Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus thuringiensis SINH PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH Hà Nội, 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình nghiên cứu khác. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Ngô Đình Bính -Trưởng phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Di truyền Vi sinh vật, đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi học tập và hoàn thành luận văn của mình. Hà Nội, ngày …tháng…năm 2012 Học viên Nguyễn Thị Hiền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis 3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bt 6 1.1.3. Đặc điểm sinh hoá 8 1.1.4. Đặc điểm phân loại 8 1.1.5. Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 9 1.1.6. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis 11 1.1.7. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể 13 1.1.8. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng 14 1.1.9. Nghiên cứu và ứng dụng Bt ở Việt Nam 15 1.1.10. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc 16 1.1.11.Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai 18 1.2. Đại cƣơng về côn trùng bộ cánh vảy 19 1.2.1. Côn trùng bộ cánh vảy 19 1.2.2. Côn trùng thử nghiệm 19 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Vật liệu 24 2.1.1. Sinh phẩm 24 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1. Phân loại các chủng Bt bằng phản ứng huyết thanh 26 2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt 27 2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm 27 2.2.4 Tách chiết DNA plasmid 28 2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C bằng PCR 29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C 30 2.2.7 Xác định trình tự nucleotide 32 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai mang gene cry1C có hoạt tính diệt sâu xanh da láng và sâu tơ 33 3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt nghiên cứu 33 3.1.2 Phân loại Bt bằng huyết thanh 35 3.1.3 Hoạt tính diệt của các chủng Bta trên sâu xanh da láng và sâu 36 Nồng độ bào tử 36 Hoạt tính của các chủng Bta diệt sâu xanh da láng và sâu tơ 37 3.2 Tách dòng và đọc trình tự đoạn gene cry1C 39 3.2.1 Khuếch đại gene cry1C của các chủng Bta bằng PCR 39 3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C 40 3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C 44 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ 1 Amp Ampicillin 2 Bp Base pair 3 Bt Bacillus thuringiensis 4 Bta Bacillus thuringiensis subspecies aizawai 5 dH 2 O Nước khử ion 6 DNA Deoxyribonucleotide acid 7 E. coli Escherichia coli 8 EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid 9 OD Optical density 10 PCR Polymerase chain reaction 11 SDS Sodium dodecyl sulphate 12 Sol Solution 13 TE Tris EDTA 14 X-gal 5- Bromo- 4 Chloro- 3 indolyl β- D- galactoside Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Phân loại gene cry của Bt………………………………………… 10 Bảng 3.1. Sự đa dạ ng hình thá i tinh thể của các chủng Bt… 34 Bảng 3.2. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta sau 3 ngày thử nghiệm . 37 Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bt sau 3 ngày thử nghiệm. 38 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của B. thuringiensis …………………… …. 7 Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis 8 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac 14 Hình 1.4. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn B. thuringiensis …… ………… 15 Hình 1.5. Vòng đời sâu tơ ……………… …………………………….…… 21 Hình 1.6. Rau bắp cải bị sâu hại …………… …………………………… 21 Hình 1.7. Vòng đời của sâu xanh da láng …………… ……… ……………. 23 Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc Bt trên môi trường MPA sau 72h nuôi ở 28ºC 33 Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của Bt phóng đại 1000 lần . 34 Hình 3.3. Ngưng kết của chủng TN 6.12 phân lập với type huyết thanh dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần…………………………………… 36 Hình 3.4. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu 37 Hình 3.5. Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu……………… 38 Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu………… 39 Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trường LBA sau khi nuôi cấy qua đêm………………………………………………………………………………. 41 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13…………………… 42 Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc trên agarose 1% 43 Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ các DNA plasmid tái tổ hợp….…44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm không khí cao là điều kiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông - lâm nghiệp phát triển. Côn trùng bộ cánh vảy là bộ lớn trong lớp côn trùng gồm bướm và bướm đêm, trên 180.000 loài đã được mô tả và có mặt ở khắp nơi trên thế giới, chúng gây thiệt hại nghiêm trọng trong nền kinh tế nông nghiệp của nước nhà. Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa học với nồng độ cao để phun ngay sau khi dịch sâu hại bùng phát. Trung bình mỗi hectar cây trồng phải phun từ 5–7 kg thuốc. Tuy nhiên, việc sử dụng tràn lan các loại hóa chất diệt côn trùng đã để lại dư lượng thuốc trong nông phẩm, gây độc hại đối với sức khỏe người sử dụng và gây ô nhiễm môi trường. Thay vào các biện pháp hóa học thì các biện pháp sinh học được khuyến khích sử dụng. Hiện nay, thuốc trừ sâu sinh học từ Bacillus thurinngiensis (Bt) chiếm hơn 90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học trên thế giới và hoàn toàn không độc với con người, động vật và môi trường [24]. Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) được nghiên cứu nhiều nhất trong 82 dưới loài của Bacillus thuringiensis. Bacillus thurigiensis subsp. aizawai có khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể gây độc với côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptera), trong đó có loài sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh (Helicoverpa armigera Hibber), sâu khoang (Spodoptera litura) và một số côn trùng bộ 2 cánh (Diptera). Cry1C là một loại protein thể độc do Bta sinh ra trong quá trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng bộ cánh vảy rất mạnh. Vì vậy, để có thể sản xuất được thuốc trừ sâu Bt đặc hiệu riêng với côn trùng cánh vảy hoặc chuyển gene mã hóa protein tinh thể kháng côn trùng bộ cánh vảy vào cây trồng, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy’’. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.1. Mục tiêu - Sàng lọc được các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy. - Tách dòng và đọc trình tự được gene cry1C của các chủng Bta đã sàng lọc có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy. 1.2. Nội dung - Thu thập các chủng B. thuringiensis phân lập tại một số địa điểm ở Thái Nguyên. - Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy bằng phương pháp huyết thanh học. - Thử hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng Bta thu nhận được. - Phát hiện các chủng Bta mang gene cry1C từ các chủng có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy bằng phương pháp PCR. - Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy. - Xác định trình tự đoạn gene cry1C đã được tách dòng và so sánh với trình tự gene trên Gene Bank. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis  Trên thế giới B. thuringiensis là vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng do nhà khoa học Nhật Bản Ishitawa phát hiện năm 1901 khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto [8]. Năm 1911, Berliner (người Đức) đã phân lập được một loại vi khuẩn gây bệnh từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã đặt tên là Bacillus thuringiensis năm 1915 [8]. Năm 1930, Bacillus thuringiensis đã được thử nghiệm chống sâu đục thân ở Châu Âu. Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa mì tại Pháp. Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất là protein [8]. Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với khối lượng lớn từ chủng B. thuringiensis subsp. kurstaki. Năm 1956, Angus đã chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử [33]. Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới cho các chủng Bt và Bacilus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết thanh. Năm 1970, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh khi phát hiện ra chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao. [...]... đường nghiên cứu về B thuringiensis tại Việt Nam [10] Thời kỳ mở đầu nghiên cứu Các công bố khoa học về nghiên cứu B thuringiensis ở thời kỳ này còn rất ít Vào thời kỳ này một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất B thuringiensis bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm sử dụng các chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus thuringiensis var thuringiensis, B thuringiensis. .. hoạt động của protein tinh thể của B thuringiensis liên quan tới sự hòa tan tinh thể trong ruột giữa của côn trùng Khi sâu ăn phải protein tinh thể của Bacillus thurigiensis, dưới tác động của men protease có tính kiềm (pH>10) trong ruột sâu, tinh thể độc tố bị hòa tan, và một nhân độc tố có khối lượng phân tử 60–65 kDa được hình thành và hoạt hóa Độc tố đã hoạt hóa bám vào các phân tử cảm thụ đặc biệt... có hệ số copy thấp Những nghiên cứu của Carlton và Gonzalez trên 21 loài phụ Bt đã cho thấy số lượng plasmid dao động từ 2- 12 trong các chủng nghiên cứu [11,20] Theo công bố mới nhất trên website http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html: đã phát hiện tới hơn 600 gene thuộc 70 họ gene cry của Bt Sau đây là các họ gene mã hóa cho protein tinh thể độc diệt một số bộ côn trùng. .. crystal - tinh thể) để biểu diễn gene tổng hợp protein tinh thể diệt sâu Các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn chủng Bt sinh tổng hợp 3 dạng độc tố chính là Cry, Cyt, Vip do các gene cry, cyt, vip mã hóa [21,25] 1.1.5.1 Gene cry Gene cry mã hóa cho các độc tố Cry khác nhau Đây là gene độc tố quan trọng nhất của Bt, tính đặc hiệu diệt côn trùng là do các protein. .. nhà nghiên cứu buộc phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng Do vậy các nhà khoa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn học đã chuyển việc nghiên cứu B thuringiensis sang hướng mới như tìm kiếm các chủng B thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu B thuringiensis. .. điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng [21,27] Hình 1.1 Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [21] Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng được tổng hợp Tinh thể có kích thước 0,6-2m, có hình dạng không cố định (có thể là hình lập phương, hình lưỡng tháp hoặc hình cầu) Tinh thể có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào Khi nhuộm tế bào... 28ºC trong 24h, đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có nồng độ pha loãng nhỏ nhất Số lượng bào tử được tính theo công thức: CFU = n a 10 CFU: số lượng bào tử trong 1 ml dịch nuôi cấy n: số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100µl dịch pha loãng a: nồng độ pha loãng 2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm Để đánh giá khả năng tiêu diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng nghiên cứu, chúng tôi tiến... Bảng 1.1 Phân loại gene cry của Bt Gen Hình dạng tinh thể Khối lƣợng phân tử protein (kDa) 130 – 138 Hoạt tính diệt côn trùng cry1A- cry1L Lưỡng tháp cry2A- cry2C Cầu 69 – 71 Cánh vảy, hai cánh cry3A- cry3C Lập phương 73 – 74 Cánh cứng cry4A- cry4D Cầu 73 – 74 Hai cánh cry5 Lưỡng tháp 81 Tuyến trùng cry8 Lập phương 130 Cánh cứng Các gene cry còn lại Đa dạng 35 – 129 Cánh vảy Đa dạng Gene cyt Gene cyt... xuất, từ đó một chương mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp – cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gene [2] Năm 2003, Sakai và cs đã công bố thông tin protein tinh thể của Bt có khả năng diệt tế bào ung thư Năm 2005, Ohba và N.D Binh đã phát hiện protein của 4 dưới loài Bt phân lập ở Việt Nam có thể hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung ở người [10,13] Số hóa bởi... côn trùng thì vùng 2 của độc tố Cry1C có khả năng liên kết cả 3 loại thụ thể có khối lượng phân tử khác nhau Dưới loài Bta Bta là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B thuringiensis, thuộc typ huyết thanh số 7 theo khóa phân loại của Bonnefoi và de Barjac, 1963 Trong số các chủng B thuringiensis phân lập ở Việt Nam thì có tới 15% số chủng là Bta [5,10] Bta hình thành tinh thể diệt sâu trong chu kì . tiến hành đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy ’. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus thuringiensis SINH PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật . tính diệt côn trùng bộ cánh vảy bằng phương pháp huyết thanh học. - Thử hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng Bta thu nhận được. - Phát hiện các chủng Bta mang gene cry1C từ các chủng