương [21], [24] Hiện nay, vai trò của expansin trong quá trình phát triển rễ của cây đậu tương vẫn chưa được... các nốt sần của hệ rễ cũng liên quan đến khả năng kháng hạn của loài thực vật này Giai đoạn cây non thường chịu tác động mạnh của hạn vì bộ rễ phát triển chưa đầy đủ, còn non yếu 13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.3 GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀ GEN GmEXP1 CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.3.1 Gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tương Trong nhiều năm trở lại... http://www.lrc-tnu.edu.vn Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương được chia làm 2 nhóm: (i) Nhóm gen mà sản phẩm của chúng có ảnh hưởng trực tiếp tới đặc tính chịu hạn; (ii) Nhóm gen mà sản phẩm của chúng kích hoạt quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn [9] Nhóm gen mà sản phẩm của chúng có ảnh hưởng trực tiếp tới tính chịu hạn của cây đậu tương Các gen chức năng mà sản phẩm liên quan trực tiếp đến tính... đến việc kéo dài tế bào rễ ở thực vật Ở cây đậu tương Lee (2003) [25] đã nghiên cứu phân lập gen GmEXP1và mRNA của gen này có kích thước 1089bp,mã hóa cho 255 amino acid Lee và các cộng sự năm 2011 đã tiếp tục nghiên cứu biểu hiện gen expansin Mức độ biểu hiện của gen GmEXP1 rất mạnh trong khoảng thời gian hạt nảy mầm từ 1 ngày đến 5 ngày tuổi và giai đoạn kéo dài rễ diễn ra rất nhanh, khi nghiên cứu . gen GmEXP1 liên quan đến khả năng kéo dài rễ của một số giống đậu tương bằng kỹ thuật RT-PCR; 3.2. Tách dòng và xác định trình tự đoạn mã hóa của gen GmEXP1 liên quan đến khả năng kéo dài của. tài: Nghiên cứu trình tự gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được điểm sai khác về trình tự nucleotide của gen. xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam 7 1.2. ẢNH HƯỞNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG 11 1.3. GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀ GEN GmEXP1 CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 14 1.3.1. Gen liên quan đến