TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA SƯ PHẠM  ĐỀ TÀI: Luận văn tốt nghiệp Ngành: Sư phạm Hóa học KHẢO SÁT DƯ LƯỢNG CHẤT KHÁNG SINH HỌ QUINOLONE TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Thu Thủy Th.S Lê Bảo Ngọc Sinh viên thực hiện: Nguyễn Lâm Thùy Dương MSSV: 2091959 Lớp: Sư phạm Hóa học K35 Cần Thơ, 2012 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương I LỜI CẢM ƠN    Để hoàn thành đề tài Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ Quinolone trong thủy sản bằng kỹ thuật sắc kí lỏng ghép khối phổ, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức, kinh nghiệm và kỹ năng chuyên môn bổ ích, thiết thực từ quý thầy cô và bạn bè. Với tấm lòng trân trọng và biết sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến:  Cô Nguyễn Thị Thu Thủy – Bộ môn Sư Phạm Hóa Học – Khoa Sư Phạm đã trực tiếp hướng dẫn tôi. Cô đã tận tình giúp đỡ, quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp.  Cô Lê Bảo Ngọc – Giám Đốc Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm TP.HCM chi nhánh Cần Thơ đã giúp đỡ tôi và tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất để tôi hoàn thành đề tài.  Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm TP.HCM chi nhánh Cần Thơ, đặc biệt là các anh trong tổ Sắc Ký đã nhiệt tình giúp đỡ và chia sẻ những kinh nghiệm bổ ích trong quá trình thực hiện phân tích mẫu.  Tập thể các thầy cô Bộ môn Hóa - Khoa Sư Phạm đã truyền thụ những kiến thức, kinh nghiệm giảng dạy quý báu trong suốt bốn năm qua.  Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và tập thể các bạn lớp Sư phạm hóa khóa 35 đã luôn bên cạnh, ủng hộ và chia sẻ những khó khăn, vất vả trong suốt thời gian qua. Sinh viên thực hiện Nguyễn Lâm Thùy Dương Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương II TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc BỘ MÔN HÓA HỌC NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy Th.s Lê Bảo Ngọc 2. Tên đề tài: “Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” 3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Lâm Thùy Dương MSSV: 2091959 Lớp Sư phạm Hóa học K35 4. Nội dung nhận xét: a. Nhận xét về hình thức LVTN: b. Nhận xét về nội dung của LVTN: - Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: - Những vấn đề còn hạn chế: Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương III c. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm nếu có): d. Kết luận, đề nghị và điểm: Cần Thơ, ngày tháng….năm 2013 Cán bộ hướng dẫn Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương IV TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA SƯ PHẠM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc BỘ MÔN HÓA HỌC NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1. Cán bộ phản biện: 2. Tên đề tài: “Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” 3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Lâm Thùy Dương MSSV: 2091959 Lớp Sư phạm Hóa học K35 4. Nội dung nhận xét: a. Nhận xét về hình thức LVTN: b. Nhận xét về nội dung của LVTN: - Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: - Những vấn đề còn hạn chế: Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương V c. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm nếu có): d. Kết luận, đề nghị và điểm: Cần Thơ, ngày tháng….năm 2013 Cán bộ phản biện Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương VI MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN I MỤC LỤC V DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT X DANH MỤC HÌNH XI DANH MỤC BẢNG XII TÓM TẮT NỘI DUNG……………………………………………………………………… XIII PHẦN I: MỞ ĐẦU 1 I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1 II. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI 1 III. GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI 2 IV. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 V. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 2 PHẦN II: NỘI DUNG 3 A. CƠ SỞ LÍ THUYẾT………………………………………………………………………… 3 I. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH [3],[4],[11] 3 1. Định nghĩa 3 2. Nguyên nhân tồn lưu kháng sinh trong thực phẩm 3 3. Cơ chế tác động của chất kháng sinh 3 4. Phân loại chất kháng sinh 4 II. GIỚI THIỆU VỀ QUINOLONE [3],[4],[7],[8],[10],[11],[12] 4 1. Khái quát 4 2. Phân loại Quinolone 5 3. Công thức cấu tạo 5 4. Tính chất acid - base nhóm quinolone: 5 III. CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN [3],[4],[6],[12],[14] 6 1. Ciprofloxacin: 6 2. Enrofloxacin: 7 3. Tác dụng điều trị của Enrofloxacin và Ciprofloxacin 8 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương VII 3.1. Ciprofloxacin 8 3.2. Enrofloxacin 8 4. Tác hại và liều lượng cho phép của Enrofloxacin, Ciprofloxacin 8 IV. SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO [2],[3],[4],[5],[13] 10 1. Khái niệm 10 2. Phân loại 10 2.1. Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC). 10 2.2. Sắc ký hấp phụ 10 2.3. Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC). 10 2.4. Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC). 10 3. Ưu nhược điểm của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 10 4. Các đại lượng đặc trưng của sắc kí lỏng hiệu năng cao 11 4.1. Thời gian lưu 11 4.2. Hệ số phân bố 11 4.3. Hệ số dung lượng 12 4.4. Hiệu năng 12 4.5. Độ chọn lọc α 13 4.6. Số đĩa lí thuyết (N) và chiều cao (H) của đĩa lí thuyết trong cột sắc ký 13 4.7. Độ phân giải (R s ) 13 5. Các bộ phận của máy sắc kí lỏng hiệu năng cao 14 5.1. Bình chứa dung môi giải ly cột 14 5.2. Bộ khử khí (Degasse ) 16 5.3. Bơm cao áp 16 5.4. Bộ phận tiêm mẫu ( injection) 16 5.5. Cột sắc ký 17 5.5.1. Khái niệm 17 5.5.2. Phân loại 17 5.6. Đầu dò 17 5.7. Bộ phận ghi nhận tín hiệu 18 5.8. In dữ liệu 18 6. Giới thiệu về đầu dò khối phổ – đầu dò MS ba tứ cực 18 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương VIII 6.1. Bộ tạo ion 19 6.2. Bộ tách khối 19 6.3. Một số kỹ thuật scan trên thiết bị MS/MS ba tứ cực 21 6.4. Bộ dò ion (detector) 22 V. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HỌ QUINOLONE [3],[4],[6],[8],[10] 22 1. Phương pháp trắc quang 22 2. Phương pháp Elisa 23 2.1. Giới thiệu chung 23 2.2. Nguyên liệu 23 2.3. Hướng dẫn an toàn 23 2.4. Bảo quản và lưu trữ 24 2.5. Nguyên tắc thử 24 2.6. Kết quả 24 3. Phương pháp điện hóa 25 4. Phương pháp HPLC – đầu dò UV và DAD 25 5. Phương pháp HPLC – đầu dò huỳnh quang 25 6. Phương pháp HPLC – đầu dò MS 26 7. Phương pháp xác định dư lượng enrofloxacin, ciprofloxacin trong thịt gà, cá tra bằng phương pháp sắc kí lỏng ghép 2 lần khối phổ (LC-MS/MS) 26 7.1. Nguyên tắc 26 7.2. Thiết bị – hóa chất 26 7.3. Qui trình xử lí mẫu 28 7.4. Điều kiện phân tích bằng LCMS 28 7.5. Dung dịch chuẩn 29 7.6. Khảo sát khoảng tuyến tính và dựng đường chuẩn của enrofloxacin và ciprofloxacin 29 7.7. Xác định hiệu suất thu hồi và độ chụm của phương pháp trên mẫu thực tế như cá diêu hồng, cá basa, thịt gà 29 B. THỰC NGHIỆM 31 I. XÂY DỰNG CÁC YẾU TỐ TRONG QUÁ TRÌNH THỰC NGHIỆM 31 1. Nguyên tắc 31 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương IX 2. Dụng cụ và thiết bị 31 3. Hóa chất 31 4. Cách tiến hành 32 4.1. Yêu cầu chung 32 4.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn 32 4.2.1. Chuẩn dung dịch gốc C o (100ppm): 32 4.2.2. Chuẩn trung gian 32 4.2.3. Chuẩn làm việc: 32 4.3. Chọn lọc các yếu tố phân tích bằng LC-MS 33 4.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính 33 4.3.2 Khảo sát độ lặp lại 36 4.3.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 39 4.3.4. Khảo sát độ đúng 40 4.3.5 Tổng kết kết quả thẩm định phương pháp 41 4.4. Thu mua mẫu 41 4.5. Tiến hành phân tích mẫu 41 II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42 1. Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh Enrofloxacin 42 2. Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh Ciprofloxacin 43 PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 I. KẾT LUẬN 45 II. KIẾN NGHỊ 45 PHỤ LỤC 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 [...]... xuất, kinh doanh thủy sản Trước tình đó các doanh nghiệp xuất khẩu tôm và Cục quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản (NAFIQAD) đã tăng cường công tác kiểm soát dư lượng kháng sinh trong thành phẩm tôm và tôm nguyên liệu, xuất phát từ nhu cầu trên nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ ở địa bàn... dư lượng các chất kháng sinh vượt quá giới hạn cho phép, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng Vấn đề nghiên cứu và áp dụng các phương pháp tiên tiến để phân tích xác định, đánh giá dư lượng kháng sinh sao cho vừa hiệu quả vừa phù hợp với điều kiện thực tế ở nước ta là rất cần thiết Đề tài “ KHẢO SÁT DƯ LƯỢNG CHẤT KHÁNG SINH HỌ QUINOLONE TRONG TÔM CÁ BẰNG KĨ THUẬT SẮC KÍ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ... gian có hạn nên đề tài chỉ khảo sát một số loại dư lượng đang được sử dụng rộng rãi như: ciprofloxacin, enrofloxacin IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để thực hiện đề tài Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ Tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu khoa học - Điều tra - Tổng kết kinh nghiệm (đọc tài liệu và tham khảo từ những nghiên cứu trước)... Lâm Thùy Dương IV SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO[2],[3],[4],[5],[13] 1 Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế... Ion tạo trong pha hơi - Thích hợp cho chất không bền - Thích hợp cho chất bền nhiệt nhiệt - Thích hợp cho chất kém phân cực - Thích hợp cho chất khá phân cực - Thích hợp cho chất có phẩn tử khối nhỏ - Thích hợp cho chất có phẩn tử khối lớn 6.2 Bộ tách khối Hiện nay có ba kỹ thuật tách có thể thực hiện MS/MS: kỹ thuật bẫy ion và kỹ thuật ba tứ cực, kỹ thuật TOF (Time-Of-Flight, thời gian bay) Trong đề... đánh giá được tình hình dư lượng chất kháng sinh họ Quinolone ở các chợ trên địa bàn thành phố Cần Thơ, giúp cho người dân cảnh giác hơn đối với việc sử dụng các sản phẩm từ tôm, cá, đồng thời kết quả thu được sẽ là thông tin bổ ích đến người nuôi trồng thủy sản giúp họ sử dụng hợp lí các chất kháng sinh trong quá trình nuôi, giảm thiệt hại cho các doanh nghiệp xuất khẩu thủy sản Do thời gian và điều... nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương TÓM TẮT NỘI DUNG Sử dụng chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản để đề phòng và điều trị các bệnh nhiễm trùng đã đạt được nhiều thành tựu to lớn, giúp sản lượng và chất lượng của các mặt hàng thủy sản ngày càng được nâng cao Tuy nhiên, những hậu quả do nó gây cũng không ít Trong những năm gần đây, do việc lạm dụng chất kháng sinh mà một số lô hàng của Việt Nam xuất khẩu sang... 2 Phân loại Trong HPLC, tùy bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh (SP) trong cột tách mà người ta chia thành: 2.1 Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC) 2.2 Sắc ký hấp phụ, có 2 loại: + Pha thường (Normal phase: NP-HPLC), + Pha ngược hay pha đảo (Reverse phase: RP- HPLC), 2.3 Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC) 2.4 Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC) - Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB)... kết quả thu được sẽ là thông tin bổ ích gửi đến người nuôi thủy sản, giúp họ ý thức hơn trong quá trình sử dụng kháng sinh trong quá trình nuôi, tránh ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng và làm giảm khả năng cạnh tranh của thủy sản Việt Nam 1 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Lâm Thùy Dương III GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI Khảo sát dư lượng kháng sinh họ quinolone trên một số mẫu tôm, cá ở khu vực thành phố Cần... nên đề chỉ mới khảo sát được 2 chất kháng sinh thuộc họ quinolone là enrofloxacin và ciprofloxacin Nội dung thực hiện:  Bước 1: Thu mua mẫu ở một số chợ trên địa bàn Thành Phố Cần Thơ  Bước 2: Xử lý mẫu: mẫu sau khi đồng nhất được tách chiết bằng dung môi HCOOH/acetonitril, thổi khô và cô cạn bằng MeOH/H2O 1:1  Bước 3: Tiến hành phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ LC/MS-MS Sau . tài Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ Quinolone trong thủy sản bằng kỹ thuật sắc kí lỏng ghép khối phổ, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức, kinh nghiệm và kỹ. dẫn: Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy Th.s Lê Bảo Ngọc 2. Tên đề tài: Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ 3. Sinh viên thực hiện:. tài: Khảo sát hàm lượng chất kháng sinh họ quinolone trong tôm, cá bằng kĩ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ 3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Lâm Thùy Dương MSSV: 2091959 Lớp Sư phạm Hóa học