HÀNH PHCHÍ MINH       LÁ SEN HYDROCOTYLE BONARIENSIS COMM. EX LAM. VÀ HYDROCOTYLE VUGARIS L. (APIACEAE)    - 2013   - HCM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.  Phản biện 1: GS.TS.  Phản biện 2 Phản biện 3: PGS.TS.  Phản biện ĐL 1: PGS.TS.   Phản biện ĐL 2: TS.  Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp CSĐT Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia TP. HCM vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. HCM ; - Thư viện Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - ĐHQG TP. HCM   1. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương, Chemical examination of Hydrocotyle bonariensis (L.), family of Apiaceae, Tạp chí Hóa học, 47(5), 542-546, 2009 2. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương, Contribution to the study on chemical constituents of Hydrocotyle vulgaris (L.), Apiaceae, Tạp chí Phát triển Khoa Học & Công Nghệ, NXB Đại học quốc gia, TPHCM, 12(10), 29-32, 2009. 3. Tôn Nữ Liên Hương, Lê Hoàng Ngoan, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương, Thành phần hóa học của các cây rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis và Hydrocotyle vulgaris, họ Ngò (Apiaceae), ở tỉnh Tiền giang và thành phố Cần thơ, Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 22b, 190-199, 2012 4. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương, Study on bioactivities and chemical constituents of Hydrocotyle bonariensis (L.), family Apiaceae, Tạp chí Hóa học, 50(4A), 187-190, 2012 5. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương, Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học của cây Rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis L. họ Apiaceae, Tuyển tập Hội nghị Khoa học lần thứ 5 Trường ĐH KHTN TPHCM 11 / 2006 6. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Bá Vi, Nguyễn Ngọc Sương, Poster No. 52, Chemical constituents of volatile oil and organic extract from Hydrocotyle bonariensis L. (Apiaceae), Intensive Course “Medicinal Chemistry” EU-ASIA LINK Medicinal Chemistry, 2006 7. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương, Paper (p.68-70) and Oral presentation, Contribution to the study on chemical constituents of Hydrocotyle vulgaris (L.), family Apiaceae, The 7 th Vietnam- Japan Joint Seminar on Collarboration in Advanced Science and Technology, Organized by University of Science, VNU-HCMC, Kyoto Institute of Technology, March 6-7, 2009 8. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương, Poster 57, Isolation of some phenolic and glycosidic compounds from Hydrocotyle bonariensis L. & Hydrocotyle vulgaris L. family Apiaceae, Tóm tắt Tuyển tập Hội nghị Khoa học lần thứ 7 Trường ĐHKHTN TPHCM, 2010 9. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương, Poster, Contribution to the study on the bioactivities of Hydrocotyle bonariensis L. & Hydrocotyle vulgaris L., family Apiaceae, Hội nghị Khoa học lần thứ 7 Trường ĐH KHTN TPHCM, 2010 1 1 1. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1.1 Đặt vấn đề Các cây thuộc chi Hydrocotyle mọc dễ nơi ẩm mát và còn được trồng phổ biến làm rau ăn không những ở nước ta và ở nhiều nước khác cùng có khí hậu nhiệt đới, nóng ẩm. Một số cây thuộc chi này vừa là thực phẩm vừa là dược phẩm - không chỉ theo các tài liệu y học cổ truyền mà cả trong các y văn hiện đại. Trong những năm gần đây, ở vùng đồng bằng sông Cửu Long có các loài rau má lá tròn gần giống lá sen, có hương thơm, vị đắng, thường được trồng làm kiểng, sử dụng lá làm rau ăn, được gọi là rau má lá sen. Các loài này có tên khoa học là Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và Hydrocotyle vulgaris L., chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Luận án chọn thực hiện khảo sát thành phần hóa học các cây rau má lá sen, Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và Hydrocotyle vulgaris L. nhằm góp phần tìm hiểu về chi thực vật gần gũi với cuộc sống, chi Hydrocotyle, họ Ngò (Apiaceae). 1.2. Nhiệm vụ chính của luận án: - Cô lập, tinh chế, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thiên nhiên từ cây Hydrocotyle bonariensis Comm ex. Lam và Hydrocotyle vulgaris L. - Trích ly tinh dầu từ các bộ phận của mỗi cây, xác định thành phần hóa học - Khảo sát hoạt tính sinh học của hai cây rau má lá sen này 1.3. Ý nghĩa khoa học và đóng góp mới của luận án 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Luận án là công trình đầu tiên thực hiện các nghiên cứu hóa học trên cây Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và bổ sung thêm hai nhóm hợp chất hóa học mới được cô lập từ cây Hydrocotyle vulgaris L. - Thử nghiệm hoạt tính gây độc trên một vài dòng tế bào ung thư, tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và khảo sát khả năng làm lành vết thương (in vivo) của các cao, tinh dầu và một vài hợp chất cô lập được từ hai cây rau má lá sen này. 1.3.2. Đóng góp mới của luận án Hình 1. Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. Hydrocotyle vulgaris L. 2 Luận án đã đóng góp những kết quả mới về thành phần hóa học của hai cây Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và Hydrocotyle vulgaris L. như sau:  Đã cô lập được 24 hợp chất tinh khiết, và 4 hỗn hợp, trong đó, có 1 hợp chất mới đã được kiểm tra bằng phần mềm Scifinder vào tháng 08 năm 2012. Hợp chất tự nhiên có cấu trúc mới là: ●1-O-(β-D-galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,9′E)-2-(hexadeca-9′-enoylamino) octadecane-1,3,4-triol Các nhóm hợp chất được cô lập lần đầu tiên từ Hydrocotyle bonariensis:  Alkaloid: tetrahydropalmatine, (-)-(S)-xylopinine  Cerebroside: 1-O-(β-D-galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,18E)-2-[(2′R)-2′- hydroxynonadecanoylamino]tricosa-18-ene-1,3,4-triol; Hỗn hợp 1-O-(β-D-galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-(14’-methyl pentadecanoylamino)tricosa-8-ene-1,3,4-triol và 1-O-(β-D-galacto pyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2′R)-2′-hydroxyhexadecanoylamino] docosa-8-ene-1,3,4-triol và 1 hỗn hợp các đồng đẳng cerebroside.  Lignan: hinokinin và savinin (tỷ lệ 1:3)  Flavonoid: quercetin, quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside, kaempferol, kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside  Triterpene: acid ursolic, lupeol, squalene  Steroid: dioscin, stigmastan-3,6-dione, β-sitosterol 3-O-β-D-gluco pyranoside, stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside và spinasterol 3-O- β-D-glucopyranoside (tỷ lệ 1:1), 3 hợp chất sterol tương ứng  Các hợp chất khác: acid hexadecanoic, esculetin, sucrose, 2-(4′- methylphenyl)-1,3-dioxolane. Các nhóm hợp chất mới được cô lập từ Hydrocotyle vulgaris là:  Lignan: hinokinin  Flavanoid: hesperidin  Đã xác định thành phần hóa học của tinh dầu các bộ phận hoa, lá, thân, rễ của mỗi cây.  Từ kết quả thử nghiệm gây độc trên một vài dòng tế bào ung thư người, tính kháng khuẩn và khả năng làm lành vết thương (in vivo) cho thấy các cao chiết và tinh dầu của hai cây rau má lá sen có hoạt tính, trong đó các nhóm hợp chất của cây Hydrocotyle bonariensis cho kết quả nổi trội hơn. 2. BỐ CỤC LUẬN ÁN 3 Luận án gồm phần mở đầu 2 trang, 138 trang nội dung với 4 chương, 86 tài liệu tham khảo, 2 trang danh mục công trình và phần phụ lục các phổ. Nội dung gồm có tổng quan 21 trang, thực nghiệm 30 trang, kết quả và biện luận 83 trang, kết luận và kiến nghị 4 trang. NỘI DUNG LUẬN ÁN 2.1. Chương 1. Tổng quan Tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về mô tả thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam., Hydrocotyle vulgaris L. và các cây trong cùng chi Hydrocotyle. 2.2. Chương 2. Thực nghiệm 2.2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 2.2.1.1. Nguyên liệu Đối tượng nghiên cứu là toàn cây Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và cây Hydrocotyle vulgaris L Nguyên liệu Hydrocotyle bonariensis được thu hái tại phường 5, thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang; cây Hydrocotyle vulgaris được thu hái tại phường An Hòa, thành phố Cần Thơ. Mẫu cây được nhận danh bởi Dược sĩ Phan Đức Bình công tác trong ban biên tập tạp chí Thuốc và sức khỏe – thành phố Hồ Chí Minh, và Thạc sĩ Nguyễn Thị Kim Huê, bộ môn Sinh học, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại Học Cần Thơ. 2.1.1.2 Hóa chất và thiết bị Trong thực nghiệm, chúng tôi đã sử dụng các hóa chất, thiết bị thường được các nhà hóa thực vật dùng để chiết tách hợp chất thiên nhiên. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1. Điều chế các loại cao Trích nóng 2,2 kg bột khô lá cây Hydrocotyle bonariensis với ethanol, nhiều lần đến kiệt, lọc và cô quay ở áp suất thấp, thu được 145 gam cao ethanol ở dạng sệt. Tương tự, trích nóng 2,3 kg bột khô lá cây Hydrocotyle vulgaris với ethanol, lọc và cô quay ở áp suất thấp, thu được 158 gam cao ethanol ở dạng sệt. Phần cao thô ethanol được hòa tan bằng nước, sau đó chiết lỏng-lỏng lần lượt với dung môi petroleum ether, chloroform, ethyl acetate và n-butanol. Dịch chiết được làm khan, cô quay dưới áp suất thấp, thu được các 4 cao tương ứng. Các loại cao từ lá cây Hydrocotyle bonariensis gồm cao ether dầu hỏa (Hb-PE, 40 g), cao chloroform (Hb-C, 12,2 g), cao ethyl acetate (Hb- E, 11,6 g), và cao butanol (Hb-B, 21 g). Các loại cao từ lá cây Hydrocotyle vulgaris gồm cao ether dầu hỏa (Hv-PE, 47 g), cao chloroform (Hv-C, 14,1 g), cao ethyl acetate (Hv-E, 13,8 g), và cao butanol (Hv-B, 23,1 g). Ngoài ra, ngâm dầm (nhiệt độ phòng) 6,7 kg bột khô toàn cây Hydrocotyle bonariensis với ethanol (nhiều lần, trích kiệt), lọc và cô quay dung dịch ở áp suất thấp, thu được 560 gam cao ethanol ở dạng sệt. Cao thô ethanol được trích pha rắn với silica gel, dung môi giải ly đầu tiên là ether dầu o C) rồi đến chloroform, ethyl acetate, sau cùng là methanol. Các dung dịch giải ly được thu hồi dung môi dưới áp suất thấp, cho ra các cao tương ứng: cao ether dầu hỏa (Hbon-PE, 180 g), cao chloroform (Hbon-C, 30 g), cao ethyl acetate (Hbon-E, 37 g) và cao methanol (Hbon-M, 200 g). 2.2.2.2. Trích ly, cô lập các hợp chất hữu cơ * Việc cô lập hợp chất hữu cơ được thực hiện bằng sắc ký cột hở với silica gel pha thường hoặc pha đảo RP-18, kết hợp với sắc ký bản mỏng và HPLC. * Cây tươi mỗi loài được phân chia thành các bộ phận: lá, hoa, thân, rễ và trích ly tinh dầu mỗi bộ phận bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. 2.2.2.3. Xác định cấu trúc hợp chất được cô lập, thành phần tinh dầu Việc xác định cấu trúc được thực hiện bằng các phương pháp phân tích phổ nghiệm như 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, HR-ESI-MS, FT-MS và so sánh với số liệu phổ từ tài liệu tham khảo. Xác định cấu trúc cerebroside bằng cách thủy phân, oxy hóa mạch carbon và xác định thành phần của các dịch trích sau khi thủy phân, khi oxy hóa này bằng phương pháp GC- MS, LC-MS. Xác định thành phần của tinh dầu bằng phương pháp GC-MS. 2.2.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học Thử nghiệm Brine-shrimp xác định độc tính với ấu trùng Artemia salina (Artemia nauplius) nhằm sơ bộ đánh giá độc tính của mẫu cao hoặc hợp chất cô lập được, được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ, khoa KHTN, trường ĐH Cần Thơ. [...]... khung isoquinolin và nhóm dibenzylbutyrolactone lignan là các nhóm mới 2.4.2 Kiến nghị hướng nghiên cứu tiếp theo  Khảo sát tiếp tục trên các phân đoạn còn lại và cao nước của hai loài rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis và Hydrocotyle vulgaris  Thử nghiệm hoạt tính sinh học trên một số hợp chất cô lập được  Khảo sát thêm một số loài rau má lá sen khác thuộc chi Hydrocotyle mọc ở một số vùng khác tại... steroid và flavonoid đã được nhận danh, xác định cấu trúc và công bố sự hiện diện trong cây Hydrocotyle vulgaris ở các tạp chí chuyên ngành Đã xác định thành phần hóa học của tinh dầu mỗi bộ phận lá, hoa, thân, rễ của cây Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam và cây Hydrocotyle vulgaris L   Về khảo sát hoạt tính sinh học Với thử nghiệm Brine-shrimp: Các cao ether dầu hoả của hai cây rau má lá sen H bonariensis. .. (resveratrol) là 8,50 21 2.4 Chương 4 Kết luận và kiến nghị 2.4.1 Kết luận: Luận án nghiên cứu hóa học hai cây rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam và Hydrocotyle vulgaris L đã đạt được các kết quả như sau:  Về khảo sát thành phần hóa học  Đã cô lập được 24 hợp chất và 4 hỗn hợp, trong đó có 1 hợp chất tự nhiên với cấu trúc mới, đã được kiểm tra bằng phần mềm Scifinder Hợp chất mới là:  1-O-(β-D-galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,9′E)-2-(hexadeca-9′-enoylamino)... (C-3′″ và C-5′″);); 72,0 (C-4′″); 17,9 (C6′″); 56,2 (4′-OCH3) 3 2.3.2 Khảo sát thành phần hóa học của tinh dầu Tinh dầu của từng bộ phận lá, hoa, thân, rễ của mỗi cây rau má lá sen được phân tích thành phần bằng phương pháp GC-MS, kết quả ghi ở Bảng 4 và 5 15 Bảng 4 Các cấu phần cuả tinh dầu của các bộ phận trong cây H bonariensis T RT Lá Hoa Thân Ðịnh danh theo thư viện dữ liệu (phút) (%) (%) (%) T 1... ung thư, kháng vi sinh vật kiểm định và kháng oxy hóa: gửi mẫu thử tại phòng Sinh học thực nghiệm, viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học - Công nghệ Việt Nam Thử nghiệm in vivo hoạt tính làm lành vết thương: tại khoa Khoa học tự nhiên, Trường Đại học Cần thơ, thực hiện qui trình chữa phỏng cho chuột dựa theo tài liệu đã công bố của Shukla Y.N và cộng sự nghiên cứu hoạt tính làm lành vết... Hydrocotyle vulgaris Cao chloroform Hydrocotyle bonariensis Cao chloroform Hydrocotyle vulgaris Cao ethyl acetate Hydrocotyle bonariensis Cao ethyl acetate Hydrocotyle vulgaris Cao butanol Hydrocotyle bonariensis Cao butanol Hydrocotyle vulgaris Tinh dầu lá Hydrocotyle bonariensis Tinh dầu thân Hydrocotyle bonariensis Tinh dầu rễ H bonariensis 18 20 30 50 250 300 300 250 180 57 57 200 * Nhận xét kết quả:... cây có độc tính với tế bào ung thư biểu mô (KB), gan (Hep-G2) và phổi (Lu) với giá trị IC50 (µg/ml) lần lượt là 16,93; 24,00 và 24,00 23 Về hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Chỉ tinh dầu của cây H bonariensis có tính kháng khuẩn, kháng được 2 dòng vi khuẩn gram âm E coli và P aeruginosa, 1 dòng khuẩn gram dương S aureus và kháng nấm men F oxysporum Về hoạt tính chữa phỏng (in vivo): Trong thử nghiệm... nghiệm hoạt tính sinh học 2.3.3.1 Thử nghiệm Brine-shrimp: Thử nghiệm Brine-shrimp trên các mẫu cao chiết, tinh dầu của hai cây rau má lá sen, kết quả xác định giá trị LC50 của các mẫu thử được ghi trong Bảng 6 Bảng 6 Giá trị LC50 của các mẫu thử trong thử nghiệm Brine-shrimp LC50 Mẫu thử (µg/ml) Cao ether dầu hoả Hydrocotyle bonariensis Cao ether dầu hoả Hydrocotyle vulgaris Cao chloroform Hydrocotyle bonariensis. .. asiaticoside cô lập từ cây cùng chi Hydrocotyle asiatica 2.3 Chương 3 Kết quả và biện luận 2.3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất cô lập được Từ dịch chiết ethanol của cây Hydrocotyle bonariensis, đã cô lập được 22 hợp chất hữu cơ tinh khiết và ba hỗn hợp gồm hai đồng phân Từ dịch chiết ethanol của cây Hydrocotyle vulgaris đã cô lập được 7 hợp chất hữu cơ Trong phần này, chúng tôi chỉ trình bày... g/ml; pyridine) Hình 2 Cấu trúc hóa học và năng lực triền quang của leucocerebroside-Lb4 và của mucusoside Tài liệu tham khảo cho biết trong chi Hydrocotyle chỉ mới cô lập được cerebroside từ cây H leucocephala, gọi tên là các hợp chất leucocerebroside 6 (Lb1–Lb7) với phần đường trong các hợp chất này là β–D–galactopyranose Trong hợp chất Hb-Ea5 vừa cô lập được từ cây H bonariensis này, xác định được . khoa học là Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và Hydrocotyle vulgaris L., chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Luận án chọn thực hiện khảo sát thành phần hóa học. của mỗi cây, xác định thành phần hóa học - Khảo sát hoạt tính sinh học của hai cây rau má lá sen này 1.3. Ý nghĩa khoa học và đóng góp mới của luận án 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Luận án là công. (L.), family Apiaceae, Tạp chí Hóa học, 50(4A), 187-190, 2012 5. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương, Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học của cây Rau má lá sen Hydrocotyle