1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC SẦM THỊ THANH HUYỀN ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÕNG LÖA CĨ NGUỒN GỐC TỪ MƠ SẸO CHỊU LẠNH GIỐNG XN CHÂU HƢƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC SẦM THỊ THANH HUYỀN ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÕNG LƯA CĨ NGUỒN GỐC TỪ MƠ SẸO CHỊU LẠNH GIỐNG XUÂN CHÂU HƢƠNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Tâm Thái Nguyên – Năm 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố Tác giả Sầm Thị Thanh Huyền Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn KTV Trần Thị Hồng (phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào vi sinh), KTV Đào Thu Thủy (phịng thí nghiệm Di truyền - Sinh học đại, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Ngun), KTV Lê Đức Huấn (phịng thí nghiệm Sinh học - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên) giúp đỡ trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Khoa Khoa học sống - Trường Đại học Khoa Học tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận văn Tác giả Sầm Thị Thanh Huyền Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ i NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D ADN 2,4D – Axit dichlorphenoxyacetic Axit deoxyribonucleic cs Cộng cADN Complementary ADN ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm XCH Xuân Châu Hương EDTA Ethylen diamin tetra acetic acid kb Kilobase MS Môi trường Murashige Skoog mARN Messenger ARN PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polimorphic ADN R3 Thế hệ thứ ba tái sinh R4 Thế hệ thứ tư tái sinh TAE Tris acetate EDTA TTC 2,3,5, Trichloterazolium- chlorid FAO Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc IRRI Viện Nghiên cứu lúa gạo quốc tế Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ii MỤC LỤC Trang Danh mục chữ viết tắt i Mục lục ii Danh mục bảng iv Danh mục hình v MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu lúa 1.1.1 Nguồn gốc phân loại lúa 1.1.2 Vị trí tầm quan trọng lúa 1.1.3 Tình hình sản xuất lúa giới Việt Nam 1.1.4 Đặc điểm nông sinh học lúa 1.2 Lạnh chế chịu lạnh thực vật 1.2.1 Tác động lạnh lên thực vật 1.2.2 Cơ chế chịu lạnh thực vật khả khắc phục 10 1.2.3 Tác động lạnh tính chịu lạnh lúa 11 1.3 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích hệ gen thực vật .12 1.3.1 Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) 12 1.3.2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic ADN) 14 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu 16 2.1.1 Vật liệu thực vật 16 2.1.2 Hóa chất thiết bị 16 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu .16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp trồng theo dõi đồng ruộng 17 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật 17 2.2.3 Phương pháp phân tích hóa sinh 18 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iii 2.2.4 Phương pháp phân tích sinh lý 20 2.2.5 Phương pháp sinh học phân tử 22 2.2.6 Xử lí kết tính tốn số liệu 24 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Đặc điểm nơng học dịng lúa chọn lọc hệ R3 có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu lạnh 25 3.2 Đánh giá khả chịu lạnh dòng chọn lọc hệ R4 30 3.2.1 Đánh giá khả chịu lạnh dòng chọn lọc hệ R4 giai đoạn mạ 30 3.2.2 Đánh giá khả chịu lạnh dòng chọn lọc hệ R4 mức độ mô sẹo 34 3.3 Đánh giá chất lượng hạt dòng chọn lọc hệ R4 thơng qua số tiêu hóa sinh 36 3.4 Kết phân tích đa hình ADN dòng giống gốc kỹ thuật RAPD 38 3.4.1 Kết tách chiết ADN tổng số từ lúa dòng giống gốc 38 3.4.2 Phân tích đa hình kỹ thuật RAPD 39 3.4.3 Mối quan hệ di truyền dòng giống gốc 47 3.4.4 Nhận xét tính đa hình ADN hệ gen dịng hệ R4 có nguồn gốc từ giống XCH kỹ thuật RAPD 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thành phần hóa học lúa gạo so với loại hạt ngũ cốc Bảng 2.1 Đặc điểm giống Xuân Châu Hương 16 Bảng 2.2 Trình tự nucleotide 10 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 3.1 Đặc điểm nông học mức độ biến dị dòng chọn lọc hệ R3 .28 Bảng 3.2 Tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại xử lý lạnh 40C± 0,50C 32 giai đoạn mạ dòng chọn lọc hệ R4 31 Bảng 3.3 Hàm lượng diệp lục lúa sau xử lý lạnh 120C ± 0,50C giai đoạn mạ dòng chọn lọc hệ R4 32 Bảng 3.4 Khả tạo mô sẹo tỷ lệ sống sót mơ sẹo sau xử lý lạnh 50C ± 0,50C nuôi phục hồi tuần 35 Bảng 3.5 Giá trị OD 485 nm mô sẹo dòng lúa nghiên cứu 36 Bảng 3.6 Hàm lượng protein, lipit đường khử hạt dòng chọn lọc giống gốc 37 Bảng 3.7 Tổng số băng ADN nhân mẫu lúa phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 39 Bảng 3.8 Phân tích đa hình băng ADN nhân 40 Bảng 3.9 Thống kê băng ADN nhân phản ứng RAPD với mồi ngẫu nhiên 47 Bảng 3.10 Hệ số đồng dạng di truyền dòng lúa hệ R4 giống gốc XCH 48 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1 Các dịng chọn lọc R3 có nguồn gốc từ giống XCH 25 Hình 3.2 Tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại xử lý lạnh 40C± 0,50C giai đoạn mạ dòng nghiên cứu 31 Hình 3.3 Hàm lượng diệp lục dòng sau xử lý lạnh 120C±0,50C 33 Hình 3.4 Ảnh điện di ADN tổng số tách từ mẫu lúa 38 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M1 41 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M2 42 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M4 43 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M7 44 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M14 45 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M18 46 Hình 3.11 Sơ đồ so sánh dòng hệ R4 giống gốc XCH mức độ phân tử .49 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Lúa lương thực nửa dân số giới Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung nước Châu Á Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam nôi văn minh lúa nước Đã từ lâu, lúa trở thành lương thực chủ yếu có ý nghĩa quan trọng kinh tế xã hội nước ta Theo thống kê năm 2010, xuất gạo đánh giá đạt kỷ lục khối lượng giá trị [36] Lượng gạo xuất năm 2010 ước đạt 6,88 triệu tấn, kim ngạch 3,23 tỷ USD, so kỳ năm trước tăng 15,4% lượng tăng tới 21,2% giá trị Bình quân giá gạo xuất đạt 468 USD/tấn, tăng 5,02% so với năm trước Tuy nhiên, việc mở rộng khu đô thị, khu công nghiệp, xây dựng giao thông… làm cho diện tích đất nơng nghiệp, đặc biệt đất trồng lúa ngày bị thu hẹp Năm 2007 diện tích trồng lúa nước ta 7201,0 nghìn giảm so với năm 2000 7666,3 nghìn (theo niên giám thống kê 2007), từ dẫn đến giảm sản lượng lúa Đến năm 2008 diện tích trồng lúa nước khoảng 8542,0 với diện tích suất lúa có tăng lên đến năm 2009 sản lượng lúa đạt 38,7 triệu [36] Để tạo giống trồng có suất cao, phẩm chất tốt, có khả chống chịu cao với điều kiện môi trường, nhà khoa học sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, có phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong năm gần đây, khí hậu giới nói chung Việt Nam nói riêng có biến đổi bất thường Theo dự báo, Việt Nam nước chịu ảnh hưởng nặng nề biến đổi khí hậu, tượng thời tiết bất thường xảy liên tục (nóng, lạnh, hạn hán, bão lụt ) Ở nước ta, đặc biệt khu vực miền núi phía Bắc, đồng sông Hồng Bắc Trung Bộ, mùa đơng ảnh hưởng đợt gió mùa đơng bắc, nhiệt độ xuống thấp có đợt rét đậm, rét hại kéo dài gây tác hại lớn cho lúa, đặc biệt giai đoạn mạ lúa cấy vụ Đông xuân Đây nguyên nhân làm giảm suất lúa vùng [1][4] Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 42 * Mồi M2 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M2 thể bảng 3.9 hình 3.6 M XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44 10 kb 6,0 kb 3,0 kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M2 M: Thang ADN chuẩn Băng ADN so với giống gốc Băng ADN xuất so với giống gốc Kết hình 3.6 cho thấy, nhân ngẫu nhiên ADN mẫu lúa nghiên cứu với mồi M2 có băng ADN nhân Các băng ADN có kích thước dao động từ 0,5 - 1,45kb Dòng R4.13 R4.38 xuất nhiều băng với băng ADN Dòng R4.06 giống gốc xuất băng, cịn dịng R4.24 có băng ADN Hai dịng cịn lại R4.20 R4.44 có băng ADN nhân Trong tổng số băng nhân có băng biểu tính đa hình chiếm 71,43% Các dịng R4.13, R4.20, R4.24, R4.38 R4.44 có sai khác so với giống gốc, dịng R4.38 cịn xuất thêm băng điện di so với dòng khác giống gốc có kích thước 0,5kb Các dịng R4.20, R4.44 băng so với giống gốc có kích thước 0,8kb, 1,05kb 1,45kb Dòng R4.24 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 43 băng ADN so với giống gốc có kích thước 1,05kb 1,45kb Còn dòng R4.38 băng so với giống gốc kích thước 1,05kb Như vậy, với kết nhận đây, lần khẳng định có sai khác mặt di truyền dòng lúa hệ R4 so với giống gốc * Mồi M4 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M4 thể bảng 3.9 hình 3.7 M XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44 10 kb 6,0 kb 3,0 kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M4 M: Thang ADN chuẩn Băng ADN so với giống gốc Băng ADN xuất so với giống gốc Hình 3.7 cho thấy, sử dụng mồi M4 để thực phản ứng RAPD mẫu lúa, thu 10 băng ADN có băng biểu tính đa hình chiếm 80% Tất dịng lúa có sai khác so với giống gốc, dịng R4.24 xuất băng ADN so với giống gốc dịng khác có kích thước 1,1kb, dịng R4.24, R4.38 R4.44 xuất băng ADN so với Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 44 giống gốc có kích thước 0,55kb Hai dịng R4.24 R4.44 băng có kích thước 1,25kb, 1,5kb 2,25kb, dịng R4.24 cịn thêm băng kích thước 1,05kb Dịng R4.06 băng ADN so với giống gốc có kích thước 1,05kb, 1,5kb 1,8kb, dịng R4.13 băng ADN có kích thước 0,8kb 1,25kb, cịn dòng R4.20 băng so với giống gốc kích thước 0,8kb Như vậy, đoạn mồi thể tính đa hình nhiều tổng số 10 đoạn mồi sử dụng phản ứng RAPD * Mồi M7 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M7 thể bảng 3.9 hình 3.8 M XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44 10 kb 6,0 kb 3,0 kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M7 M: Thang ADN chuẩn Băng ADN so với giống gốc Băng ADN xuất so với giống gốc Hình 3.8 cho thấy, nhân ngẫu nhiên ADN mẫu lúa với mồi M7 thu băng ADN, có băng thể tính đa hình chiếm 50% Dịng R4.20 xuất băng ADN kích thước băng giống với ĐC Dòng R4.06 R4.13 xuất nhiều băng với băng nhân băng có trình tự giống nhau, xuất thêm băng so với ĐC có trình tự 0,6kb Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 45 1,2kb Dòng R4.24, R4.38 R4.44 xuất băng ADN có băng xuất so với ĐC có kích thước 1,2kb * Mồi M14 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M14 thể bảng 3.9 hình 3.9 M XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44 10 kb 6,0 kb 3,0 kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M14 M: Thang ADN chuẩn Băng ADN so với giống gốc Băng ADN xuất so với giống gốc Kết điện di sản phẩm RAPD với mồi M14 hình 3.9 cho thấy, có băng ADN nhân bản, có băng đa hình chiếm 50% Tất dòng chọn lọc xuất băng ADN so với giống gốc có kích thước khoảng 1,15kb Riêng dòng R4.24 băng ADN so với dịng khác với giống gốc có kích thước 1,4kb Như vậy, dịng R4.24 có sai khác genome nhiều so với giống gốc dòng nghiên cứu * Mồi M18 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M18 thể bảng 3.9 hình 3.10 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 46 M XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44 10 kb 6,0 kb 3,0 kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M18 M: Thang ADN chuẩn Băng ADN so với giống gốc Băng ADN xuất so với giống gốc Điện di sản phẩm phản ứng RAPD với mồi M18 (hình 3.10), chúng tơi thu băng ADN, có băng thể tính đa hình chiếm 33,33% Các dịng R4.06, R4.13, R4.20, R4.24 R4.38 có băng ADN xuất thêm băng ADN so với giống gốc có trình tự 1,3kb, cịn dịng R4.44 có băng ADN giống so với giống gốc Như vậy, xuất băng ADN với mồi M18 lần chứng tỏ dịng lúa R4 có có thay đổi mức độ genome so với giống gốc Qua kết phân tích sản phẩm RAPD mồi ngẫu nhiên với mẫu lúa nghiên cứu cho thấy, mẫu lúa có khác mặt di truyền Để thiết lập mối quan hệ tương đồng di truyền, tiến hành mã hoá số liệu băng ADN thu ký tự theo qui ước 1= xuất băng ADN, 0= không xuất băng ADN Kết thống kê băng ADN mẫu lúa nghiên cứu tiến hành phản ứng RAPD với mồi đa hình trình bày bảng 3.9 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 47 Bảng 3.9 Thống kê băng ADN nhân phản ứng RAPD với mồi ngẫu nhiên Mồi Kb Dòng 13 20 24 38 44 1,45 1 1 1,0 1 1 1 0,55 1 1 0,5 0 0 1,45 1 0 1,25 1 1 1,05 1 0,85 1 0,8 0,7 Dòng 06 13 20 24 38 44 1,2 1 1 1,15 1 1 1 0,85 1 1 1 1 0,6 1 0 0 2,6 1 1 1 1 1 2,25 1 1 0 0 1,8 1 1 1 1 1 1,5 1 1 1 1 1,25 1 0 0 1 1 1,1 0 0 0 0,5 0 0 1,05 1 1 1,4 1 1 1 0,85 1 1 1 1,15 1 1 1 0,8 1 0 1 M14 0,85 1 1 1 0,55 0 0 1 0,75 1 1 1 1,35 1 1 1 1 1 1 1 1 1 M2 06 Kb Gốc M1 Gốc Mồi M7 M4 M18 1,3 0,55 Với tổng số 163 băng ADN thu mẫu lúa nghiên cứu, tiến hành xử lý số liệu phần mềm NTSYS 2.0 để thiết lập mối quan hệ di truyền sơ đồ hình 3.4.3 Mối quan hệ di truyền dòng giống gốc Dựa xuất không xuất băng ADN dòng nghiên cứu so với giống gốc điện di sản phẩm RAPD với mồi M1, M2, M4, M7, M14 M18, xác định hệ số đồng dạng di truyền dòng nghiên cứu so với giống gốc mức độ phân tử Dựa xuất hay không xuất băng ADN dòng giống gốc điện di sản phẩm RAPD thống kê, chúng tơi thiết lập mối quan hệ dịng mức độ phân tử Số liệu tính tốn phân tích theo Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 48 chương trình NTSYSpc version 2.0 (theo quy ước 1: xuất hiện; 0: khơng xuất hiện) để tìm sai khác dịng lúa thơng qua biểu đồ hình cây, theo phương pháp tính hệ số di truyền giống kiểu phân nhóm Kết trình bày bảng 3.10 hình 3.11 Bảng 3.10 Hệ số đồng dạng di truyền dòng lúa hệ R4 giống gốc XCH XCH R4.06 R4.13 R4.20 R4.24 R4.38 R4.44 XCH 1,0000 R4.06 0,8180 1,0000 R4.13 0,8636 0,8637 1,0000 R4.20 0,7698 0,6604 0,8181 1,0000 R4.24 0,7269 0,7253 0,7921 0,6818 1,0000 R4.38 0,7725 0,7727 0,9091 0,8945 0,7920 1,0000 R4.44 0,6362 0,7268 0,7548 0,6819 0,7273 0,7549 1,0000 Kết phân tích bảng 3.10 cho thấy, hệ số tương đồng di truyền dòng lúa giống gốc XCH dao động từ 0,6362 - 0,9091 (hệ số sai khác di truyền 0,0909 - 0,3638) Trong đó, hai dịng có hệ số đồng dạng di truyền cao (0,9091) R4.13 R4.38, hai dịng có hệ số đồng dạng di truyền nhỏ (0,6362) R4.44 XCH Mức độ khác biểu hệ số sai khác dòng giống gốc, hệ số sai khác dòng giống gốc dao động từ 0,0909 (1 0,9091) đến 0,3638 (1 - 0,6362) Kết so sánh khác dòng nghiên cứu so với giống gốc cho thấy, dịng hệ R4 giống gốc có hệ số tương đồng di truyền sai khác chia làm hai nhánh cây: Nhánh gồm dòng R4.44 có hệ số sai khác so với giống gốc XCH 0,3638 (1 - 0,6362) sai khác so với dòng khác 0,073 (0,7549 - 0,6819) Nhánh hai chia thành nhánh phụ: - Nhánh phụ dịng R4.24, có hệ số sai khác so với giống gốc 0,2731 (1 - 0,7269) - Nhánh phụ hai gồm hai nhánh nhỏ, nhánh nhỏ gồm dòng R4.06 giống gốc XCH, dòng R4.06 có hệ số sai khác so với giống gốc 0,182 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 49 (1 - 0,8180), nhánh nhỏ hai gồm dòng R4.13, R4.38 R4.20 Nhánh nhỏ hai chia thành hai nhánh nhỏ, nhánh nhỏ gồm dòng R4.13 R4.38, nhánh nhỏ cịn lại có dịng R4.20 Dịng R4.13 R4.38 có hệ số sai khác so với giống gốc 0,1364 (1 - 0,8636) 0,2275 (1 - 0,7725) Đồng thời, hệ số sai khác hai dòng nhỏ 0,0909 (1 - 0,9091) Hình 3.11 cho thấy, khác mức độ phân tử biểu hệ số sai khác dòng so với giống gốc Như vậy, sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để phân tích đa dạng di truyền dòng lúa so với giống gốc Sự đa hình sản phẩm RAPD kết thay đổi điểm gắn mồi (đột biến điểm) thay đổi nhiễm sắc thể vùng nhân (thêm đoạn, hay đảo đoạn) gây thay đổi kích thước hay ngăn cản nhân ADN mẫu Do đa hình thường nhận có mặt hay vắng mặt sản phẩm nhân từ locut Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu chọn dịng chịu hạn, chịu nóng với giống CR203 [21] chọn dòng chịu lạnh giống C71 [7] XCH R4.06 R4.13 R4.38 R4.20 R4.24 R4.44 0,72 0,77 0,81 0,86 0,92 Hệ số giống Hình 3.11 Sơ đồ mối quan hệ di truyền dòng hệ R4 giống gốc XCH mức độ phân tử sử dụng mồi M1, M2, M4, M7, M14, M18 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 50 3.4.4 Nhận xét tính đa hình ADN hệ gen dịng hệ R4 có nguồn gốc từ giống XCH kỹ thuật RAPD (1) Đã tách chiết ADN với hàm lượng chất lượng tốt đảm bảo cho nghiên cứu (2) Phân tích đa hình mẫu lúa với 10 mồi ngẫu nhiên có 6/10 mồi cho tính đa hình Trong đó, mồi M4 cho tính đa hình cao (80%) mồi M18 cho tính đa hình thấp (33,33%) (3) Phân tích băng ADN nhân sử dụng đoạn mồi M1, M2, M4, M7, M14 M18 xác định hệ số sai khác dòng giống gốc dao động từ 0,0909 (1 - 0,9091) đến 0,3638 (1 - 0,6362) (4) Biểu đồ hình hệ số tương đồng di truyền mẫu lúa nghiên cứu xếp thành nhánh chính: nhánh gồm dòng R4.44, nhánh gồm nhánh phụ (nhánh phụ 1: dòng R4.24; nhánh phụ gồm nhánh nhỏ: nhánh nhỏ gồm dòng R4.20, R4.13 R4.38; nhánh nhỏ gồm giống gốc XCH R4.06) Như vậy, dòng nghiên cứu hệ R4 có thay đổi đáng kể mức độ phân tử gen so với giống gốc Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Các dòng chọn lọc hệ R3 có nhiều đặc điểm bật so với giống gốc (chiều cao cây, chiều dài bông, số nhánh hữu hiệu/khóm, khối lượng 1000 hạt ), dịng R3.38 R3.44 có nhiều đặc điểm tốt Ở giai đoạn mạ có 100% dịng chọn lọc có gia tăng khả chịu lạnh so với giống gốc, đặc biệt dòng R4.38 R4.44 Sau xử lý lạnh nhân tạo, có 5/6 dịng chọn lọc có hàm lượng diệp lục cao giống gốc, dịng R4.38 R4.44 có hàm lượng diệp lục giảm Xử lý mô sẹo nhiệt độ 50C ± 0,50C với ngưỡng thời gian ngày làm ức chế sinh trưởng mơ sẹo Có 5/6 dịng chọn lọc có tỷ lệ tạo mơ sẹo cao so với giống gốc 4/6 dịng có tỷ lệ mơ sẹo sống sót sau tuần cao so với giống gốc Thu 100% dòng chọn lọc hệ R4 có nguồn gốc từ giống XCH có chất lượng hạt tốt so với giống gốc dịng R4.44 tốt Sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen dòng hệ R4 so với giống gốc XCH cho thấy: (a) Trong 10 mồi có mồi biểu tính đa hình, mồi M4 cho tính đa hình cao (80%) mồi M18 cho tính đa hình thấp (33,33%) (b) Các dịng chọn lọc giống gốc có mức độ sai khác di truyền dao động từ 0,0909 đến 0,3638 Trong đó, dịng R4.44 có hệ số sai khác di truyền so với giống gốc cao (0,3638) dòng R4.13 có hệ số sai khác di truyền so với giống gốc nhỏ (0,1364) Từ dòng chọn lọc qua hệ chọn dịng bật R4.38 R4.44 có nguồn gốc từ giống XCH có chất lượng tốt khả chịu lạnh cao so với giống gốc ĐỀ NGHỊ Dịng R4.38 R4.44 có nguồn gốc từ giống XCH có khả chịu lạnh tốt số dịng lúa nghiên cứu, tuyển chọn cho vùng trồng lúa thường xuyên xảy lạnh giá Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Diệp, Lê Thị Muội (1995), “Nghiên cứu khả chịu lạnh chịu khô mức độ mơ sẹo lúa giống có nguồn gốc sinh thái khác nhau”, Tạp chí Sinh học, 17 (1), tr 25 – 29 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu thiệt hại môi trường lúa, Nxb Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1999), Di truyền phân tử: Những nguyên tắc chọn giống trồng, Nxb Nông Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành hóa sinh học, Nxb Giáo dục Lê Xuân Đắc, Đinh Thị Phịng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (1999), „„Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá tính đa hình DNA số dịng chọn lọc từ mơ sẹo giống C71‟‟, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, Hà Nội, tr.1341 - 1347 Nguyễn Ngọc Đệ (2008), Giáo trình lúa, Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2007), „„Cấu trúc vector plasmid mang gen kháng sâu ứng dụng tạo trồng chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens‟‟, Hội nghị Khoa học Công nghệ 2007, tr 345 - 350 10 Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp – Ứng dụng), Nxb Giáo dục 11 Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 53 12 INGER, IRRI (1996), Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa, Xuất lần thứ 4, Tài liệu dịch Viện Khoa học kỹ thuật Việt Nam, 59 trang 13 Nguyễn Thị Lang (2002), Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học, Nxb Nông Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh 14 Lê Dỗn Diên (2001), “Nghiên cứu chất lượng lúa Việt Nam”, Hội thảo quốc tế Sinh học Hà Nội, tr 61-68 15 Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hố sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội 16 Chu Văn Mẫn (2001), Ứng dụng tin học sinh học, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội 17 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên 18 Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội 19 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dịng chịu hạn lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 20 Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dịng chịu nóng lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 21 Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Thu Giang (2008), „„Đánh giá đa hình ADN số dịng lạc có nguồn gốc từ mơ sẹo nước‟‟, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thái Ngun, số 4, tập 1, tr 58 - 64 22 Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2010), “Nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử số giống ngô (Zea mays L.) kỹ thuật RAPD”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Thái Nguyên, số 10, tr 69 - 73 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 54 23 Lị Thị Mai Thu, Chu Hồng Mậu, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Bình (2008), “Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống lúa cạn có khả chịu hạn khác nhau”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thái Ngun, số 3, tập 1, tr 57 - 63 24 Nguyễn Thanh Tường, Nguyễn Bảo Vệ, Võ Công Thành (2005), “Khả chịu mặn đa dạng di truyền protein dự trữ số giống lúa trồng ven biển đồng sơng Cửu Long”, Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, số 3, tr 49 - 57 25 Viện Nơng hóa thổ nhưỡng (1998), Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón, trồng, Nxb Nơng nghiệp 26 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1999), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh 27 Benze Xiao (2007), “Over - expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field condition”, Theor Appl Genet, 115, pp 35 - 46 28 Gamborg O L., Phillip G C (1995), Basal media for plant cell and tissue culture in: Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental methods, Springer Heidelberg, pp 301 - 306 29 Gawel N.J., Jarret R.H., (1991), A modified CTAB ADN extraction procedure for Musaand Ipomea, Plant Mol Biol Rep 9: 262–266 30 Graham D., Patterson B.D (1982) Responses of plant to low non-Physiol 33, 347-372 31 Guy C.L (1990), “Cold acclimation and freezing stress tolerance: Role of protein metabolism”, Ann, Rev, Plant Physiol Mol Biol 41, 187-223 32 Honghong Hu., Xiong Lizhong (2004), “Transcription factor gene OsNACx from rice and use thereof for improving plant tolerance to drought and salt”, Patent Application Publication 33 Towill L E., Mazur P (1975), “Studies on the reduction of 2, 3, triphenyltetrazolium chloride as a viability assay for plant tissue cultures”, Can J Bot 53, pp.1097 - 1102 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 55 34 Welsh J., McClelland M (1991), Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primer”, Nucleic Acids Res 18, pp 7213- 7218 Trang web 35 http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/2/2/88582/Lua-gao-the-gioi-2011-2012 36 http://dvcs.thin kfree.com/docs/view.php%3Fds 37 http://www.agro.gov.vn/news/newsdetail.aspx?targetid=18467 38 http://www.vietrade.gov.vn/go/2681-xuat-khau-gao-cua-viet-nam-mua-vu- 2011- 2012.html 39 http://www.agbiotech.com.vn/vn/? 40 http://www.springerlink.com Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 56 CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN Đề tài: Đánh giá số dịng lúa có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu lạnh giống Xuân Châu Hương Của học viên: Sầm Thị Thanh Huyền Đã sửa chữa theo góp ý hội đồng nghiệm thu Thái Nguyên, ngày 15 tháng 11 năm 2013 Giáo viên hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ... khả chịu lạnh dòng nghiên cứu 3.2.2 Đánh giá khả chịu lạnh dòng chọn lọc hệ R4 mức độ mô sẹo 3.2.2.1 Tỷ lệ sống sót mơ sẹo dịng chọn lọc giống gốc sau xử lý lạnh Để đánh giá khả chịu lạnh dòng. .. cứu đề tài: ? ?Đánh giá số dịng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh giống Xuân Châu Hương? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Tuyển chọn dịng lúa ưu việt đặc điểm nơng học, chất lượng hạt khả chịu lạnh - Xác... khác hệ gen dòng chọn lọc so với giống gốc Nội dung nghiên cứu - Phân tích đặc điểm nơng học dịng hệ R3 có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu lạnh giống Xuân Châu Hương - Đánh giá khả chịu lạnh dịng chọn