Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ NHUNG “NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA TẾ BÀO ĐỆM ( CELL-CO-CULTURE) LÊN SỰ THÀNH THỤC TRỨNG VÀ SỰ PHÁT TRIỂN PHÔI LỢN THỤ TINH ỐNG NGHIỆM ” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 Lời cảm ơn! Dân gian ta có câu, không thầy đố mày làm nên. Là một học trò còn nhiều thiếu xót, kinh nghiệm chƣa nhiều, để hoàn thành đề tài này của mình, tôi đã cần đến rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ tận tình của các thầy cô và bạn bè đồng nghiệp Trƣớc hết tôi không thể không kể đến sự hƣớng dẫn hết lòng của thầy TS. Bùi Xuân Nguyên trƣởng phòng Công nghệ Phôi, ngƣời đã chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Là một ngƣời thầy có trình độ chuyên môn sâu, kiến thức rộng, tận tâm trong công việc và hết lòng vì các học trò. Tôi thật lòng thán phục năng lực làm việc và sự say mê khoa học trong con ngƣời của thầy. Trong thời gian đƣợc làm việc cùng thầy tôi cảm thấy mình thật may mắn khi có đƣợc sự hƣớng dẫn và định hƣớng của thầy. Sát cánh bên cạnh tôi là sự chỉ dẫn của cô TS. Nguyễn Thị Ƣớc, cô đã dạy bảo và truyền đạt cho tôi rất nhiều những kinh nghiệm quý báu trong công việc cũng nhƣ trong cuộc sống. Xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Văn Hạnh (Viện Công nghệ Sinh Học) đã có những nhận xét thẳng thắn và quý báu để giúp tôi làm việc đƣợc tốt hơn Qua đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Việt Linh đã có những góp ý đúng đắn để tôi hoàn thành luận văn của mình Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các đồng nghiệp phòng Công nghệ Phôi đã luôn bên cạnh, ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua! Hà Nội, 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Mục lục Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 8 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1. Tế bào và quá trình thành thục, thụ tinh của tế bào trứng lợn 12 1.1 Cấu tạo buồng trứng lợn. 12 1.2. Cấu tạo tế bào trứng. 13 1.3. Sự thành thục của tế bào trứng. 14 1.3.1. Sự thành thục nhân. 14 1.3.2. Sự thành thục tế bào chất. 15 1.3.3. Một số nhân tố điều hòa hoạt động của tế bào trứng. 16 1.4. Sự thụ tinh và phát triển phôi in vivo ở lợn. 16 2. Tình hình nuôi thành thục trứng và thụ tinh ống nghiệm ở lợn. 17 2.1. Nuôi thành thục trứng lợn. 17 2.2. Thụ tinh và phát triển phôi in vitro ở lợn. 19 3. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào đệm lên sự thành thục trứng và phát triển phôi. 23 3.1. Tế bào màng vòi trứng, vai trò của tế bào màng vòi trứng lên sự thành thục trứng và phát triển của phôi. 23 3.1.1. Tế bào màng trong vòi trứng 23 3.1.2. Vai trò của tế bào màng trong vòi trứng. 23 3.2. Ảnh hƣởng của nguyên bào sợi bào thai chuột (Fibroblast cells) lên sự thành thục trứng và phát triển của phôi. 25 PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 1. Nguyên vật liệu 29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 1.1. Đối tƣợng thí nghiệm. 29 1.2. Dụng cụ thí nghiệm. 29 1.3. Thiết bị thí nghiệm. 29 1.4. Hóa chất và môi trƣờng 29 2. Phƣơng pháp 32 2.1. Phƣơng pháp thu nhận buồng trứng. 32 2.2. Nuôi thành thục trứng invitro. 33 2.3. Nuôi thành thục trứng với môi trƣờng bổ sung nguyên bào sợi thai chuột. 33 2.4. Nuôi thành thục trứng với môi trƣờng bổ sung tế bào màng vòi trứng. 34 2.5. Quan sát hình thái, đánh giá mức độ thành thục của trứng. 35 2.6. Nhuộm và đánh giá các giai đoạn phát triển của trứng. 35 2.7. Phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm. 36 2.8. Đánh giá chất lƣợng và sự phát triên của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm. 36 2.9. Phƣơng pháp thống kê và xử lý số liệu. 36 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37 1. Kết quả thu và phân loại trứng. 38 2. Kết quả nuôi thành thục trứng. 40 2.1. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào sợi bào thai chuột lên sự thành thục trứng. 40 2. 2. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào màng trong vòi trứng (oviduct cell) lên sự thành thục của trứng. 41 2.3. Ảnh hƣởng của co-culture cùng lúc với với tế bào sợi bào thai chuột và tế bào màng trong vòi trứng lên sự thành thục của trứng. 43 3. Kết quả thụ tinh và phát triển phôi. 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 3.1. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào sợi bào thai chuột lên sự phát triển phôi thụ tinh ống nghiệm. 44 3.2. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào màng trong vòi trứng lên sự phát triển phôi thụ tinh ống nghiệm. 46 3.3. Ảnh hƣởng của co-culture cùng lúc với với tế bào sợi bào thai chuột và tế bào màng trong vòi trứng lên sƣ thụ tinh và phát triển phôi. 49 IV KET LUAN 54 TAI LIEU THAM KHAO 62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 Danh mục các từ viết tắt. Thụ tinh ống nghiệm TTON In vitro fertilization IVF Nuclear deoxyribonucleic acid DNA Luteinizing hormone LH Nhiễm sắc thể NST Nuclear ribonucleic acid RNA Maturation promoting factor MPF Follicle stimulating hormone FSH In vitro maturation IVM Maturation promoting factor MPF Cumulus oocyte complex COC Metaphase I MI Metaphase II MII Germinal vesicle GV Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 Danh mục hình. Hình 1: Thai chuột 14 ngày tuổi Hình 2: Miếng cơ thai chuột Hình 3: Tế bào sợi thai chuột sau 4 ngày nuôi Hình 4: Tế bào sợi thai chuột sau 10 ngày nuôi Hình 5: Vòi trứng lợn Hình 6: Tế bào màng trong vòi trứng ngay sau khi thu Hình 7: Các cụm tế bào màng trong vòi trứng sau nuôi 1 ngày Hình 8: Một cụm tế bào màng trong vòi trứng điển hình Hình 9: Buồng trứng lợn thu từ lò mổ Hình 10: Trứng lợn ngay sau khi thu Hình 11:Trứng lợn sau nuôi 22 giờ Hình 12: Trứng lợn nuôi trong môi trƣờng bổ sung tế bào màng trong vòi trứng Hình 13: Trứng thành thục sau khi tách cumulus (x1600) Hình 14: Trứng giai đoạn bóng mầm Hình 15: Trứng giai đoạn metaphase I Hình 16: Giai đoạn metaphase II Hình 17: Phôi giai đoạn 2 và 4 tế bào Hình 18: Phôi 8 tế bào Hình 19: Phôi dâu Hình 20: Phôi nang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8 Danh mục bảng Bảng 1: Kết quả thu và phân loại trứng ở các nang có kích thƣớc > 3 mm 38 Bảng 2: Kết quả thu và phân loại trứng ở các nang có kích thƣớc 2-3 mm. 39 Bảng 3: Ảnh hƣởng của tế bào sợi thai chuột lên tỉ lệ thành thục của trứng lợn 41 Bảng 4: Ảnh hƣởng của tế bào màng trong vòi trứng lên chất lƣợng trứng lợn sau nuôi. 42 Bảng 5: Ảnh hƣởng của việc bổ sung cả hai loại tế bào vào môi trƣờng nuôi trứng lên tỉ lệ thành thục của trứng lợn. 43 Bảng 6.1: Ảnh hƣởng của tế bào sợi thai chuột lên chất lƣợng phôi thu từ các nang > 3 mm 44 Bảng 6.2: Ảnh hƣởng của tế bào sợi thai chuột lên chất lƣợng phôi thu từ các nang 2-3 mm 45 Bảng 7.1: Kết quả về sự phát triển của phôi lợn khi trứng nuôi trong môi trƣờng IVM có bổ sung tế bào màng trong vòi trứng (Đối với nang > 3 mm). 47 Bảng 7.2: Kết quả về sự phát triển của phôi lợn khi trứng nuôi trong môi trƣờng IVM có bổ sung tế bào màng trong vòi trứng (Đối với nang 2- 3 mm) 48 Bảng 8.1: Sự phát triển phôi khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi trứng cả hai loại tế bào (nang > 3 mm) 49 Bảng 8.2: Sự phát triển phôi khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 9 trứng cả hai loại tế bào (nang 2-3 mm) ĐẶT VẤN ĐỀ Kĩ thuật thụ tinh ống nghiệm (TTON) hay kĩ thuật IVF (in vitro fertilization) giúp trứng và tinh trùng thụ tinh bên ngoài cơ thể là bƣớc đột phá quan trọng trong ngành y học và sinh học. Cho đến nay, thụ tinh ống nghiệm đƣợc áp dụng trên rất nhiều các loài động vật khác nhau và ở hầu hết các nƣớc trên thế giới. Năm 1959 Chang và cộng sự đã tạo ra chú thỏ (động vật có vú đầu tiên) bằng phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm. Tiếp theo đó là sự thành công trên hàng loạt các đối tƣợng nhƣ cừu, chuột đồng, mèo, khỉ … Ngày 25 tháng 7 năm 1978 em bé đầu tiên đƣợc ra đời bằng phƣơng pháp TTON đã mở ra hi vọng cho hàng nghìn cặp vợ chồng hiếm muộn trên khắp thế giới. Trong những năm đầu tiên các nhà khoa học đã phải thực hiện khoảng 5000 chu kỳ để có hai trƣờng hợp em bé TTON ra đời. Sau 2 năm với những cố gắng không nhỏ, em bé TTON đã đƣợc ra đời tại Pháp và Úc. Vào thời gian đó, không ai có thể nghĩ rằng chỉ hơn 30 năm sau, 5 triệu em bé TTON đã đƣợc sinh ra ở nhiều nƣớc trên thế giới. Giải Nobel Sinh lý và Y học năm 2010 đƣợc trao cho TS Adward do công trình nghiên cứu thành công kỹ thuật TTON trên ngƣời vào năm 1978 và đóng góp cho việc phát triển kỹ thuật này trên toàn thế giới. Nhằm mục đích cải thiện khả năng sinh sản của động vật cao sản, bảo tồn đa dạng các loài động vật quý hiếm, tăng khả năng thụ thai và điều trị vô sinh, kĩ thuật TTON trong những năm gần đây đã đƣợc quan tâm và đầu tƣ nhiều hơn. Tại Việt Nam, công nghệ Phôi và TTON đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu tại Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam từ những năm 1978 – 1980 và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 đã đạt đƣợc nhiều thành công trên các đối tƣợng nhƣ thỏ (1978) trâu bò ( 1986, 2002). TTON đã đƣợc ứng dụng để điều trị vô sinh từ hơn 10 năm nay mặc dù đi sau thế giới và với những nền tảng khoa học còn nhiều hạn chế, việc phát triển TTON trên ngƣời ở Việt Nam đã đạt đƣợc nhiều thành công đáng khích lệ. Lợn là động vật đƣợc quan tâm đặc biệt nhƣ một mô hình nghiên cứu y học có đặc điểm di truyền của loài ngƣời. Buồng trứng của lợn có chứa số lƣợng lớn (hơn 200.000) các nang trứng sơ cấp (primordial follicles). Trong những năm đầu thập kỉ 1980 ngƣời ta đã thu đƣợc các phôi in vivo từ lợn và các phôi này có thể nuôi, phát triển từ giai đoạn 4 tế bào đến giai đoạn phôi nang (blastocyst). Sau đó những hiểu biết về đặc điểm phát triển của trứng đã giúp hình thành các loại môi trƣờng nuôi trứng thành thục trong điều kiện in vitro. Thụ tinh ống nghiệm trên đối tƣợng lợn đƣợc Chan và cộng sự công bố đầu tiên vào năm 1986. Mặc dù tế bào trứng lợn trƣởng thành trong ống nghiệm có thể thụ tinh với tinh trùng một cách dễ dàng trong điều kiện thích hợp. Sự phát triển phôi lợn in vitro vẫn thu kém nhiều so với điều kiện in vivo và những nguyên nhân cụ thể dẫn đến sự khác biệt này vẫn là một trong những vấn đề cần đƣợc giải quyết. Các kết quả nghiên cứu TTON lợn ở Việt Nam trong những năm gần đây cho thấy do đặc điểm khá đặc trứng về phƣơng thức nuôi dƣỡng, đặc điểm thời tiết, độ tuổi giết thịt… kết quả TTON từ nguồn trứng lợn thu ở Việt Nam có khác biệt so với kết quả TTON ở một số nƣớc khác, việc tạo đƣợc nguồn trứng chất lƣợng đảm bảo là một trong những chìa khóa then chốt nhằm nâng cao hiệu quả TTON. [...]... cho sự phát triển của trứng và phôi Trong đó có phƣơng pháp bổ sung vào môi trƣờng nuôi trứng tế bào đệm (cell- co- culture) mà phổ biến nhất là tế bào màng lót ống dẫn trứng và tế bào cơ thai chuột 3 Ảnh hƣởng của co- culture với tế bào đệm lên sự thành thục trứng và phát triển phôi 3.1 Tế bào màng vòi trứng, vai trò của tế bào màng trong vòi trứng (oviduct cell) lên sự thành thục trứng và phát triển của. .. I, hình thành tế bào trứng sơ cấp Giai đoạn này đƣợc gọi là giai đoạn túi mầm, bên trong tế bào trứng toàn bộ nhiễm sắc thể đƣợc bao bọc bởi túi mầm và tế bào trứng dừng phát triển cho đến khi cơ thể đạt độ tuổi thành thục sinh dục 1.3 Sự thành thục của tế bào trứng Sự thành thục của tế bào trứng bao gồm sự thành thục nhân và sự thành thục của tế bào chất Sự thành thục của tế bào chất gắn liền và không... hành nghiên cứu đề tài Ảnh hƣởng của các loại tế bào đệm lên sự thành thục trứng và sự phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm Đề tài thực hiện với các mục tiêu: - Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của kích thƣớc nang tới chất lƣợng trứng và phôi lợn - Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng riêng lẻ cũng nhƣ kết hợp của các loại tế bào đệm (tế bào màng trong vòi trứng và tế bào nguyên bào sợi của bào thai chuột) lên sự thành. .. Quá trình thụ tinh đƣợc hoàn tất và trứng bắt đầu phát triển theo bộ mã do gen của NST ấn định Sau khi thụ tinh, trứng di chuyển về tử cung và làm tổ gọi là sự di trú 2 Tình hình nuôi thành thục trứng và thụ tinh ống nghiệm ở lợn 2.1 Nuôi thành thục trứng lợn Sự phát triển của trứng ở giai đoạn IVM ảnh hƣởng rất lớn đến sự phát triển của phôi ở giai đoạn sau Ở bò, những tế bào trứng thành thục trong... chín và thụ tinh của trứng, sự phân chia tế bào và sự phát triển của phôi đến giai đoạn phôi nang (blastocyst) Sự thay đổi hình thái, vị trí một số bào quan của trứng có ý nghĩa quan trọng đến sự thành thục tế bào chất và chuẩn bị cho quá trình phát triển tiếp theo của tế bào trứng Trong đó, bộ máy Golgi đƣợc coi là bộ phận quan trọng nhất nhằm đánh giá sự thành thục của tế bào chất Trong tế bào trứng, ... triển của trứng, tăng tỉ lệ tạo tiền nhân đực, giảm tỉ lệ đa tinh trùng và giúp cho sự phát triển của phôi Năm 2003 Kidson và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của tế bào màng trong vòi trứng lên quá trình thành thục của trứng, sự thụ tinh và sự phát triển của phôi lợn đƣợc nuôi trong ống nghiệm Kết quả cho biết không có sự khác biệt giữa nhóm đối chứng và nhóm có bổ sung tế bào màng trong vòi trứng. .. nuôi trứng lợn từ 10- 30 % tế bào màng trong vòi trứng sẽ làm tăng tỉ lệ trứng đƣợc thụ tinh bởi một tinh trùng mà không làm giảm khả năng xâm nhập của tinh trùng Heidari M và cộng sự (2011) cũng thông báo kết quả sử dụng nguyên bào sợi làm tăng khả năng thành thục và thụ tinh của trứng chuột Với mục đích tìm hiểu điều kiện tốt nhất cho sự thành thục của trứng và sự phát triển của phôi lợn TTON, chúng... nang trứng (FF) và các thành phần bổ sung khác nhƣ gonadotrophin và các yếu tố sinh trƣởng (Coskun và Lin, 1994; Ding và Foxcroft, 1994; McCauley và cs,2001, Prochazka và cs, 2000) Nhìn chung, quá trình nuôi thành thục tế bào trứng có thể chia làm hai khía cạnh, sự thành thục của nhân và sự thành thục của tế bào chất Thành thục nhân là một thuật ngữ để chỉ sự hồi phục quá trình phân bảo giảm nhiễm và. .. quả có sự khác biệt rõ rệt về các chỉ tiêu giữa tế bào trứng thành thục, rụng tự nhiên với những trứng thành thục do nuôi trong ống nghiệm và trứng trƣớc khi rụng Điều này chứng tỏ sau khi rụng trứng, tế bào trứng đã có những thay đổi cơ bản trong ống dẫn trứng và điều này có ý nghĩa trong việc giảm tỉ lệ đa tinh trùng Khi thực hiện cấy tế bào trứng đƣợc nuôi thành thục trong ống nghiệm vào trong ống. .. phân chia của phôi tăng so với đối chứng Nhƣ vậy, tế bào màng trong vòi trứng có vai trò quan trọng trong việc nâng cao chất lƣợng trứng và phôi thụ tinh ống nghiệm 3.2 Ảnh hƣởng của nguyên bào sợi bào thai chuột (Fibroblast cells) lên sự thành thục trứng và phát triển của phôi Nguyên bào sợi là một loại tế bào bao gồm các tế bào ngoại bào và các sợi collagen, chúng đóng vai trò quan trọng trong việc . độ tuổi thành thục sinh dục. 1.3. Sự thành thục của tế bào trứng. Sự thành thục của tế bào trứng bao gồm sự thành thục nhân và sự thành thục của tế bào chất. Sự thành thục của tế bào chất. thành thục trứng và thụ tinh ống nghiệm ở lợn. 17 2.1. Nuôi thành thục trứng lợn. 17 2.2. Thụ tinh và phát triển phôi in vitro ở lợn. 19 3. Ảnh hƣởng của co- culture với tế bào đệm lên sự. sự thành thục trứng và phát triển phôi. 23 3.1. Tế bào màng vòi trứng, vai trò của tế bào màng vòi trứng lên sự thành thục trứng và phát triển của phôi. 23 3.1.1. Tế bào màng trong vòi trứng