MỞ ĐẦU Thực vật đa dạng phong phú nguồn thức ăn ngày mà cung cấp nhiều sản phẩm hữu ích khác cho người nhiều lĩnh vực hương liệu, phẩm màu, thuốc phòng trừ sâu bệnh quan trọng làm thuốc chữa bệnh Các kết phân tích nguồn gốc dược phẩm cho thấy thuốc có nguồn gốc tự nhiên hay dẫn xuất hợp chất tự nhiên (HCTN) chiếm 34% tổng số loại thuốc đưa thị trường từ 01/1981 đến 06/2006 Điều cho thấy tầm quan trọng HCTN trình phát triển thuốc tiến trình này, việc ly trích, phân lập xác định cấu trúc HCTN có cỏ giai đoạn thiếu Trong luận án tiến hành phân lập xác định cấu trúc HCTN có ba lồi thực vật thuộc chi Garcinia mọc Nam Bộ Việt Nam bứa cọng (G pedunculata), sơn vé (G merguensis) bứa đồng (G schomburgkiana) Ngoài chúng tơi khảo sát hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập hai dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ung thư phổi NCI-H460 Mục tiêu luận án nhằm khảo sát thành phần hóa học chi Garcinia Việt Nam, góp phần cung cấp sở khoa học cho việc định hướng khai thác sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên thực vật đa dạng phong phú nước ta; làm giàu danh mục HCTN giới từ nguồn thực vật nước, khẳng định giá trị tài nguyên thực vật Việt Nam Luận án cung cấp mẫu chất cho thử nghiệm hoạt tính sinh học, góp phần làm sở cho nghiên cứu dược tính lồi ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Từ cao eter dầu hỏa vỏ bứa cọng, cao cloroform vỏ trái bứa cọng, cao etyl acetat vỏ sơn vé cao etyl acetat vỏ bứa đồng phân lập nhận danh 25 hợp chất gồm 24 xanthon triterpen Trong hợp chất này, có xanthon lần Kết thử hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp SRB 14 xanthon cô lập cho thấy chúng có hoạt tính yếu hai dịng tế bào ung thư HeLa NCI-H460 BỐ CỤC LUẬN ÁN Luận án gồm 159 trang với chương, 34 bảng, 26 hình, sơ đồ, 168 tài liệu tham khảo 81 phụ lục phổ Trong đó, tổng quan 29 trang, thực nghiệm 22 trang, kết bàn luận 85 trang Ngồi cịn có mở đầu trang, kết luận kiến nghị trang NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương TỔNG QUAN - Giới thiệu HCTN - Giới thiệu họ Bứa (Guttiferae) - Giới thiệu chi Garcinia: Đặc điểm thực vật, công dụng thành phần hóa học (tổng hợp tài liệu tham khảo giới nghiên cứu hóa học chi Garcinia Việt Nam) Quá trình sinh tổng hợp hoạt tính sinh học xanthon trình bày phần - Giới thiệu loài nghiên cứu luận án Chương THỰC NGHIỆM 2.1 Thiết bị hóa chất Trong phần chúng tơi trình bày ngắn gọn thiết bị hóa chất sử dụng phần thực nghiệm luận án 2.2 Nguyên liệu Vỏ bứa cọng thu hái Lâm trường Mã Đà, tỉnh Đồng Nai Trái thu hái Vườn Quốc gia Cát Tiên Vỏ sơn vé thu hái Thảo Cầm Viên Sài Gòn Vỏ bứa đồng thu hái huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang Mẫu PGS.TS Lê Công Kiệt GVC Nguyễn Thiện Tịch, Bộ môn Thực vật Sinh môi, Khoa Sinh, Trường ĐH KHTN Tp HCM định danh schomburgkiana)”, Hội nghị Khoa học lần thứ 5, Trường ĐHKHTN 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Chiết xuất phân lập Tp HCM (16/11/2006) Võ Tấn Hậu, Phạm Đình Hùng, Nguyễn Diệu Liên Hoa, “Hợp chất Vỏ phơi khô, xay nhỏ, chiết xuất với eter dầu hỏa phenol từ vỏ sơn vé (Garcinia merguensis)”, Hội nghị Khoa học EtOAc chiết Soxhlet Thu hồi dung môi máy cô quay thu lần thứ 5, Trường ĐHKHTN Tp HCM (16/11/2006) cao eter dầu hoả cao EtOAc tương ứng Lien-Hoa D Nguyen, Hieu T Nguyen, Hau T Vo, Dang D Le, Hoa V Trái tươi sau hái gọt lấy lớp vỏ bên ngoài, bỏ hạt, xắt nhỏ, ngâm Vo, Ngoc-Tuyet T Nguyen, Quyen N Tran, Hoan D Nguyen, Hoang- MeOH (1 tuần) Sau xay nhỏ, lọc ngâm lại bã MeOH Yen T Vo, Hung D Pham, Joseph D Connolly, Leslie J Harrison, ngày (ba lần) Gộp tất dịch qua lọc, thu hồi dung môi “Phenolic compounds and triterpenoids from Vietnamese Guttiferae”, chuyển dịch trích vào bình lóng trích CHCl3 (5 lần) Thu hồi CHCl3 Summer School “Medicinal Chemistry”, Viện Hóa Hữu Thượng cao CHCl3 Hải, 25-28/09/2005 Việc phân lập chất thực phương pháp SKC kết hợp với SKLM chất hấp phụ silica gel, RP18 hay Diol silica Sắc ký lọc gel thực Sephadex LH-20 2.3.2 Xác định cấu trúc Việc xác định cấu trúc thực phương pháp phổ (1H 13 C NMR, HSQC, HMBC kết hợp với UV, IR, HR-MS) so sánh phổ có với tài liệu tham khảo 2.3.3 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào Sử dụng phương pháp SRB 2.4 Quy trình phân lập chất số liệu phổ Trong phần chúng tơi trình bày quy trình phân lập chất từ cao chiết nêu số liệu phổ thu Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Thành phần hóa học vỏ bứa cọng Từ vỏ bứa cọng phân lập định danh hợp chất gồm pedunxanthon A (95), pedunxanthon B (96), pedunxanthon C (97), nigrolineaxanthon (98), garbogiol (99), 1,5-dihydroxy-3-metoxy-4-(3metylbut-2-enyl)-xanthon (100), dulxanthon A (101) acid oleanolic (102) Trong hợp chất này, 95, 96 97 xanthon 26 OH OH O OH O OH O OH DANH MỤC CƠNG TRÌNH OMe O OH O OH 95 OH OH O OMe O O 96 OH O OH 97 O OH BÀI BÁO ĐÃ ĐĂNG Hau T Vo, Ngoc-Thao T Nguyen, Gerhard Maas, Udo R Werz, Hung D Pham, Lien-Hoa D Nguyen (2012), “Xanthones from the bark of OH Garcinia pedunculata”, Phytochemistry Letters, Vol 5(4), pp 766O OMe O OH O OH 98 O O OH 99 OMe 100 769 Hau T Vo, Ngoc-Tuyet T Nguyen, Hieu T Nguyen, Khoa Q Do, Joseph D Connolly, Gerhard Maas, Jörg Heilmann, Udo R Werz, O HO O OH 101 OH Hung COOH OMe HO 102 8a 10a O OH Tinh thể hình kim màu vàng sáng, đnc 215- 216 °C, cho phản ứng màu xanh đậm với thuốc 9a OMe 4a 11 95 14 Phổ IR: νmax 12 tetraoxygenated Lien-Hoa xanthones D Nguyen from the (2012), bark of “Cytotoxic Garcinia Võ Tấn Hậu, Lê Đức Đẳng, Phạm Đình Hùng, Harrison J Leslie, Nguyễn Diệu Liên Hoa (2008), “Cô lập nhận danh dẫn xuất phenol OH O Pham, schomburgkiana”, Phytochemistry Letters, Vol 5(3), pp 553-557 Pedunxanthon A (95) OH D thử FeCl3/EtOH nên dẫn xuất phenol HR-ESIMS: C19H18O6 (m/z 343,1194 [M+H]+, trị số tính tốn cho C19H19O6 343,1182), độ 15 bất bão hòa 11 O−H (3437 cm-1), C=O liên hợp (1632 cm-1), C=C benzen (1581 cm-1) Phổ UV: λmax 222, 257, 279 349 nm Phổ 1H 13C NMR (Bảng 3.1) cho tín hiệu cộng hưởng ứng với hai nhóm hydroxyl liên kết hydrogen nội phân tử, carbon carbonyl liên hợp, nhóm hydroxyl tự do, proton benzen lập, hai proton benzen ghép cặp orto, nhóm metoxyl, nhóm 3-metylbut-2-enyl carbon benzen Sự diện 19 carbon có 12 carbon benzen, carbon carbonyl nhóm metoxyl cho thấy hợp chất dẫn xuất xanthon polyoxygen hóa mang đơn vị 5C từ vỏ sơn vé (Garcinia merguensis)”, Tạp chí Hóa học, Tập 46(5), trang 571-574 BÁO CÁO TẠI HỘI NGHỊ KHOA HỌC Võ Tấn Hậu, Phạm Đình Hùng, Nguyễn Diệu Liên Hoa, “Hợp chất phenol từ vỏ bứa cọng (Garcinia pedunculata)”, Hội nghị Khoa học lần thứ 6, Trường ĐHKHTN Tp HCM (14/11/2008) Vo T Hau, Pham D Hung, Nguyen D L Hoa, Maas Gerhard, “Xanthones from Garcinia schomburgkiana and G pedunculata”, Intensive Course “Methods and Strategies in Medicinal Chemistry”, Trường Đại học KHTN Tp HCM ngày 31/10-03/10/2006 Võ Tấn Hậu, Phạm Đình Hùng, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Maas Gerhard, “Xác định cấu trúc hai xanthon từ vỏ bứa cọng (Garcinia pedunculata)”, Hội nghị Khoa học lần thứ 5, Trường ĐHKHTN Tp HCM (16/11/2006) Võ Tấn Hậu, Phạm Đình Hùng, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Maas Gerhard, “Cơ lập nhận danh hai xanthon từ vỏ bứa đồng (Garcinia 25 dihydroxyxanthon (88) phân lập từ vỏ trái bứa cọng; 103, nhóm metoxyl phân tử Ngoài carbon benzen có 104 105 hợp chất carbon mang oxygen nên dự đốn 95 xanthon tetraoxygen hóa Vỏ sơn vé: xanthon globuxanthon (110), griffipavixanthon (111) 1,7-dihydroxyxanthon (88) phân lập từ vỏ sơn vé Vỏ bứa đồng: xanthon schomburgxanthon (112), 3isomangostin hydrat (113) 1,7-dihydroxyxanthon (88) phân lập từ vỏ bứa đồng; 112 hợp chất hai vị trí C-4a C-10a nhân xanthon mang oxygen Cấu trúc độ dịch chuyển hóa học phổ 1-D NMR 95 thực dựa vào phân tích phổ HSQC HMBC (Hình 3.1) Trong phổ HMBC, proton nhóm -OH liên kết hydrogen nội phân tử (δH 12,12) cho tương quan với carbon benzen mang oxygen (δC 161,9), Về hoạt tính sinh học carbon benzen mang proton (δC 94,8) carbon benzen (δC Kết thử nghiệm độc tính hai dịng tế bào ung thư HeLa NCI- 101,6) nên carbon C-1, C-2 C-9a Proton H-2 cho H460 theo phương pháp SBR 14 xanthon phân lập cho thấy tương quan với C-1, C-9a, carbon benzen mang oxygen (δC 164,8) globuxanthon (110) có hoạt tính mạnh hai dòng tế bào thử carbon benzen (δC 108,0) hai proton metylen benzyl (δH nghiệm Kế đến dulxanthon A (101), pedunxanthon D (103) 3,49) cho tương quan với hai carbon benzen nói với griffipavixanthon (111) Các hợp chất lại có hoạt tính yếu carbon benzen mang oxygen (δC 153,7) Vậy nhóm isoprenyl gắn vào C-4 (δC 108,0) vị trí C-3 (δC 164,8) mang oxygen Từ xác định độ KIẾN NGHỊ CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO dịch chuyển hóa học C-4a (δC 153,7) Nhóm metoxyl gắn vào C-3 tương quan proton nhóm (δH 3,93) với C-3 Vậy vịng A nhân - Tiếp tục khảo sát thành phần hóa học bứa cọng - Thử hoạt tính gây độc tế bào số dòng tế bào ung thư khác - Thử hoạt tính kháng khuẩn kháng oxy hóa xanthon phân phải gắn vào C-8 để tạo cầu nối hydrogen nội phân tử với nhóm carbonyl lập Trong phổ HMBC, nhóm -OH liên kết hydrogen nội phân tử cho tương xanthon xác định Như nhóm -OH liên kết hydrogen nội phân tử lại (δH 11,19) quan với carbon benzen mang oxygen (δC 153,9), carbon benzen mang proton (δC 109,9) carbon benzen (δC 107,1) nên carbon C-8, C-7 C-8a Kiểu mẫu ghép cặp orto H-7 cho thấy C-6 mang proton C-5 mang nhóm hydroxyl Điều xác định tương quan H-7 với carbon benzen mang oxygen (δC 135,9; C-5) H-6 cho tương quan với C-5 carbon benzen mang oxygen khác (δC 142,9) nên carbon C-10a 24 OH H OH O hợp chất 1,5,8- δ H = 1,5 - 1,6 (2 s) trihydroxy-3-metoxy-4-(3-metylbut- Pedunxanthon O (96) 10a B 4a H OH Vậy H 9a OMe 2-enyl)xanthon (95) Đây 11 14 pedunxanthon A 15 δ c = 72,5 δ H = 1,80 (d, J = 10 - 11) δ c= 40,0 - 42,5 δc = 78 - 80 δ H = 6,8 - 6,9 (d, J = 10 - 11) δ c= 128 - 130 hợp chất mới, đặt tên δ H = 2,79 (t, J = 10 - 11) δ c= 16,2 - 17,5 δ H = 5,6 - 5,8 (d, J = 10 - 11) δ c= 115 - 121 Chromen Hình 3.1 Tương quan HMBC 95 Pedunxanthon B (96) OH 8a °C, HR-EIMS: C23H24O6 (m/z 396,1579 11 9a Tinh thể hình kim màu vàng, đnc 123-124 14 OH O 15 12 O 10a OH 4a 19 OH 96 3419 (O−H), 1640 (C=O liên hợp), 1585 16 (C=C benzen) cm-1 Phổ UV: λmax 229 (sh), 20 256, 275 (sh) 327 nm HZ 18 HE [M]+), độ bất bão hòa 12 Phổ IR: νmax O Chroman δ c = 14 - 15 δ H = 4,5 - 4,6 (q, J = 7) δ c = 91 - 92 O δ H = 1,4 - 1,5 (d) δ c = 14 - 15 δ c = 44 - 49 δ H = 1,1 - 1,7 (2 s) δ c = 21-26 δ H = 1,31 (2 s) δ c= 28 - 29 O δc= 28 - 29 O OH δ H = 1,1 - 1,7 (2 s) δ c = 21-26 1,1,2-Trimetyldihydrofuran δ H = 4,5 - 4,6 (q, J = 7) δ c = 91 - 92 δ H = 1,4 - 1,5 (d) δ c = 14 - 15 2-(1-Hydroxy-1-metyletyl)-2,3-dihydrofuran Hình 3.17 Đặc trưng phổ NMR nhóm nhân xanthon KẾT LUẬN Phổ 1H 13C NMR (Bảng 3.2) cho tín hiệu cộng hưởng tương tự Trong luận án này, khảo sát thành phần hóa học vỏ phổ pedunxanthon A (95) có điểm khác biệt 96 có thêm vỏ trái bứa cọng (G pedunculata), vỏ sơn vé (G merguensis) vỏ nhóm 1,1-dimetylprop-2-enyl khơng có tín hiệu cộng hưởng ứng với bứa đồng (G schomburgkiana) Bằng kỹ thuật SKC silica gel, RP18 nhóm metoxyl Các tương quan phổ HMBC cho thấy vòng B 96 Diol silica kết hợp với SKC lọc Sephadex gel LH-20, có cấu trúc giống vịng B 95 (Hình 3.2) Trong phổ HMBC, nhóm -OH phân lập 27 hợp chất (trong hợp chất 1,7-dihydoxyxanthon liên kết hydrogen nội phân tử (δH 12,67) cho tương quan với ba carbon diện khảo sát) Kết sau: benzen (δC 158,4; 110,7 102,5) nên chúng C-1, C-2 C-9a Về thành phần hóa học Hai proton metylen (δH 3,46) nhóm isoprenyl cho tương quan với C-1, Vỏ bứa cọng: hợp chất pedunxanthon A (95), pedunxanthon B C-2 carbon benzen mang oxygen δC 162,5 nên C-3 Vậy nhóm (96), pedunxanthon C (97), nigrolineaxanthon (98), garbogiol (99), 1,5- isoprenyl gắn vào C-2 nhóm 1,1-dimetylprop-2-enyl gắn vào C-4 (Hình dihydroxy-3-metoxy-4-(3-metylbut-2-enyl)-xanthon (100), dulxanthon A 3.2) (101) acid oleanolic (102) phân lập từ vỏ bứa cọng; OH H 9a 8a 14 OH O 11 12 15 H 10a O 19 OH 96 OH 4a Vậy hợp chất 1,3,5,8tetrahydroxy-2-(3-metylbut-2-enyl)4-(1,1-dimetylprop-2-enyl)xanthon 16 20 (96) Đây hợp chất mới, 18 đặt tên pedunxanthon B Hình 3.2 Tương quan HMBC 96 95, 96 97 hợp chất Vỏ trái bứa cọng: 13 xanthon pedunxanthon D (103), pedunxanthon E (104), pedunxanthon F (105), 6-O-demetyloliverixanthon (90), cowanin (87), norcowanin (106), cowanol (85), fuscaxanthon A (89), α-mangostin (41), mangostanol (107), 1,6-dihydroxy-7-metoxy-8-(3-metyl-2-butenyl)6′,6′-dimetylpyrano-(2′,3′:3,2)-xanthon (108), 3-isomangostin (109) 1,723 Bảng 3.27 Khoảng hấp thu UV xanthon theo kiểu mẫu oxygen hóa Kiểu mẫu oxygen hóa λmax (nm) 1,3,5-Trioxygen hóa I: (250-260), II: (318-325), III: (365-375) 1,3,5,6-Tetraoxygen hóa I: (252-257), II: (285-290), III: (325-332) Hệ liên hợp mở rộng I: (275-285), II: (320-325), III: (375-380) 1,3,5,8-Tetraoxygen hóa I: (255-265), II: (275-285), III: (330-350) 1,3,6,7-Tetraoxygen hóa I: (255-265), II: (307-320), III: (350-365) Hệ liên hợp mở rộng I: (285-290), II: (320-325), III: (360-370) Bảng 3.28 Đặc trưng phổ 1H 13C NMR proton benzen, -OH liên kết hydrogen nội phân tử, -OCH3 C=O xanthon δC δC (C=O) Vị trí δH H-2, H-4 6,20 - 6,50 H-6, H-7 6,60 - 7,35 H-8 7,40 - 7,80 1-OH 12,90 - 14,00 180,0 - 183,5 1-OH 8-OH 11,00 - 12,80 183,5 - 185,0 -OCH3 3,75 - 3,95 55,0 - 56,5 -OCH3 (có hai nhóm orto) 61,0 - 62,5 1-OCH3 176,0 - 178,0 δ H = 1,5 - 1,8 (2 s) δ c = 28 - 29 δ H = 3,2 - 4,2 (d, - Hz) δ c = 22 - 30 δ H = 1,6 - 1,9 (2 s) δ c = 18 - 27 δ c = 130 - 132 δ H = 5,0 - 5,5 (2 dd) Jgem = 0-1; Jcis = 9-11; Jtrans = 16-1 δ c = 41 - 42 δ c = 98 - 112 δ H = 6,5 - 6,6 (dd ) Jcis = 9-11; Jcis = 16-18 δ c = 151 - 157 δ H = 5,0 - 5,3 (t, - Hz) δ c = 122 - 126 1,1-Dimetylprop-2-enyl 3-Metylbut-2-enyl δ H = 3,2 - 4,2 (d, - Hz) δ c = 22 - 30 δ H = 3,2 - 4,2 (d, - Hz) δ c = 22 - 30 δ = 4,79 - 4,94 (2 s br) H Jgem = 0-1 δ c = 100 - 111 OH δ H = 4,1 - (dd) δ c= 76 - 78 HO δ H = 1,80 - (s) δ c= 18 - 19 δ H = 1,3 - 1,9 (1 s δ c = 26 - 28 δ c = 71 - 73 δ H = 5,0 - 5,3 (t, - Hz) δ c = 122 - 126 δ c= 148 - 151 3-Hydroxy-3-metylbutyl 2-Hydroxy-3-metyl-3-butenyl 22 Bảng 3.1 3.2 Số liệu phổ 1H 13C NMR pedunxanthon A (95) B (96) CDCl3 (Trị số ngoặc J tính Hz) Vị trí Pedunxanthon A (95) Pedunxanthon B (96) δH δC δH δC 161,9 158,4 6,40 s 94,8 110,7 164,8 162,5 108,0 111,5 4a 153,7 153,3 135,9 136,3a 7,25 d (9,0) 123,1 7,19 d (8,9) 122,6 6,68 d (9,0) 109,9 6,66 d (8,9) 109,7 153,9 153,3 8a 107,1 107,0 184,8 184,9 9a 101,6 102,5 10a 142,9 142,7 11 3,49 d (7,0) 21,7 3,46 d (7,1) 21,6 12 5,20 t (7,0) 122,4 5,23 t sept (7,1 & 1,3) 120,9 13 132,1 136,1a 14 1,71 d (1.0) 17,9 1,86 s 18,0 15 1,84 br s 25,6 1,78 s 25,9 16 41,6 17 6,59 dd (17,7 & 10,6) 153,4 107,6 18 HE: 5,31 d (17,7) HZ: 5,18 d (10,6) 19 1,68 s 28,1 20 1,68 s 28,1 1-OH 12,12 s 12,67 s 3-OH 6,93 s 5-OH 5,14 br s 5,55 s 8-OH 11,19 s 11,16 s 3-OMe 3,94 s 56,2 a : Có thể hốn đổi lẫn Pedunxanthon C (97) Tinh thể hình kim màu vàng sẫm, đnc 174-175 °C HR-EIMS: C24H24O6 (m/z 408,1572 [M]+), độ bất bão hòa 13 Phổ IR: νmax 3406 (O−H), 1638 (C=O liên hợp), 1579 (C=C benzen) cm-1 Phổ UV: λmax 242 (sh), 275, 320 380 nm OH O 16 17 8a 9a Phổ 1H 13C NMR (Bảng 3.3) cho O 10a 20 4a O OMe 14 OH 11 HE 13 -OH tự do, hai proton hương phương HO HZ nhóm -OCH3, nhóm 1,1- R tương tự trường hợp pedunxanthon A (95) cho thấy 97 có cấu trúc vịng A H 16 17 OH O 9a 8a 19 H O 20 OH 10a O OMe 4a 14 11 12 15 13 Hình 3.3 Tương quan HMBC 97 Vậy hợp chất 1,5-dihydroxy-3metoxy-4-(1,1-dimetylprop-2-enyl)18,18-dimetyl-2H-pyran[7,6-b]xanthen9-on (97) Đây hợp chất mới, đặt tên pedunxanthon C 3.2 Thành phần hóa học vỏ trái bứa cọng R HO R [O], đóg vòg n n O HO OH OH O OH MeO OH HO SAM R O O 104 O O 90 Metyl hoù a OH R HO O OH Metyl hoù a HO HO OH O [O], đóg vòg n n 106 R O O 117 Metyl hoù a SAM - H2O OH O OH HO MeO SAM R O OMe HO HO giống 95 (Hình 3.3) OH O 122,1) hai carbon benzen mang oxygen (δC 146,6) nên vòng pyran súc hợp thẳng với vòng B C-6 C-7 với C-6 mang oxygen Ngồi ra, lý luận Hydrat hó a 87 oxygen Cấu trúc 97 xác định sau cho tương quan với carbon olefin vòng 2,2-dimetylpyran (δC OH MeO OH O HO carbon carbonyl (δC 181,8) cho thấy proton gắn vào C-8 Proton H-8 O MeO dimetylprop-2-enyl 10 carbon benzen có carbon mang Tương quan HMBC proton benzen bị chắn (δH 7,42) với OH OH 85 lập, vịng 2,2-dimetylpyran, 12 15 97 O MeO tín hiệu cộng hưởng ứng với nhóm 19 R O 89 HO NADPH R O OH O O O 105 OH MeO HO O R= O 103 Hình 3.16 Con đường sinh tổng hợp đề nghị cho 85, 87, 89-90 103-105 3.6.2 Đặc trưng phổ xanthon phân lập Từ vỏ trái bứa cọng, 13 xanthon pedunxanthon D (103), Có thể nói kết hợp phương pháp phổ MNR chiều hai pedunxanthon E (104), pedunxanthon F (105), 6-O-demetyloliverixanthon chiều với phổ HR-MS, IR UV, đặc biệt kỹ thuật MNR, công cụ chủ (90), cowanin (87), norcowanin (106), cowanol (85), fuscaxanthon A (89), yếu cho phép phân giải hoàn chỉnh cấu trúc xanthon phân lập α-mangostin (41), mangostanol (107), 1,6-dihydroxy-7-metoxy-8-(3-metyl- Các đặc trưng phổ UV NMR xanthon tóm tắt Bảng 3.27- 2-butenyl)-6′,6′-dimetylpyrano-(2′,3′:3,2)-xanthon (108), 3-isomangostin 3.28 Hình 3.17 (109) 1,7-dihydroxyxanthon (88) phân lập; 103, 104 105 hợp chất 21 O O O O O O 116 O OH + O OH HO 115 OH OH OH OH 111a OH O HO O OH OH OH 111b O OH OH OH HO O O 104 105 O O OH H O O OH O O HO HO O O OMe HO 103 O O O O O MeO MeO O HO OH O OH O H OH 111c O O OH OH 111d OH O OH O MeO O OH HO MeO OH O O HO OH O HO OH O HO 87 90 OH 106 HO O O OH O OH 111 HO O O OH OH OH OH MeO OH HO Hình 3.14 Con đường sinh tổng hợp đề nghị cho 111 O OH O MeO HO OH O OH MeO O O HO O 41 89 85 OH OH O Hydrat hoù a O MeO OH OH OH O HO O MeO HO OH O OH OH Pedunxanthon D (103) 25 22 MeO HO O O 113 O MeO Hydrat hoù a HO O OH MeO O 109 O HO O Hình 3.15 Con đường sinh tổng hợp đề nghị cho 107-109 112-113 20 MeO 108 O O 109 8a 1642 (C=O liên hợp), 1605 (C=C OH O 9a benzen) cm-1 Phổ UV: λmax 243, 258 11 12 14 HO HO hòa 13 Phổ IR: νmax 3170 (O−H), 24 18 16 O O (m/z 501,2259 [M+Na]+), độ bất bão 20 NADPH O OH Gum màu vàng HR-ESIMS: C29H34O6 23 OH O O 108 - H2 O OH HO O O 107 41 OH O 107 [O], đóg vòg n n O MeO 88 O HO OH OH OH MeO 112 O O MeO HO MeO OH O OH HO 10a O 103 4a (sh), 317 356 (sh) nm] O 15 Phổ 1H 13C NMR (Bảng 3.9) cho tín hiệu cộng hưởng ứng với Thành phần hóa học loài khảo sát chủ yếu dẫn xuất xanthon diện nhóm -OH liên kết hydrogen nội phân tử nhóm alkyl hóa với kiểu mẫu oxygen hóa phổ biến biết đến chi carbonyl tương ứng, hai proton benzen cô lập, nhóm metoxyl, Garcinia giới Kết hồn tồn phù hợp với kết luận vịng 2,2-dimetyldihydropyran nhóm (E)-3,7-dimetyl-2,6-octadienyl nhiều tác giả cho dẫn xuất xanthon chất điểm sinh học hay geranyl với 10 carbon benzen đặc trưng chi Garcinia họ Bứa Từ phân tích kiểu mẫu Trong phổ HMBC, proton nhóm -OH liên kết hydrogen nội phân tử oxygen hóa xanthon phân lập thông tin (δH 13,70) cho tương quan với carbon benzen mang oxygen (δC 160,7) đường sinh tổng hợp xanthon thực vật bậc cao công bố, hai carbon benzen (δC 114,4 103,5) nên chúng C-1, C-2 đường sinh tổng hợp xanthon phân lập mối quan hệ C-9a Hai proton metylen có độ dịch chuyển hóa học lớn vịng chúng chúng tơi đề nghị (Hình 3.13-1.16) dihydropyran (δH 2,79; H2-11) cho tương quan với C-1, C-2 carbon benzen mang oxygen (δC 161,7) nên vòng gắn vào nhân xanthon C-2 C-3 với C-3 mang oxygen Trong phổ 1H NMR, vắng mặt tín hiệu O mang nhóm proton metylen benzyl nhóm geranyl xuất O OH OH O OH OH O benzen mang oxygen (δC 155,2 154,5) carbon benzen δC 112,4 Do proton benzen gắn vào C-5, nhóm -OH tự nối với C-6 (Hình 25 O 95 Vậy hợp chất (E)-1,6dihydroxy-7-metoxy-8-(3,7dimetyl-2,6-octadienyl)-2,2dimetyldihydropyran[3,2-b]xanthon (103) Đây hợp chất mới, đặt tên pedunxanthon D 24 18 H OH O 16 MeO 11 9a 8a 14 HO O H H O 13 15 OH OH OH OH OH 99 OMe 97 OMe 98 O OH O O O O OH O OH OH O OMe DMAPP IPP [O] - H2O SAM O 20 OH O OH 23 OH OH O C-7 Proton benzen cô lập (δH 6,82) cho tương quan với C-7, hai carbon OMe 101 OH IPP [O] - H2O OH 24 tương quan với carbon benzen mang oxygen (δC 142,7) nên carbon 3.5) O HO OMe 100 X8H vùng từ trường thấp (δH 4,14; H2-16) nên nhóm gắn vào C-8 nằm OH O X6H ứng với proton benzen vị trí peri nhóm carbonyl cho thấy C-8 vùng giảm chắn nhóm carbonyl Trong phổ HMBC, H2-16 cho OH O IPP SAM O O [O] - H2O O OH 110 OH O X8H DMAPP OH OH O OH IPP O OH 114 O OH OH OH 96 Hình 3.13 Con đường sinh tổng hợp đề nghị cho 95-101 110 Hình 3.5 Tương quan HMBC 103 10 19 182,8 9a 103,5 10a 155,8a a : Có thể hốn đổi lẫn 1-OH 7-OMe 13,90 s 3,86 s 61,5 3.5 Hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính gây độc tế bào 14 xanthon hai dòng tế bào ung thư HeLa NCI-H460 theo phương pháp SRB với chứng dương camptothecin thực Kết trình bày Bảng 3.26 Bảng 3.3 3.9 Số liệu phổ 1H 13C NMR pedunxanthon C (97) aceton-d6 pedunxanthon D (103) CDCl3 (Trị số ngoặc J tính Hz) Vị trí Pedunxanthon C (97) Pedunxanthon D (103) δH δC δH δC 163,3 160,7 6,43 s 96,3 111,4 166,4 161,7 114,8a 6,33 s 93,9 4a 155,9 155,9 134,4 6,82 s 101,6 146,6 155,2 b Bảng 3.26 Nồng độ gây độc tế bào IC50 xanthon hai dòng tế bào HeLa NCI-H460* STT Tên mẫu IC50 (µg/ml) HeLa NCI-H460 Globuxanthon (110) 22,83 ±2,81 19,773 ±2,70 Cowanin (87) 64,90 ±0,93 67,85 ±2,56 Cowanol (85) 75,79 ±1,40 77,78 ±6,40 Norcowanin (108) 26,10 ±1,64 31,97 ±1,89 Fuscaxanthon A (89) 95,28 ±0,81 97,52 ±2,83 6-O-Demetyloliverixanthon (90) 50,64 ±1,76 40,69 ±2,83 Pedunxanthon D (103) 24,90±0,39 26,07±1,49 Pedunxanthon E (104) 59,45±1,81 69,03±2,07 Pedunxanthon F (105) 10 α-Mangostin (41) 58,66 ±2,24 62,43 ±1,09 11 3-Isomangostin (109) 43,29 ±2,94 55,57 ±1,36 12 Garbogiol (99) 64,75 ±2,46 13 Griffipavixanthon (111) 23,30 ±1,35 28,21 ±2,55 14 Dulxanthon A (101) 22,00 ±0,25 28,08 ±0,35 15 Camptothecin (chứng dương) 0,013 ± 0,001 0,006 ± 0,001 - Giá trị IC50 tính trung bình cho lần thử nghiệm - Hoạt tính q thấp, xem khơng có hoạt tính *: Thực Phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Bộ môn Di truyền, Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh 3.6 Nhận xét chung 3.6.1 Về thành phần hóa học đường sinh tổng hợp 18 8a 9a 10a 11 12 13 119,3 113,0 114,6a 181,8 103,9 146,6 7,42 s 42,0 151,9 107,5 6,39 dd (17,5 & 10,4) HE: 4,91 dd (17,5) HZ: 4,81 dd (10,4 & 1,3) 1,71 s 1,71 s 6,58 d (10,0) 5,90 d (10,0) 142,7 137,2 112,4 182,1 103,5 154,5 b 2,79 t (6,8) 1,80 m 14 29,6 1,31 s 15 29,6 1,31 s 16 122,1 4,10 d (6,5) 17 132,5 5,27 t (6,5) 18 79,0 19 1,51 s 28,3 2,00 m 20 1,51 s 28,3 2,05 m 21 5,03 t (6,4) 22 23 1,55 s 24 1,82 d (1,0) 25 1,60 d (1,0) 1-OH 13,56 s 13,70 s 3-OH 5-OH 8,27 br s 8-OH 3-OMe 3,90 s 56,2 7-OMe 3,80 s a,b : Ký hiệu giống cột hốn đổi lẫn 11 16,2 41,4 72,5 29,8 29,8 26,6 123,4 135,5 39,8 26,7 124,4 131,2 17,7 16,5 25,6 62,1 Pedunxanthon E (104) 25 22 hiệu ứng giảm chắn nhóm carbonyl Hơn nữa, tín hiệu cộng hưởng 69,6 (c = 1,6 mg nhóm metoxyl xuất δC 61,5 phổ 13C NMR cho thấy nhóm ml MeOH) HR-ESIMS: C29H34O7 (m/z 517,2210 [M+Na]+), độ bất bão hòa 13 Phổ IR: νmax 3393 (O−H), 1708 (C=O liên hợp), 1613 (C=C benzen) cm-1 Phổ UV: λmax 243, 259 (sh), 317 356 (sh) nm gắn vào carbon benzen có hai vị trí orto hồn tồn bị Để thỏa mãn Gum màu vàng 23 20 24 14 18 16 MeO 8a 10a 9a HO HO OH O O 15 11 4a 12 OH [α] 25 D điều kiện này, vị trí C-6 nhân xanthon phải mang nhóm -OH tự nhóm metoxyl gắn vào C-5 C-7 Trong phổ HMBC, proton H216 cho tương quan với carbon benzen mang oxygen (δC 144,5) nhóm metoxyl cho tương quan với carbon benzen chứng tỏ C7 mang nhóm metoxyl proton benzen lập cịn lại (δH 6,83) H-5 (Hình 3.12) 104 Phổ 1H 13C NMR (Bảng 3.10) cho tín hiệu cộng hưởng tương tự pedunxanthon D (103) Điểm khác biệt có diện nhóm 2- 19 OH 20 18 hydroxy-3-metyl-3-butenyl thay vịng 2,2-dimetyldihydropyran So sánh số liệu phổ 1-D NMR tương quan phổ HMBC 104 với phổ 103 cho thấy hai hợp chất có vịng B giống Trong phổ HMBC, proton nhóm hydroxyl liên kết hydrogen nội O 16 MeO 8a O H 13 11 10a HO OH OH 4a 15 OH H Vậy hợp chất (Z)-1,3,6trihydroxy-7-metoxy-2-(4-hydroxy3-metylbut-2-enyl)-8-(3-hydroxy-3metylbutyl)-xanthon Đây hợp chất mới, đặt tên schomburgxanthon (112) phân tử (δH 14,01) cho tương quan với carbon benzen mang oxygen (δC 162,3) hai carbon benzen (δC 109,0 103,6) nên chúng là C-1, C-2 C-9a Hai proton metylen benzyl (δH 3,08 2,89; H2-11) thuộc Hình 3.12 Tương quan HMBC 112 nhóm 2-hydroxy-3-metyl-3-butenyl cho tương quan với C-1, C-2 carbon benzen mang oxygen (δC 164,7) nên nhóm 2-hydroxy-3-metyl-3butenyl gắn vào nhân xanthon vị trí C-2 C-3 mang oxygen (δC 164,7) Từ suy C-4 mang proton (Hình 3.6) 14 HO OH O 13 15 11 9a O OH H Hình 3.6 Tương quan HMBC vòng A 104 Vậy 104 (E)-1,6-dihydroxy-7-metoxy8-(3,7-dimetyl-2,6-octadienyl)-2-(2hydroxy-3-metyl-3-butenyl)xanthon Đây hợp chất mới, đặt tên pedunxanthon E Tuy nhiên cấu hình carbon khơng đối xứng C-12 chưa xác định 12 Bảng 3.24 Số liệu phổ 1H 13C ngoặc J tính Hz) Vị trí δH δC 161,6 110,1 163,3 6,37 s 93,5 4a 156,3 6,83 s 102,5 157,8a 144,5 140,0 8a 115,0 NMR 112 aceton-d6 (Trị số Vị trí 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 17 δH 3,45 m 5,36 t (7,5) 4,31 s 1,76 s 3,45 m 1,77 m 1,30 s 1,30 s δC 21,7 125,2 135,7 61,7 22,1 22,9 43,4 72,4 27,6 27,6 OH OH 25 OH OH O Pedunxanthon F (105) O MeO O OH OH 22 23 HO MeO Gum màu vàng [α] 25 + 141,8 (c = 1,9 D mg ml MeOH) HR-ESIMS: 20 C29H34O7 (m/z 495,2392 [M+H]+), độ 24 HO O OH HO O 112 113 Schomburgxanthon (112) 19 OH 20 18 MeO OH 14 11 8a 13 HO OH O 16 O 112 10a O 15 4a OH O 18 88 Tinh thể hình kim màu vàng nhạt, đnc 198-199 °C HR-EIMS: C24H28O8 (m/z 444,1805 [M]+), độ bất bão hòa 11 Phổ IR: νmax 3420 (O−H), 1644 (C=O liên hợp), 1581 (C=C benzen) cm-1 Phổ UV: λmax 243, 258, 316 355 nm Phổ 1H 13C NMR (Bảng 3.24) cho tín hiệu cộng hưởng tương tự cowanin (87) ngoại trừ nhóm geranyl vị trí C-8 thay nhóm 3-hydroxy-3-metylbutyl Trong phổ HMBC, proton nhóm -OH liên kết hydrogen nội phân tử (δH 13,98) cho tương quan với carbon benzen mang oxygen (δC 161,5) hai carbon benzen (δC 110,1 103,5) nên chúng C-1, C-2 C-9a Proton nhóm metylen benzyl (δH 3,45; H2-11) cho tương quan với C-1, C-2 carbon benzen mang oxygen (δC 163,3) nên carbon C-3 xác nhận nhóm 4-hydroxy-3-metylbut-2-enyl gắn vào C-2 Proton benzen lập (δH 6,37) tương quan với C-3, carbon benzen mang oxygen (δC 156,3) nên proton H-4 carbon benzen mang oxygen C-4a Do độ dịch chuyển hóa học C-15 (δC 22,1) tương tự cowanol (85) nên liên kết đơi C-12/C-13 có cấu hình Z Nếu liên kết đơi có cấu hình E nhóm metyl vinyl bị giảm chắn hiệu ứng γ (δC < 18 ppm) Vậy vòng A SE3 xác định Ngoài proton metylen benzyl (δH 3,45; H2-16) nhóm 3-hydroxy-3- 16 HO bất bão hịa 13 Phổ IR: νmax 3410 OMe O 11 HO 10a O 105 9a 4a 12 OH (O−H), 1740 (C=O liên hợp), 1610 14 8a (C=C benzen) cm-1 Phổ UV: λmax 243, O 15 255 (sh), 307 350 (sh) nm Phổ 1H 13C NMR (Bảng 3.11) cho tín hiệu cộng hưởng tương tự phổ fuscaxanthon B (15) cô lập từ G fusca có điểm khác biệt 105 khơng có tín hiệu cộng hưởng nhóm –OH liên kết hydrogen nội phân tử Lý luận tương tự trường hợp pedunxanthon D (103), nhóm geranyl gắn vào C-8 Trong phổ HMBC, proton metylen benzyl (δH 4,12; H2-16) nhóm geranyl cho tương quan với carbon benzen mang oxygen (δC 144,3) hai carbon benzen (δC 137,8 115,5) nên carbon benzen mang oxygen C-7 Proton benzen cô lập (δH 6,72) cho tương quan với C7, hai carbon benzen mang oxygen (δC 155,4 154,9) carbon benzen δC 115,5 Vậy proton benzen gắn vào C-5 nhóm -OH tự gắn vào C-6 Sự vắng mặt tín hiệu ứng với nhóm -OH liên kết hydrogen nội phân tử phổ 1H NMR với tín hiệu cộng hưởng bị che chắn nhiều carbon carbonyl (δC 176,2) phổ 13C NMR cho thấy nhóm metoxyl gắn vào C-1 Ảnh hưởng tương tự nhóm gắn vào C-1 quan sát dẫn xuất xanthon khác 1,3,5,8-tetramethoxy-2-(3metylbut-2-enyl)xanthon (δC 174,9) Hơn carbon nhóm metoxyl xuất vùng từ trường thấp (δC 61,3) nên vị trí C-2 phải mang nhóm metylbutyl xuất vùng từ trường thấp chứng tỏ nhóm gắn vào C-8 Trong phổ HMBC, proton metylen benzyl (δH 2,95 2,57; H2-11) 16 13 proton carbinol 3,82; (δH H-12) thuộc vòng 2,2-dimetyl-3- hydroxydihydropyran cho tương quan với carbon benzen (δC 105,0) Điều cho thấy vòng súc hợp thẳng với nhân xanthon vị trí C-2 C-3 với C-3 mang oxygen (Hình 3.7) 25 23 20 24 18 H HO HO O 16 H OMe 9a H 8a OH 12 13 O H 14 O 15 Vậy hợp chất (E)-6,7dihydroxy-1-metoxy-8-(3,7-dimetyl2,6-octadienyl)-2,2-dimetyl-3hydroxydihydropyran[3,2-b]xanthon (105) Đây hợp chất mới, đặt tên pedunxanthon F Tuy nhiên cấu hình carbon khơng đối xứng C12 chưa xác định Hình 3.6 Tương quan HMBC 105 15 1,83 s 16 4,14 d (6,5) 17 5,28 t (6,5) 18 19 1,98 m 20 2,07 m 21 5,04 t (6,3) 22 23 1,52 s 24 1,83 s 25 1,56 s 1-OH 14,01 s 1-OMe 7-OMe 3,80 s a,b : Có thể hốn đổi lẫn 18,4 26,9 124,9 135,1 40,5 27,4 125,2 131,6 17,7 16,6 25,7 1,44 s 4,12 d (6,5) 5,33 t (6,5) 26,1 26,5 125,7b 134,5 40,6 27,5 125,3b 131,5 17,7 16,6 25,8 1,97 m 2,06 m 5,05 t (6,5) 1,53 s 1,83 s 1,56 s 3,78 s 61,3 61,4 3.3 Thành phần hóa học vỏ sơn vé Từ cao eter dầu hỏa vỏ sơn vé, phân lập hợp Bảng 3.10 3.11 Số liệu phổ 1H 13C NMR pedunxanthon E (104) pedunxanthon F (105) aceton-d6 (Trị số ngoặc J tính Hz) Vị trí Pedunxanthon E (104) Pedunxanthon F (105) δH δC δH δC 162,3 144,2 109,0 105,0 164,7 160,6 6,33 s 94,3 6,39 s 94,2 4a 156,4 157,6 6,83 s 102,8 6,72 s 102,2 157,6 154,9a 144,8 144,2 138,3 137,8 8a 112,1 115,5 182,9 176,1 9a 103,6 108,0 10a 156,3 155,4a 11 3,08 dd (14,5 & 3,0) 29,9 2,95 dd (16,8 & 5,8) 27,2 2,89 dd (14,5 & 7,8) 2,57 dd (16,8 & 8,0) 12 4,41 dd (7,8 & 3,0) 76,7 3,82 m 69,2 13 148,4 78,6 14 4,94 s 4,79 s 110,4 1,30 s 20,6 14 chất định danh hợp chất globuxanthon (110), griffipavixanthon (111) 1,7-dihydroxyxanthon (88) OH O OH HO O OH O OH O OH O O OH 110 HO OH HO O OH 111 OH O 88 OH 3.4 Thành phần hóa học vỏ bứa đồng Từ cao etyl acetat vỏ bứa đồng, phân lập định danh hợp chất schomburgxanthon (112), 3-isomangostin hydrat (113) 1,7-dihydroxyxanthon (88) Trong 112 hợp chất 15 ... HCTN - Giới thiệu họ Bứa (Guttiferae) - Giới thiệu chi Garcinia: Đặc điểm thực vật, công dụng thành phần hóa học (tổng hợp tài liệu tham khảo giới nghiên cứu hóa học chi Garcinia Việt Nam) Quá... Nguyen, Gerhard Maas, Udo R Werz, Hung D Pham, Lien-Hoa D Nguyen (2012), “Xanthones from the bark of OH Garcinia pedunculata”, Phytochemistry Letters, Vol 5(4), pp 766O OMe O OH O OH 98 O O OH... OMe 4a 11 95 14 Phổ IR: νmax 12 tetraoxygenated Lien-Hoa xanthones D Nguyen from the (2012), bark of “Cytotoxic Garcinia Võ Tấn Hậu, Lê Đức Đẳng, Phạm Đình Hùng, Harrison J Leslie, Nguyễn Diệu