ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NCS. PHAN TƯỜNG LỘC NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HIV-1 p24 TẠO PROTEIN KHÁNG NGUYÊN VÀO LỤC LẠP CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN Chuyên ngành: Hóa Sinh học Mã số chuyên ngành: 62 42 30 15 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2013 Công trình được hoàn thành tại: Phòng Công nghệ Gen, Viện Sinh học Nhiệt đới. Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Thanh TS. Nguyễn Hữu Hồ Phản biện 1: PGS.TS. Trần Văn Minh Phản biện 2: PGS.TS. Bùi Văn Lệ Phản biện 3: TS. Vương Đình Tuấn Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Phạm Xuân Hội Phản biện độc lập 2: PGS.TS. Chu Hoàng Hà Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp cơ sở đào tạo họp tại: Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM 2. Thư viện trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-HCM CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU Đề tài “Nghiên cứu chuyển nạp gen HIV-1 p24 tạo protein kháng nguyên vào lục lạp cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) bằng phương pháp bắn gen” đã được thực hiện tại Phòng Công nghệ Gen, Viện Sinh học Nhiệt đới. 1.1. Mục đích nghiên cứu Tính cấp thiết HIV là một đại dịch mà cho đến thời điểm này vẫn chưa có một liệu pháp triệt để nào để phòng ngừa hoặc loại bỏ hoàn toàn virus HIV ra khỏi cơ thể người đã nhiễm bệnh. Cách điều trị lý tưởng hiện nay là kết hợp nhiều liệu pháp kháng virus để kéo dài và cải thiện chất lượng cuộc sống người bệnh. Tạo vaccine phòng chống HIV được xem là hướng nghiên cứu có nhiều tiềm năng và khả thi. Protein capsid HIV-1 p24 là một marker sớm có thể gây tạo đáp ứng miễn nhiễm dịch thể và tế bào. Do đó, protein này được xem là một kháng nguyên thích hợp, để phát triển thành các vaccine HIV đa thành phần và đã bước đầu được thử nghiệm chữa trị. Ngoài ra protein p24 cũng được ứng dụng trong công nghệ tạo các kit chẩn đoán HIV trong giai đoạn nhiễm sớm và muộn. Biểu hiện protein HIV-1 p24 tái tổ hợp, có đặc điểm miễn nhiễm như nguyên bản, ổn định, bền vững với số lượng lớn, qua con đường thực vật là rất thiết thực và có ý nghĩa nhằm đáp ứng các nhu cầu nêu trên. Mục đích của đề tài là nghiên cứu chuyển gen HIV-1 p24 vào lục lạp giống thuốc lá Virginia có năng suất cao, được thuần hóa và trồng phổ biến ở Việt Nam; kiểm tra, đánh giá sự sinh trưởng và phát triển của cây chuyển gen, sự biểu hiện của protein tái tổ hợp HIV-1 p24. Tính mới của đề tài - Xây dựng quy trình chuyển gen vào lục lạp bằng phương pháp bắn gen trên giống thuốc lá Virginia đã được thuần hóa tại Việt Nam. - Chuyển thành công gen HIV-1 p24 vào lục lạp cây thuốc lá Virgnia. 1 - Cây thuốc lá Virginia chuyển gen HIV-1 p24 biểu hiện protein p24 ổn định và có kiểu hình bình thường. 1.2. Nội dung và phạm vi của vấn đề nghiên cứu - Chuẩn bị nguồn plasmid dùng để chuyển gen lục lạp thuốc lá. - Ứng dụng các phương pháp nuôi cấy mô để tạo nguồn nguyên liệu in vitro phục vụ chuyển gen, xây dựng hệ thống tái sinh, khảo sát các yếu tố chọn lọc đối với mô, cây thuốc lá. - Xây dựng qui trình chuyển gen vào lục lạp cây thuốc lá bằng phương pháp bắn gen. - Chọn lọc và thu nhận cây chuyển gen. - Phân tích sinh học phân tử về di truyển cây thuốc lá chuyển gen lục lạp. - Phân tích biểu hiện protein HIV-1 p24 tái tổ hợp trong cây thuốc lá chuyển gen lục lạp. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Công trình tạo ra cây thuốc lá Virginia chuyển gen biểu hiện protein HIV-1 p24 ở lục lạp với thành công bước đầu có thể làm cơ sở để phát triển các chiến lược biến nạp gen tiên tiến hơn để nâng cao hàm lượng protein tái tổ hợp tích lũy. - Protein HIV-1 p24 tái tổ hợp có thể được dùng để nghiên cứu trong các hướng phối hợp tạo vaccine phòng chống bệnh cũng như các kit chẩn đoán HIV. - Đối với công tác nghiên cứu khoa học tại cơ sở thực hiện, đề tài đóng góp xây dựng hoàn thiện các quy trình chuyển gen lục lạp ở thuốc lá nói riêng và ở thực vật nói chung, kiện toàn các điều kiện phân tích sinh học phân tử như PCR, Southern blot, Western blot, ELISA. Bên cạnh đó đề tài cũng bước đầu xây dựng được các mô hình cơ bản về ly trích, tinh sạch protein từ thuốc lá chuyển gen lục lạp. CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN Dược liệu sinh học như kháng thể và kháng nguyên vaccine tái tổ hợp 2 flank flank Prrn TrbcL Hiv-1 p24 TpsbA aadA Prrn trnG trnfM đã được sản xuất ở vi khuẩn, nấm men hoặc tế bào động vật. Thực vật và tế bào thực vật đã tham gia như một nhóm chuyên biệt trong nền tảng sản xuất này khá trễ, nhưng cho thấy có nhiều ưu điểm tiềm năng so với các hệ thống đã được thành lập, đặc biệt trong góc độ kinh tế, quy mô, thời gian đáp ứng và các tùy chọn mô hình. Trong đó biểu hiện protein tái tổ hợp thông qua chuyển gen lục lạp là hướng tiên tiến nhất. CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. VẬT LIỆU 3.1.1. Giống thuốc lá Cây thuốc lá giống Virginia TBE2 (V2) được vô mẫu in vitro và giữ giống dùng làm nguyên liệu thí nghiệm. 3.1.2. Vector chuyển gen Sơ đồ 3.1.1. Cấu trúc vector pITB.HIV-1 p24 Plasmid pITB.HIV-1 p24, do TS. Nguyễn Thị Thanh (Viện Sinh học Nhiệt đới) thiết kế và cung cấp, dùng để biến nạp gen vào lục lạp thuốc lá, có kích thước 8344 bp, riêng trình tự gen cần chuyển chèn vào giữa hai vị trí sườn bên khoảng 2,4 kb. Cấu trúc vector như sơ đồ 3.1.1, mang các gen và các promoter đặc hiệu như sau: - aadA: gen mã hóa men aminoglycoside adenylyltransferase, quy định tính kháng hai loại kháng sinh spectinomycin và streptomycin dùng để chọn lọc đối tượng chuyển gen. - HIV-1 p24: gen mã hóa protein HIV-1 p24, là protein vỏ capsid virus HIV. - Prrn: promoter đặc hiệu biểu hiện mạnh ở lục lạp (Promoter rRNA). - TpsbA, TrbcL: trình tự kết thúc (terminator) từ gen psbA và gen rbcL (RUBISCO tiểu đơn vị lớn) ở lục lạp. 3 - Flank: đoạn trình tự gen lục lạp trnG, trnfM là đoạn đồng dạng với mục đích thực hiện tái tổ hợp, hòa nhập cấu trúc chuyển gen vào bộ gen lục lạp (lạp thể). 3.1.3. Môi trường nuôi cấy mô thực vật và vi khuẩn - Môi trường nuôi cấy mô cơ bản là môi trường có thành phần khoáng MS, vitamin B5, pH 5,8. + Môi trường rắn: môi trường cơ bản có bổ sung agar 9 g/l. + Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP, NAA. - Môi trường LB dùng để nuôi cấy E.coli. 3.2. PHƯƠNG PHÁP 3.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh từ mô lá thuốc lá in vitro Nuôi cấy các mảnh lá thuốc lá có kích thước khoảng 1 x 1 cm trên môi trường tái sinh, có thành phần môi trường cơ bản, được bổ sung tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau gồm NAA (0,1; 0,2; 0,3) và BAP (0,5; 1; 1,5) để khảo sát sự phát sinh hình thái của mô lá và chọn môi trường tái sinh hiệu quả nhất. 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh chọn lọc streptomycin và spectinomycin đối với tính chống chịu tự nhiên của mô lá, đoạn thân Mô lá có kích thước khoảng 1 x 1 cm và đoạn thân mang chồi nách được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung các kháng sinh ở nồng độ khác nhau để khảo sát mức độ ức chế của các kháng sinh lên sự tái sinh chồi ở mô lá cũng như sự phát triển thành cây hoàn chỉnh từ đoạn thân, qua đó thiết lập nồng độ chọn lọc phù hợp. Nồng độ kháng sinh sử dụng trong thí nghiệm, với streptomycin là 15, 25, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150; và spectinomycin là 15, 25, 40, 60, 80, 110, 140 (mg/l). 3.2.3. Phương pháp bắn gen (biolistic) Ly trích và tinh sạch vector plasmid pITB.HIV-1 từ sinh khối vi khuẩn E.coli. Bọc DNA plasmid vào hạt vàng (coating) và trải lên các vật liệu mang của thiết bị bắn gen. Bắn gen vào mô lá trong thiết bị Bio-Rad PDS - 4 1000/He, với áp lực để tạo gia tốc là 1100 PSI, khoảng cách đặt mẫu là 6 cm. - Lá sau khi bắn được ủ trong tối 2 ngày trên cùng môi trường, rồi được cắt thành những mảnh kích thước (0,5-1) x (0,5-1) cm và chuyển sang môi trường tái sinh chọn lọc. 3.2.4. Chọn lọc thể chuyển gen Các thể chuyển gen được chọn lọc trên hai loại kháng sinh là spectinomycin và streptomycin, đến nồng độ tối đa là 500 mg/l. 3.2.5. Điện di DNA Điện di DNA trên gel Agarose 0,8%, với các ladder 1 kb và λHindIII. 3.2.6. Phân tích PCR - Ly trích DNA các dòng thuốc lá. - Mồi và các đoạn khuếch đại mong muốn: + Gen aadA, mồi xuôi aadAp1: AACCTCCTATAGACTAGGC, mồi ngược aadAp2: AGCGAAATGTAGTGCTTACG, KTĐKĐ: 250 bp. + Gen HIV-1 p24, mồi xuôi p24 for:ATGGCTAGCGGATCCCCTATT, mồi ngược p24 rev TCTAGAGGAATTCTACTCAGCTTTATGTC, KTĐKĐ: 700 bp. + Gen trnG - gen trnfM, mồi cpT1: GGATTTGGTATAGTTGGCC, mồi cpT2: CTTGTTTATCTATTAGTTTTCAGT, KTĐKĐ: 255 bp (nguyên bản). KTĐKĐ: ~ 2,65 kb (chuyển gen). + Gen trnG - gen HIV-1 p24, mồi cpT1: GGATTTGGTATAGTTGGCC mồi p24 rev TCTAGAGGAATTCTACTCAGCTTTATGTC KTĐKĐ: ~ 2,3 kb (chuyển gen). (KTĐKĐ: kích thước đoạn khuếch đại) 3.2.7. Phân tích Southern blot Phương pháp Southern blot không phóng xạ được thực hiện dựa trên quy trình của McCabe và cs (1997). 5 ~ 5,9 kb TpsbA TrbcL Mẫu dò (probe) đặc hiệu gen psaB kích thước 543 bp được đánh dấu theo phương pháp DIG bằng PCR dùng để phát hiện trình tự DNA cần kiểm tra thông qua lai phân tử. Trình tự đoạn cắt ở lục lạp cây thuốc lá nguyên bản là 3,5 kb và ở cây thuốc lá chuyển gen với đoạn hòa nhập mục tiêu như sơ đồ là ~ 5,9 kb. Sơ đồ 3.2.1. Sơ đồ các gen chuyển vào lục lạp và vị trí giới hạn 3.2.8. Phân tích Western blot Protein tổng số được ly trích từ lá và dùng SDS - PAGE phân tách thành các băng theo trọng lượng phân tử. Các băng protein trên gel được chuyển sang màng và được dò tìm thông qua sự kết hợp với kháng thể đặc hiệu và sau đó được phát hiện bởi kết hợp với kháng thể đặc hiệu loài liên kết các yếu tố tạo phát quang horseradish peroxidase. 3.2.9. Phân tích ELISA Protein tổng số được ly trích từ lá và được phân tích bằng phương pháp ELISA sandwich trực tiếp để định lượng hàm lượng protein tích lũy trong cây. Hai kháng thể được sử dụng là kháng thể đặc hiệu kháng nguyên kết hợp trên pha rắn và kháng thể đặc hiệu kháng nguyên liên kết với yếu tố phát quang alkaline phosphatase. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1. Xây dựng hệ thống tái sinh từ mảnh lá thuốc lá V2 Mô lá thuốc lá được cho tái sinh trên môi trường có tổ hợp BAP và NAA ở các nồng độ khác nhau cho thấy: Ở kết quả khảo sát ở tuần thứ 5 (Bảng 4.1.1), nghiệm thức 4 có 100% mảnh lá tái sinh và số lượng chồi tái sinh nhiều nhất trung bình là 113 chồi/ 6 3,5 kb cây nguyên bản trnS ycf9 trnG Bglll Bglll Prrn rps14 trmfM Prrn psaC HIV-1 p24 aadA psaB nghiệm thức, tập trung ở mép mô lá, mô sẹo rất ít, hầu như không có (Hình 4.1.1). NT4, có tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP 1 mg/l và NAA 0,1 mg/l được sử dụng làm môi trường tái sinh cho các thí nghiệm tiếp theo. Bảng 4.1.1. Giống thuốc lá V2 tái sinh chồi trên môi trường có bổ sung các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng NAA và BAP khác nhau. Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p = 0,01 dựa theo trắc nghiệm Duncan. 7 Nghiệm thức NAA (mg/l) BAP (mg/l) Số chồi trung bình tái sinh trên một nghiệm thức 1 0,1 0,5 35,33 e 2 0,2 0,5 56,67 de 3 0,3 0,5 52,33 de 4 0,1 1 113,3 a 5 0,2 1 66,33 cd 6 0,3 1 88,33 b 7 0,1 1,5 51,33 de 8 0,2 1,5 50,67 de 9 0,3 1,5 86,00 bc CV = 12,58 % Hình 4.1.1. Sự tái sinh chồi của mô lá thuốc lá trên tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BA 1 mg/l NAA 0,1mg/l. 4.2. Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh chọn lọc streptomycin và spectinomycin lên sự tái sinh của mảnh lá và phát triển cây con từ đoạn thân của giống thuốc lá V2 Mô lá được cho tái sinh trên môi trường có bổ sung các kháng sinh ở nồng độ khác nhau và được quan sát từ ngày thứ 18 đến ngày thứ 30. Các đoạn thân có chồi nách cũng được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các kháng sinh tương tự và được quan sát từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 30. Khảo sát ảnh hưởng của streptomycin Bảng 4.2.1. Ảnh hưởng của kháng sinh streptomycin lên sự tái sinh chồi và hình thành rễ cây thuốc lá in vitro. Nồng độ kháng sinh streptomycin (mg/l) 50 75 100 125 150 Tái sinh chồi ++++ +++ + - - Hình thành rễ ++ ++ + - - +: có tái sinh chồi hoặc hình thành rễ. - : không có tái sinh chồi hoặc hình thành rễ. Khảo sát ảnh hưởng của spectinomycin Bảng 4.2.2. Ảnh hưởng của kháng sinh spectinomycin lên sự tái sinh chồi và hình thành rễ cây thuốc lá in vitro. +: có tái sinh chồi hoặc hình thành rễ. 8 Nồng độ kháng sinh spectinomycin (mg/l) 15 25 40 60 80 110 Tái sinh chồi ++++ ++ + - - - Hình thành rễ ++ ++ - - - - [...]... Bắn gen vào mô lá thuốc lá V2 và chọn lọc cây chuyển gen - Plasmid pITB .HIV-1 p24 mang các cấu trúc gen cần chuyển vào lục lạp thuốc lá, gồm Prrn /HIV-1 p24/ TrbcL và Prrn/aadA/TpsbA, được ly trích từ vi khuẩn E.coli, pha loãng đến nồng độ 1µg/ml và được bọc vào hạt vàng để chuẩn bị bắn vào mô lá - Bắn plasmid vào mô lá được thực hiện trên 48 mẫu và cho tái sinh trên môi trường có chất chọn lọc - Kháng. .. rằng, trình tự gen chuyển thông qua tái tổ hợp đồng dạng đã được thực hiện vào đúng vị trí hòa nhập mong muốn trên lục lạp và thay thế trình tự nguyên bản; những dòng chuyển gen kiểm tra đã đạt được trạng thái đồng nhất bộ gen lạp thể chuyển gen (Hình 4.4.4) 4.5 Phân tích Southern blot các dòng thuốc lá V2 chuyển gen Ở thí nghiệm phân tích Southern blot, DNA bộ gen lục lạp từ các dòng chuyển gen và đối... Havana tác giả Zhou chuyển gen từ vector pZSJH 1p24 của hai tác giả cũng có kiểu hình xanh bình thường giống cây nguyên bản tương tự như các cây thuốc lá V2 chuyển gen với vector pITB .HIV-1 p24 4.8 Phân tích biểu hiện protein p24 bằng phương pháp Western blot ở trong các dòng thuốc lá V2 chuyển gen - Bốn dòng thuốc lá chuyển gen T1, T2, T5, T6 được kiểm tra sự biểu hiện của protein p24 bằng phương pháp... Hàm lượng protein p24 ở các dòng phân tích ELISA Mẫu V2 0,079 T1 0,159 T2 0,383 T5 0,348 ∆OD 0,08 0,304 0,269 Protein p24 µg/ml 23,53 89,41 79,12 Protein p24 µg/g lá 94,12 1,74 357,65 6,22 316,47 5,66 OD Lá 12 % protein p24/ protein 22 tổng 0,085 0,422 0,373 0,252 ∆OD 0,337 0,288 0,167 Protein p24 µg/ml 99,12 396,4 7 84,71 49,12 338,82 196,47 5,31 3,14 OD Lá 20 Protein p24 µg/g lá % protein p24/ protein. .. dòng chuyển gen thu được/số mẫu chuyển gen 8,4% Tỉ lệ trung bình các dòng chuyển gen giả định thu được trên tổng số mẫu chuyển gen là 8,4% (Bảng 4.3.1) Tần số chuyển gen ở giống thuốc lá V2 trong công trình nghiên cứu thấp hơn so với ở giống thuốc lá Maryland Mammoth trong công trình của McCabe và cs (2008) đạt mức 26,6%, tương đương với tỉ lệ chuyển gen trên giống thuốc lá Petite Havana có tỉ lệ chuyển. .. T6: các dòng thuốc lá chuyển gen giả định PC: Vector pITB .HIV-1 p24 đối chứng dương V2: cây thuốc lá nguyên bản đối chứng âm Marker: 1 kb (Biolabs) Như vậy, có thể kết luận các gen HIV-1 p24 và gen aadA đã được chuyển vào các dòng thuốc lá T1, T2, T5, T6 Các dòng này sẽ được tiếp tục phân tích các đặc điểm liên kết giữa các gen trong cấu trúc gen chuyển 11 và với các trình tự trên lục lạp Ngoài ra, khi... định được các băng protein p24 ở dòng đối chứng dương và các dòng chuyển gen T1, T2, T5, T6 Ở cây V2 nguyên bản đối chứng âm không có băng protein p24 (Hình 4.8.2) Kết quả Western blot cho thấy phát hiện được các băng protein p24 trong phản ứng kết hợp kháng thể đặc hiệu gắn kết trên màng tại vị trí mong muốn khoảng 26 kDa Điều này chứng tỏ gen HIV-1 p24 đều có biểu hiện protein p24 với kích thước... lá nguyên bản đối chứng âm Marker: 1 kb (Biolabs) Kiểm tra trình tự từ gen HIV-1 p24 đến gen trnG Marker V2 PC T1 T2 T5 T6 ~ 2,3 kb Hình 4.4.3 Phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của trình tự liên kết từ gen trnG đến gen HIV-1 p24 (với các mồi cpt1 và p24 rev, với băng khuếch đại mong muốn ~ 2,3 kb) 12 T1, T2, T5, T6: các dòng thuốc lá chuyển gen PC: vector pITB.HIV- 1p24 đối chứng dương V2: cây nguyên. .. hiện gen HIV-1 p24 ở cây thuốc lá chuyển gen lục lạp Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 15, tr 52-68 2 Phan Tường Lộc, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Thị Thanh (2011), Bước đầu chuyển gen HIV -p24 vào lục lạp cây thuốc lá giống V2 bằng phương pháp bắn gen Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, số 14 (T1), tr 35-46 3 Nguyễn Thị Thanh, Phan Tường Lộc, Tôn Thất Huân, Phạm Đức Trí (2010), Nghiên cứu chuyển. .. Huân, Phạm Đức Trí (2010), Nghiên cứu chuyển nạp gien HIV-1 p24 vào lục lạp cây thuốc lá 24 tạo protein kháng nguyên tái tổ hợp để ứng dụng trong y dược Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, CĐ Công nghệ Sinh học, tr 9-14 4 Nguyễn Thị Thanh, Phan Tường Lộc, Tôn Thất Huân, Phạm Đức Trí, Hoàng Văn Dương (2010), Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển nạp gien lục lạp bằng phương pháp bắn gien Tạp chí . ĐẦU Đề tài Nghiên cứu chuyển nạp gen HIV-1 p24 tạo protein kháng nguyên vào lục lạp cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) bằng phương pháp bắn gen đã được thực hiện tại Phòng Công nghệ Gen, Viện. TỰ NHIÊN NCS. PHAN TƯỜNG LỘC NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HIV-1 p24 TẠO PROTEIN KHÁNG NGUYÊN VÀO LỤC LẠP CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN Chuyên ngành: Hóa Sinh học Mã. hiện protein HIV-1 p24 tái tổ hợp trong cây thuốc lá chuyển gen lục lạp. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Công trình tạo ra cây thuốc lá Virginia chuyển gen biểu hiện protein HIV-1 p24 ở lục