Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐÀO DUY HƢNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH GIỐNG SA NHÂN TÍM (Amomum Longiligulare T.L.Wu) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ®¹i häc th¸i nguyªn TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐÀO DUY HƢNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH GIỐNG SA NHÂN TÍM (Amomum Longiligulare T.L.Wu) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS. Ngô Xuân Bình Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình hay tạp chí nào khác ở trong nƣớc cũng nhƣ ở nƣớc ngoài. Thái Nguyên, ngày 19 tháng 8 năm 2013 Học viên Đào Duy Hƣng Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Ngô Xuân Bình là thầy trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cám ơn: - Tập thể các anh chị đồng nghiệp Bộ môn Công nghệ tế bào - Viện Khoa học Sự sống đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành công việc nghiên cứu của mình. - Tập thể các thầy cô giáo Bộ môn Khoa học sự sống, trƣờng Đại học khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian sinh hoạt học tập tại Bộ môn. Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những ngƣời thân trong gia đình đã luôn khuyến khích, động viên cũng nhƣ chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành nghiên cứu của mình. Xin chân thành cảm ơn! Học viên Đào Duy Hƣng Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về cây sa nhân 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây sa nhân 3 1.1.1.1. Nguồn gốc và phân bố cây sa nhân 3 1.1.1.2. Phân loại cây sa nhân tím 4 1.1.2. Đặc điểm thực vật học 4 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái 4 1.1.2.2. Đặc điểm sinh thái 6 1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý 7 1.1.3. Tiêu chuẩn chất lượng và giá trị 9 1.1.3.1.Tiêu chuẩn chất lƣợng 9 1.1.3.2. Giá trị 9 1.2. Tình hình nghiên cứu về cây sa nhân 11 1.2.1. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây sa nhân bằng nuôi cấy mô trên thế giới 11 1.2.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây sa nhân bằng nuôi cấy mô ở Việt Nam 11 1.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 1.3.1. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 1.3.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 14 1.3.3. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào 15 1.3.4. Một số công trình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nước 17 CHƢƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 20 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 20 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv 2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20 2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.2.1. Nội dung nghiên cứu 20 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.2.1. Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu 21 2.2.2.2. Giai đoạn tái sinh chồi 23 2.2.2.3. Giai đoạn nhân nhanh cụm chồi 25 2.2.2.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 27 2.2.2.5. Giai đoạn vƣờn ƣơm 29 2.2.3. Xử lý số liệu 30 2.2.4. Điều kiện thí nghiệm 30 2.2.4.1. Thí nghiệm in vitro 30 2.2.4.2. Thí nghiệm thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 30 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của hóa chất đến khả năng vô trùng mẫu sa nhân tím làm vật liệu khởi đầu 31 3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của H 2 0 2 20% đến khả năng vô trùng mẫu 31 3.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl 2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu 33 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tái sinh chồi cây sa nhân tím (Sau 45 ngày nuôi cấy) 35 3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả năng tái sinh chồi 35 3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi 37 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến hiệu quả nhân chồi cây sa nhân tím 38 3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi 39 3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân chồi 41 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 3.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân chồi 43 3.3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả nhân chồi 45 3.3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả nhân chồi 47 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng ra rễ chồi sa nhân tím 49 3.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi sa nhân tím 49 3.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi sa nhân tím 51 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của giá thể đến sự thích ứng cây sa nhân tím in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi BAP 6-benzylaminopurine CT Công thức ĐC Đối chứng Kinetin furfurylaminopurine MS Murashinge and Skoog, 1962 NAA α-Naphlene acetic acid TN Thí nghiệm IBA Indole – 3 – butyric acid IAA Indole-3-acetic acid ND Nƣớc dừa GA 3 Gibberellin KC Knudson C, 1965 RE Robert Ernst, 1979 VW Vacin & Went, 1949 SH Schenk, Hidebrandt, 1972 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii Bảng Trang Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của H 2 0 2 20% đến khả năng vô trùng mẫu 31 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của HgCl 2 0.1% đến khả năng vô trùng mẫu 33 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng BAP đến khả năng tái sinh chồi 35 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng Kinetin đến khả năng tái sinh chồi 37 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi 39 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của Kinetin đến hiệu quả nhân chồi 41 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân chồi 43 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả nhân chồi 45 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả nhân chồi 47 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi sa nhân tím 49 Bảng 3.11. Ảnh hƣởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi sa nhân tím 51 Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của giá thể đến sự thích ứng cây sa nhân tím in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 53 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii HÌNH Hình Hình Trang Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 21 Hình 3.1 Ảnh hƣởng của H 2 0 2 20% đến khả năng vô trùng mẫu 32 Hình 3.2 Ảnh hƣởng của HgCl 2 0.1% đến khả năng vô trùng mẫu 33 Hình 3.3 Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi 35 Hình 3.4 Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi; A: Công thức đối chứng; B: Công thức 5 36 Hình 3.5 Ảnh hƣởng Kinetin đến khả năng tái sinh chồi 37 Hình 3.6 Ảnh hƣởng của Kinetinđến khả năng tái sinh chồi cây sa nhân tím; A: Công thức đối chứng ; B: Công thức 5 38 Hình 3.7 Ảnh hƣởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi 39 Hình 3.8 Ảnh hƣởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi; A: công thức đối chứng; B: Công thức 4 40 Hình 3.9 Ảnh hƣởng của Kinetin đến hiệu quả nhân chồi 41 Hình 3.10 Ảnh hƣởng của Kinetin đến hiệu quả nhân chồi; A: công thức đối chứng; B: Công thức 5 42 Hình 3.11 Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân chồi 44 Hình 3.12 Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân chồi; A: Công thức đối chứng; B: Công thức 5 45 Hình 3.13 Ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả nhân chồi 46 [...]... cây giống đồng đều, sức sinh trƣởng cao và sạch bệnh [25], [31] đã thực sự trở thành giải pháp cần thiết trong công tác giống cây trồng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn cây dƣợc liệu Xuất phát từ yêu cầu thực tế, chúng tôi tiến hành đề tài: Xây dựng quy trình tái sinh giống Sa Nhân tím (Amomum Longiligulare T.L.Wu) bằng phương pháp nuôi cấy mô Mục đích nghiên cứu Xây dựng thành công quy trình tái. .. trình tái sinh giống sa nhân tím có năng suất cao bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô nhằm góp phần bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật và làm cơ sở cho việc nhân nhanh loài cây dƣợc liệu này, cung cấp nguồn cây giống chất lƣợng cao để mở rộng vùng dƣợc liệu sa nhân trong nƣớc Ý nghĩa của đề tài: - Ý nghĩa khoa học + Kết quả nghiên cứu đƣa ra một số quy trình kỹ thuật vi nhân nhân giống cây sa nhân tím bằng. .. có sử dụng sa nhân Ngoài ra, hạt sa nhân còn đƣợc dùng làm gia vị Tinh dầu sa nhân dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm [2] [4], [5] Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 11 1.2 Tình hình nghiên cứu về cây sa nhân 1.2.1 Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây sa nhân bằng nuôi cấy mô trên thế giới Trên thế giới có một số công trình nghiên cứu nhân giống in vitro chi sa nhân (Amomum) Sajina và... quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3.1 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong nhiều thập kỉ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới Có thể nói đây là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô nhƣ: nuôi cấy mô phân sinh, callus, nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ... cứu nhân giống in vitro từ chồi nách [34], [38] Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire đã đƣợc Hongdong (2006) nuôi in vitro và nhân nhanh từ chồi đỉnh [27] 1.2.2 Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây sa nhân bằng nuôi cấy mô ở Việt Nam Ở Việt Nam, có rất ít công trình công bố kết quả nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây sa nhân Vịnh và cộng sự (2006) đã nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân. .. phƣơng pháp in vitro Từ đó, đánh giá đƣợc tác động của một số chất điều tiết sinh trƣởng trong nhân giống cây sa nhân tím + Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và sản xuất giống sa nhân tím thƣơng phẩm có năng suất cao - Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống cây sa nhân tím nhằm bảo tồn nguồn gen cây dƣợc liệu và cung cấp giống. .. sa nhân tím - Nghiên cứu loại giá thể phù hợp cho sự thích ứng cây sa nhân tím in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 1 Giai đoạn tạo vật liệu Giai đoạn tái sinh chồi Mẫu: Chồi sa nhân tím khởi đầu Mẫu: chồi bên, thân củ sa nhân tím Cây sa nhân tím nuôi cấy mô Giai đoạn vƣờn ƣơm Mẫu: Cây con in vitro Giai đoạn nhân nhanh cụm chồi Mẫu: Chồi invitro Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh... lệ sống của mẫu sa nhân tím - Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tái sinh của chồi sa nhân tím Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 21 - Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây sa nhân tím - Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng ra rễ của chồi sa nhân tím - Nghiên cứu... bình trên 80% Cây sinh trƣởng phát triển gần nhƣ quanh năm, nhƣng mạnh nhất vào mùa mƣa ẩm Sa nhân tím ra hoa quả đều hàng năm Tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt và bằng cách mọc chồi từ thân rễ Sa nhân tím là cây có biên độ sinh thái rộng, dễ trồng và có thể trồng đƣợc ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, từ vùng núi thấp đến trung du và cả ở đồng bằng [17] * Thổ nhưỡng đất đai: Sa nhân tím mọc tự nhiên... giai đoạn này là tái sinh một cách định hƣớng sự phát triển của mô nuôi cấy Quá trình này điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trƣởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi cấy Thƣờng các mô non, chƣa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã chuyển hoá - Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi Mục . Longiligulare T. L. Wu) bằng phương pháp nuôi cấy mô Mục đích nghiên cứu Xây dựng thành công quy trình t i sinh giống sa nhân t m có năng su t cao bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô nhằm góp phần bảo t n. giống cây trồng, góp phần bảo t n và ph t triển nguồn cây dƣợc liệu. Xu t ph t từ yêu cầu thực t , chúng t i tiến hành đề t i: Xây dựng quy trình t i sinh giống Sa Nhân t m (Amomum Longiligulare. XÂY DỰNG QUY TRÌNH T I SINH GIỐNG SA NHÂN T M (Amomum Longiligulare T. L. Wu) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái