Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ************************** CHU THỊ HOA TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HÓA CHITINASE CỦA BACILLUS LICHENIFORMIS KNUC213 TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến-ngƣời thầy đã dìu dắt tôi những bƣớc đi đầu tiên trên con đƣờng nghiên cứu khoa học, truyền đạt cho tôi những kiến thức, chỉ bảo tận tình và có những đóng góp mới mẻ, sâu sắc về lĩnh vực nghiên cứu. Đồng thời, thầy cũng tạo điều kiện tốt nhất về thời gian và điều kiện làm việc khi tôi thực hiện những nghiên cứu trong luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Hiếu, KS. Quách Ngọc Tùng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, góp ý cho luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo mọi điều kiện về mặt thời gian, luôn động viên khích lệ tôi trong quá trình học tập. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời thân đã luôn yêu thƣơng, ủng hộ, động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2012 Học viên Chu Thị Hoa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên đầy đủ Amp Ampicillin Bp Base pair CHI Chitinase DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxyribonucleic triphotphate EDTA Ethylennediaminetetraacetic EtBr Ethidium Bromide GlcN N- glucosamine GlcNAc N- acetylglucosamine LB Môi trƣờng Luria Bertani OD Optical Density (mật độ quang) PCR Polymerase chain reaction rCHI Chitinase tái tổ hợp SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Đệm Tris – Acetate – EDTA TE Đệm Tris – EDTA YPD Môi trƣờng Yeast – Peptone – Dextrose YPDS Môi trƣờng Yeast – Peptone – Dextrose - Sorbitol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 1.2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 Gen chi mã hóa chitinase từ các chủng Bacillus licheniformis Tình hình nghiên cứu chitinase trên thế giới Đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn KNUC213 trên môi các trƣờng thạch khác nhau Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa của chủng KNUC213 khi sử dụng kit API 50 CHB sau 48 giờ nuôi cấy ở 37C Ảnh hƣởng của nhiệt độ, nồng độ muối, pH đến khả năng phát triển của chủng B. licheniformis KNUC213 Kết quả so sánh độ tƣơng đồng trình tự amino acid của endochitinase từ B. licheniformis KNUC213 (AEQ55312) với các trình tự amino acid của chitinase tƣơng ứng từ các chủng B. licheniformis khác đƣợc đăng ký trên GenBank (NCBI) So sánh hoạt tính enzyme chitinase của các chủng nghiên cứu tại các thời điểm khác nhau Ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt tính rCHI của chủng nấm men P. pastoris Y2 8 15 35 37 38 43 48 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. CHITIN 3 1.1.1. Cấu trúc hóa học của chitin 3 1.1.2. Vai trò và ứng dụng của chitin 4 1.2. CHITINASE 5 1.2.1. Giới thiệu về chitinase 5 1.2.2. Cơ chế thủy phân chitin 5 1.2.3.2. Dựa vào phản ứng phân cắt 6 1.2.3.3. Căn cứ vào cấu trúc phân tử 7 1.2.4. Cấu trúc phân tử chitinase 8 1.2.5. Nguồn thu nhận chitinase 9 1.2.5.1. Chitinase từ thực vật 9 1.2.5.2. Chitinase từ động vật 10 1.2.5.3. Chitinase từ vi sinh vật 10 1.2.5.4. Chitinase từ vi sinh vật tái tổ hợp 11 1.2.6. Vai trò và ứng dụng của chitinase 12 1.2.7. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của chitinase 13 1.2.7.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 13 1.2.7.2. Ảnh hƣởng của pH 14 1.2.7.3. Ảnh hƣởng của ion kim loại 14 1.2.8. Tình hình nghiên cứu chitinase trên thế giới và Việt Nam 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.2.8.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15 1.2.8.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 17 1.3. BIỂU HIỆN CHITINASE TRONG PICHIA PASTORIS 18 1.3.1. Đặc điểm của hệ biểu hiện P. pastoris 18 1.3.2. Vector biểu hiện ở pPICZA 20 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. VẬT LIỆU 22 2.1.1. Các chủng sinh vật và plasmid 22 2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 22 2.1.3. Các dung dịch sử dụng và môi trƣờng nghiên cứu 22 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn KNUC213 24 2.2.2. Tách DNA tổng số của vi khuẩn Bacillus licheniformis KNUC213 25 2.2.3. Khuếch đại gen chi mã hóa chitinase của B. licheniformis KNUC21325 2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose 27 2.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR 27 2.2.6. Cắt và ghép nối gen 27 2.2.7. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt 28 2.2.8. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn 29 2.2.9. Giải trình tự gen chi 29 2.2.10. Thiết kế vector biểu hiện gen chi trong P. pastoris 30 2.2.11. Biến nạp vector tái tổ hợp vào P. pastoris X33 bằng phƣơng pháp xung điện . 30 2.2.12. Biểu hiện rCHI 31 2.2.13. Tách chiết enzyme ngoại bào 32 2.2.14. Điện di protein trên gel polyacrylamide-SDS 32 2.2.15. Xác định hoạt tính của enzyme chitinase 32 2.2.16. Xác định đặc tính của rCHI 34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN KNUC213 36 3.1.1. Đặc điểm nuôi cấy 36 3.1.2. Đặc điểm hình thái tế bào 37 3.1.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 37 3.2. TÁCH DÒNG GEN chi MÃ HÓA CHITINASE CỦA CHỦNG B. licheniformis KNUC213 40 3.2.1. Tách DNA tổng số 40 3.2.2. Khuếch đại gen chi bằng kỹ thuật PCR 40 3.2.3. Tách dòng gen chi trong vector pJET1.2/blunt 41 3.2.4. Giải và phân tích trình tự gen chi của B. licheniformis KNUC213 43 3.3. BIỂU HIỆN GEN chi MÃ HÓA CHITINASE TỪ CHỦNG B. licheniformis KNUC213 TRONG P. pastoris X33 45 3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA::chi 45 3.3.2. Tạo chủng P. pastoris tái tổ hợp có khả năng biểu hiện rCHI 46 3.3.3. Biểu hiện rCHI bởi chủng P. pastoris Y2 48 3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 51 3.4.2. Ảnh hƣởng của pH 52 3.4.3. Ảnh hƣởng của ion kim loại 54 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHỊ 57 Phụ lục 1: Sơ đồ cấu trúc plasmid pJET1.2/blunt 62 Phụ lục 2: Sơ đồ cấu trúc plasmid pPICZA 63 Phụ lục 3: Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của chủng Bacillus licheniformis KNUC213 65 Phụ lục 4: Trình tự gen chi của chủng Bacillus licheniformis KNUC213. 66 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Chitin là polyme sinh học không phân nhánh, đƣợc cấu thành từ các đơn vị N-acetyl D-glucosamin (GlcNAc) thông qua liên kết β-(1,4)-glucozit. Chitin rất phổ biến, phân bố rộng rãi trong tự nhiên chỉ sau cellulose và đóng vai trò là polysaccharide cấu trúc của các sinh vật nhƣ: thành tế bào của nấm, khung vỏ ngoài của động vật chân đốt, vỏ ngoài của các loài giáp xác và giun tròn Một trong những phƣơng pháp chuyển hóa chitin tạo các dẫn xuất mạch ngắn chitin-oligosaccharide có giá trị kinh tế và ứng dụng cao, an toàn đối với con ngƣời và môi trƣờng là sử dụng enzyme chitinase. Chitinase (EC 3.2.1.14) là enzyme phân hủy cơ chất chitin không hòa tan trong nƣớc thành các sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan thông qua quá trình thủy phân liên kết β-(1,4)-glucozit. Hiện nay, chitinase đƣợc ứng dụng chủ yếu trong sản xuất chitooligosaccharide, nano-chitin, N-acetyl D- glucosamine. Đây là những sản phẩm giá trị ứng dụng cao và đƣợc sử dụng trong thực phẩm, nông nghiệp, y dƣợc, kháng nấm và côn trùng. Ngoài ra, chitinase còn đƣợc sử dụng nhƣ thuốc trừ sâu sinh học trong nông nghiệp nhờ khả năng phân hủy chitin cấu trúc trong thành tế bào của nấm, côn trùng gây bệnh và xử lý các chất thải giàu chitin Theo các công bố trên thế giới, chitinase có thể thu nhận từ nhiều nhóm vi sinh vật nhƣ: vi khuẩn (Serratia sp., Bacillus sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp., Alteromonas sp…), nấm sợi (Trichoderma sp., Gliocladium virens, Fusarium chlamydosporum, Trichothecium roseum, Stachybotry elegans, Talaromyces flavus,…), xạ khuẩn (Streptomyces griseus, Str. plicatus, Str. lydicus…). Tuy nhiên, chitinase thu nhận từ các chủng tự nhiên thƣờng không ổn định, hoạt tính không cao, chứa nhiều loại chitinase khác nhau (nhóm exochitinase và endochitinase) ảnh hƣởng đến phổ sản phẩm thủy phân chitin cũng nhƣ quy mô thu nhận và ứng dụng chitinase nhằm tạo ra các sản phẩm chuyển hóa của chitin. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hiện nay, nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã nâng cao hiệu suất của quá trình sản xuất chitinase bằng cách tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp. Cho đến nay gen chi mã hóa chitinase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau đã đƣợc biểu hiện thành công trong nấm men, vi khuẩn; trong đó hệ thống biểu hiện trên nấm men Pichia pastoris đang đƣợc sử dụng rộng rãi do có các đặc tính: nuôi cấy đơn giản, đạt sinh khối cao trên môi trƣờng khoáng rẻ tiền, dễ dàng nâng cấp quy mô sản xuất, dễ điều khiển hệ thống biểu hiện enzyme nhờ quá trình cảm ứng Xuất phát từ những tiềm năng ứng dụng của chitinase và ƣu điểm của hệ thống biểu hiện trên P. pastoris, chúng tôi đã thực hiện đề tài: ―Tách dòng và biểu hiện gene mã hóa chitinase của B. licheniformis KNUC213 trong Pichia pastoris‖ nhằm nâng cao quá trình sinh tổng hợp endochitinase có hoạt tính cao, tạo tiền đề cho sản xuất enzyme ở quy mô lớn. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với các nội dung chính sau: - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn KNUC213 có hoạt tính chitinase nhằm khai thác nguồn gen. - Tách dòng và phân tích trình tự gen chi mã hóa chitinase của chủng B. licheniformis KNUC213. - Biểu hiện gen chi mã hóa chitinase của chủng B. licheniformis KNUC213 trong P. pastoris X33. - Bƣớc đầu nghiên cứu một số tính chất của chitinase tái tổ hợp (rCHI). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CHITIN 1.1.1. Cấu trúc hóa học của chitin Chitin là polyme sinh học không phân nhánh, cấu thành từ các đơn vị N-acetyl D-glucosamine (GlcNAc) thông qua liên kết β-(1-4)-glycosyl (Hình 1.1). Chitin là một trong các polymer sinh học phổ biến nhất trong tự nhiên chỉ đứng sau cellulose (cấu trúc hóa học của chitin gần giống với cellulose) và đóng vai trò là polysaccharide cấu trúc của các sinh vật nhƣ: thành tế bào của nấm, khung vỏ ngoài của động vật chân đốt, vỏ ngoài của các loài giáp xác và giun tròn. Trong cấu trúc của chitin, nhóm (-OH) ở nguyên tử C 2 đƣợc thay thế bằng nhóm axetyl amino (-NHCOCH 3 ). Liên kết β-(1-4)-glycosyl của mỗi đơn phân trong cấu trúc của chitin lệch nhau một góc 180 o tạo nên mạch xoắn và loại liên kết này kém bền, dễ bị cắt đứt bởi tác nhân có tính axit hay enzyme [7]. Cấu tạo hóa học của chitin đƣợc thể hiện trong hình 1.1. Công thức phân tử của chitin: (C 8 H 13 O 5 N) n, Khối lƣợng phân tử: (203,09)n với thành phần các nguyên tố: C = 47,29%; H = 6,4%; O = 39,4%; N = 6,91%. Hình 1.1. Công thức cấu tạo hóa học của chitin Các nghiên cứu nhiễu xạ sử dụng tia X cho thấy, chitin tồn tại dƣới ba dạng α-, β- và γ-chitin do sự khác nhau về sắp xếp của các nhánh phân tử bên trong tinh thể chitin. Trong α-chitin, các nhánh đƣợc sắp xếp theo hƣớng đối song (antiparallel), β-chitin gồm các nhánh song song và γ-chitin đƣợc hình thành từ hỗn hợp hai loại α-chitin và β-chitin. Trong ba loại trên thì α-chitin là [...]... 40-70oC và pH 4-9 Tinh sạch và nghiên cứu đặc Biểu hiện thành công gen chi Patcharaporn và điểm của của Bacillus circulans trong Escherichia coli chủng trong E coli M15 Khối cs, 2006 [20] No41 lƣợng phân tử của chitinase là 66 kDa Chitinase hoạt động tối ƣu ở pH 7,0 và nhiệt độ 45oC Nghiên cứu tách dòng và Chitinase có khối lƣợng phân Yan-Jun Wang, biểu hiện gen mã hóa tử khoảng 58 kDa điểm đẳng và cs,... Giáo dục (nhóm nghiên cứu của PGS TS Dƣơng Văn Hợp) Gần đây, nhóm nghiên cứu của PGS TS Quyền Đình Thi (Viện Công nghệ sinh học-Viện KHCN Việt Nam) đã nghiên cứu tách dòng và biểu hiện chitinase có nguồn gốc từ nấm mốc nhằm ứng dụng trong phòng trừ các vi sinh vật gây hại trong nông nghiệp 1.3 BIỂU HIỆN CHITINASE TRONG PICHIA PASTORIS 1.3.1 Đặc điểm của hệ biểu hiện P pastoris Hiện nay có bốn hệ tế bào... sử dụng để biểu hiện gen, bao gồm vi khuẩn (E coli; B subtilis), nấm men (S cerevisiae; P pastoris) , tế bào thực vật và tế bào động vật Ngoài ra còn có thể biểu hiện Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn trên một vài loại nấm sợi nhƣng chƣa có hiệu quả cao Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris P pastoris là một trong số không... protein tái tổ hợp dụng trong y học và công nghiệp thực phẩm Nhiều kỹ thuật áp dụng cho nấm men S cerevisiae cũng có thể áp dụng cho nấm men P pastoris nhƣ biến nạp bằng cách tạo tế bào khả biến, cắt ghép gen, tái tổ hợp gen Các gen his4, leu2, arg4, trp1 và ura3 của nấm men Saccharomyces đƣợc biểu hiện trong các chủng Pichia khuyết dƣỡng So với S cerevisiae, P pastoris thuận lợi hơn trong quá trình gắn... hợp để có thể tích hợp vào hệ gen của và P pastoris, chỉ một số ít hệ biểu hiện trong P pastoris đƣợc thực hiện trên plasmid Những plasmid này đều chứa một khởi đầu sao chép Ori và một gen kháng kháng sinh để có thể chọn lọc các thể tái tổ hợp trên môi trƣờng có chất kháng sinh Trong nghiên cứu này, sử dụng vector biểu hiện pPICZA là phƣơng tiện chuyển gen chi vào nấm men P pastoris X33 Vector pPICZA... biểu hiện trong tế bào động vật có thể biểu hiện các nhóm protein khác nhau và có ý nghĩa đặc biệt trong y dƣợc học, tuy nhiên quá trình chọn lọc, nhân dòng và nuôi cấy tế bào phức tạp hơn nhiều so với cách sử dụng vi sinh vật Hệ biểu hiện trong nấm men là một giải pháp hữu hiệu khắc phục những giới hạn trên Nấm men là hệ biểu hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi hiện nay bởi nó có nhiều ƣu điểm Chúng là... vi khuẩn, nấm mốc, côn trùng, thực vật và động vật Chitinase đóng các vai trò khác nhau trong các sinh vật nhƣ: là một phần trong hệ tiêu hóa của động vật không xƣơng sống, phân hủy một phần vỏ cutin trong các loài côn trùng và giáp xác; giúp thực vật kháng lại các loại nấm gây bệnh, là một phần trong các tác nhân gây bệnh của virus, giúp nấm phân hủy và thu nhận cơ chất Chitinase có mặt trong nhiều... hiệu suất biểu hiện enzyme cao Bảng 1.1 Gen chi mã hóa chitinase từ các chủng Bacillus licheniformis Chủng Kích thƣớc Khối lƣợng chitinase gen (bp) (kDa) Mã số truy cập GenBank B licheniformis KNUC213 1731 57,6 AEQ55312 B .licheniformis 1743 58,0 ACK44109 B licheniformis N1 1919 59,8 ACU43581 B licheniformis 2388 59,8 ACM46020 1689 56,3 ACW83016 DSM8785 CBFOS-03 B licheniformis DSM 13 Số hóa bởi Trung... đƣợc tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lƣỡng cƣ, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ Ngoài ra, enzyme chitinase còn đƣợc thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài của chúng trong quá trình biến thái hay... nhiều nấm men có khả năng sử dụng methanol nhƣ nguồn cacbon duy nhất Ứng dụng của P pastoris trong biểu hiện xuất phát từ việc khai thác promoter AOX, một promoter liên quan tới quá trình đồng hóa methanol Gen ngoại lai chứa trong plasmid tái tổ hợp có khả năng tích hợp vào hệ gen của P pastoris nhờ quá trình tiếp hợp và trao đổi chéo, do vậy, làm tăng tính ổn định của gen này trong tế bào chủ P pastoris . CHU THỊ HOA TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HÓA CHITINASE CỦA BACILLUS LICHENIFORMIS KNUC213 TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 . tính chitinase nhằm khai thác nguồn gen. - Tách dòng và phân tích trình tự gen chi mã hóa chitinase của chủng B. licheniformis KNUC213. - Biểu hiện gen chi mã hóa chitinase của chủng B. licheniformis. trình tự gen chi của B. licheniformis KNUC213 43 3.3. BIỂU HIỆN GEN chi MÃ HÓA CHITINASE TỪ CHỦNG B. licheniformis KNUC213 TRONG P. pastoris X33 45 3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA::chi