Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG VŨ MINH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ (ECHB1) VÀO BẠCH ĐÀN URÔ (EUCALYPTUS UROPHYLLA) THÔNG QUA AGROVACTERIUM TUMEFACIENS LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ Thái Nguyên – 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG VŨ MINH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ (ECHB1) VÀO BẠCH ĐÀN URÔ (EUCALYPTUS UROPHYLLA) THÔNG QUA AGROVACTERIUM TUMEFACIENS Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ Thái Nguyên – 2013 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1 3 b (Eucalyptus urophylla) 3 3 4 1.1.3. Giá trị kinh tế 5 1.1.4. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam 6 1.2. EcHB1 và chu trình tổng hợp lignin ở thực vật 7 1.2.1. Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật 7 1.2.2. EcHB1 – nhân tố phiên mã làm tăng chiều dài sợi gỗ 14 1.3. Ứng dụng công nghệ chuyển gen thực vật 15 1.3.1. Khái niệm chuyển gen 15 1.3.2. Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng 16 1.3.3. Những thành tựu trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen 21 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. Vật liệu nghiên cứu 27 2.1.1. Vật liệu 27 2.1.2. Hóa chất, thiết bị sử dụng 27 2.2. Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1. Tạo mẫu bạch đàn sạch in vitro 28 2.2.2. Ảnh hưởng của môi trường và các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh trực tiếp từ mô sẹo 29 2.2.3. Tạo vật liệu trước khi chuyển gen 32 2.2.4. Tạo dịch huyền phù 32 2.2.5. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy 33 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 2.2.6. Diệt khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen 33 2.2.7. Phương pháp tách chiết DNA ở thực vật 33 2.2.8. Phương pháp điện di DNA 35 2.2.9. Kiểm tra sự có mặt cuả gen EcHB1 bằng kỹ thuật PCR 36 2.3. Các công thức sử dụng trong xử lý số liệu 36 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Tạo mẫu bạch đàn urô in vitro 38 3.2. Ảnh hưởng của môi trường và các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo 40 3.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo 40 3.2.2. Ảnh hưởng của BAP kết hợp với chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp và tái sinh chồi từ mô sẹo 44 3.2.3. Ảnh hưởng của NAA và IBA tới khả năng ra rễ của chồi 48 3.2.4. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh 50 3.3. Kết quả chuyển gen EcHB1 vào bạch đàn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 51 3.3.1. Tạo dịch huyền phù 51 3.3.2. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy 51 3.3.3. Diệt khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Bích Ngọc - Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi muốn bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Văn Sơn - Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Phương Thảo và KS. Lê Hoàng Đức - Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã cộng tác giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn chủ nhiệm đề tài, TS. Trần Hồ Quang đã cho phép tôi thực hiện một phần nội dung trong đề tài “Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho sợi gỗ dài” thuộc Chương trình Ứng dụng CNSH trong Nông nghiệp, Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn. Trong quá trình làm luận văn tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của toàn thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ thuộc cơ sở đào tạo Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiên cho tôi hoàn thành khóa học. Cuối cùng tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã luôn bên tôi động viện, quan tâm tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, ngày 25 tháng 10 năm 2013 Học viên Hoàng Vũ Minh Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CNSH Công nghệ sinh học AS Acetosyringone EST sequencing for Express Sequence Tag CAD Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase CCR Cinnamoyl CoA Reductase BAP Benzyl Amino Purine Kin Kinetin IBA Indol-3-Butyric Acid NAA Naphthyl Acetic Acid MS Môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962) LB Môi trường nuôi cấy Luria and Betani Knop Môi trường Sachs & Knop (1860) TDZ Thidiazuron GUS β - Glucuronidase gene kb kilo base kDa kilo Dalton OD Optical density – Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi trùng hợp NPT neomycin phosphotransferase HPT hygromycin phosphotransferase dNTP deoxynucleotide triphosphate Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Nồng độ BAP, kinetin và TDZ trong các công thức môi trường tái sinh 29 Bảng 2.2. Nồng độ BAP, NAA và IBA trong các công thức môi trường tái sinh 30 Bảng 2.4. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. tumefaciens 32 Bảng 2.5. Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng PCR 36 Bảng 3.1. Kết quả tạo mẫu bạch đàn sau 7 ngày nuôi cấy 39 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng cytokinin đến khả năng tái sinh 40 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và nhóm auxin đến khả năng tái sinh chồi 45 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của NAA và IBA tới khả năng ra rễ của chồi 49 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo mô sẹo 50 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp 51 Bảng 3.7. Hiệu suất chuyển gen trong thí nghiệm 52 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng thời gian khử trùng với NaOCl 30% đến kết quả tạo mẫu Bạch đàn sạch in vitro từ phôi hạt. 39 Biều đồ 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi 41 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi 42 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi 43 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của BAP và TDZ đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp 43 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của BAP và NAA tới khả năng tái sinh 46 Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của BAP và IBA tới khả năng tái sinh 47 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của BAP, NAA và IBA đến khả năng tái sinh 47 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo 50 [...]... chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) thông qua Agrobacterium tumefaciens" Mục tiêu của đề tài + Xây dựng quy trình chuyển gen cho bạch đàn urô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens + Tạo được dòng bạch đàn urô chuyển gen (EcHB1) tăng chiều dài sợi gỗ thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Nội dung nghiên cứu + Xác định ảnh hưởng của chất điều hòa... quá trình sinh tổng hợp lignin Kết quả khi sử dụng kỹ thuật microarray kiểm tra mức độ biểu hiện gen cho thấy ở bạch đàn lai (Eucalyptus grandis x E urophylla) chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1), biểu hiện của các gen chính liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin như CCoAOMT, CAD, CCR và C4H đều giảm ở các dòng cây chuyển gen EcHB1, trong khi đó biểu hiện các gen XTH liên quan đến kéo dài. .. ván sợi ép, trụ mỏ, gỗ lớn được dùng trong xây dựng, đóng đồ mộc; gỗ nhỏ dùng làm gỗ củi Tỷ trọng gỗ ở năm 6 tuổi là 488 kg m-3 [42], chiều dài sợi gỗ là 982,4 mm (cho phần gỗ mềm) và 110,46 mm (cho phần gỗ cứng) [35] Tính đến năm 2001 đã có khoảng 348000 ha bạch đàn được trồng [2] Bạch đàn urô là một trong những loài bạch đàn chính được trồng chủ yếu ở Việt Nam [18] Có nhiều nghiên cứu về tỷ trọng gỗ, ... hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh của bạch đàn Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 3 + Chuyển gen EcHB 1vào thân mầm và lá mầm bạch đàn urô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens + Phân tích cây bạch đàn urô chuyển gen EcHB1 CHƢƠNG 1 1.1 b (Eucalyptus urophylla) 1.1.1 urô thuộc Eucalyptus urophylla (E urophylla) (Myrtales (Myrtaceae (Eucalyptus) (Hình 1.1) E urophylla có phân... phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp 1.3.2.1 Phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp + Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện + Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm + Phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn + Chuyển gen nhờ súng bắn gen + Chuyển gen nhờ silicon carbide... cây biến đổi gen cũng đã được quan tâm nghiên cứu Trong những năm gần đây một số kết quả nghiên cứu chuyển gen cho một số loài cây rừng như Bạch dương, Thông radiata, Liễu, và Bạch đàn đã được tiến hành và thử nghiệm thành công ở một số nước như Hoa Kỳ, Nhật Bản, Brasil, Chi lê và Trung Quốc Mục đích chính cho nghiên cứu chuyển gen cây lâm nghiệp ở đây là chuyển một số gen liên quan đến tăng sinh khối,... Agrobacterium tumefaciens Tuy nhiên, hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn vật liệu dùng để nuôi cấy, thời gian cảm ứng, khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn, nồng độ chất chọn lọc, khả năng tái sinh cấy sau biến nạp gen Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu ứng dụng vào thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài : "Nghiên cứu quy trình chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1). .. nghiệp, đã có 2 đề tài thực hiện nghiên cứu chuyển gen cho cây xoan (chuyển gen tăng cường sinh trưởng) và thông nhựa (chuyển gen kháng sâu bệnh) Sau gần 5 năm thực hiện, 2 đề tài này đã có kết quả bước đầu khả quan So với số lượng các đề tài nghiên cứu về chuyển gen cây nông nghiệp thì cây lâm nghiệp còn chưa nhiều, do vậy, việc phát triển các nghiên cứu về chuyển gen cho cây lâm nghiệp, nhất là đối... biểu hiện gen [3], [6], [14], [15] Tuy nhiên hầu hết các công trình nghiên cứu đều tập trung cho cây nông nghiệp như lúa (chuyển gen chịu hạn, chuyển gen có hàm lượng vitamin A cao), đậu tương (chuyển gen kháng sâu và kháng hạn), ngô (chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu), bông (chuyển gen kháng sâu và chịu hạn), đu đủ (chuyển gen kháng virus đốm vòng) Trong lĩnh vực lâm nghiệp, nghiên cứu tạo... thành công gen EcHB1 vào cây thuốc lá, sau 6 tuần sinh trưởng tại nhà kính cho thấy chiều dài sợi gỗ của các dòng thuốc lá được chuyển gen EcHB1 dài hơn 20% và có sinh trưởng về chiều cao hơn 50% so với đối chứng Thêm vào đó, quan sát sinh trưởng tăng ở rễ, thân, lá tăng hơn và hàm lượng lignin và hemicellulose giảm ở các dòng thuốc lá chuyển gen Điều này cho thấy vai trò quan trọng của gen EcHB1 trong . KHOA HỌC HOÀNG VŨ MINH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ (ECHB1) VÀO BẠCH ĐÀN URÔ (EUCALYPTUS UROPHYLLA) THÔNG QUA AGROVACTERIUM TUMEFACIENS LUẬN VĂN THẠC. KHOA HỌC HOÀNG VŨ MINH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ (ECHB1) VÀO BẠCH ĐÀN URÔ (EUCALYPTUS UROPHYLLA) THÔNG QUA AGROVACTERIUM TUMEFACIENS Chuyên ngành:. nạp gen Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu ứng dụng vào thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài :" ;Nghiên cứu quy trình chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào bạch đàn urô (Eucalyptus