Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM * BÙI XUÂN THẮNG NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ðỐI KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA PALMIVORA GÂY BỆNH TRÊN SẦU RIÊNG Chuyên nghành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60620112 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. HÀ MINH THANH HÀ NỘI, 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hà Minh Thanh - Trưởng Bộ môn Bệnh cây – Viện Bảo vệ thực vật, người thầy ñã tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài và hoàn thành tốt luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh ñạo Viện Bảo vệ thực vật, bộ môn Thuốc, Cỏ dại và Môi trường, Bộ môn Bệnh cây ñã cho phép, tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ về cơ sở vật chất, kỹ thuật, vật liệu trong quá trình thực hiện ñề tài. Lời cảm ơn chân thành tôi xin ñược gửi tới các Thầy, Cô giáo và tập thể cán bộ Ban ðào tạo Sau ðại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ñã tận tình dạy bảo và giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ nhiệt tình của các ñồng nghiệp nhóm chế phẩm phân tích, nhóm cây màu và tập thể cán bộ Bộ môn Thuốc, Cỏ dại và Môi trường, Bộ môn Bệnh cây – Viện Bảo vệ thực vật ñã tạo mọi ñiều kiện về cơ sở vật chất cũng như phương pháp nghiên cứu cho tôi thực hiện, hoàn thành luận văn. Cuối cùng là lòng biết ơn những người thân trong gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp ñã ñộng viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày 23 tháng 12 năm 2013 Tác giả luận văn Bùi Xuân Thắng Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan toàn bộ các kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng sử dụng cho bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn ñều ñã ñược cảm ơn và thông tin tài liệu ñều ñược ghi rõ nguồn gốc. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về số liệu của luận văn này. Tác giả luận văn Bùi Xuân Thắng Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii MỤC LỤC Trang i ii iii iv v vi vii 1 4 4 5 5 5 7 16 16 19 20 23 25 25 26 Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam ñoan Mục lục Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, ñồ thị MỞ ðẦU Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cơ sở khoa học của ñề tài 1.2. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan ñến ñề tài 1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước 1.2.1.1. Thiệt hại do nấm Phytophthora spp. gây ra trên thế giới 1.2.1.2. Biện pháp phòng trừ bệnh do nấm Phytophthora spp. trên thế giới 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 1.2.2.1. Thiệt hại do nấm Phytophthora spp. gây ra trên một số cây trồng chính ở Việt Nam 1.2.2.2. Thiệt hại do nấm Phytophthora spp. gây ra trên sầu riêng ở Việt Nam 1.2.2.3. Tình hình nghiên cứu, sử dụng vi sinh vật ñối kháng nấm Phytophthora spp. ở Việt Nam Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.2. Nội dung nghiên cứu 26 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv 28 29 35 38 38 38 40 40 43 48 48 49 51 53 54 54 55 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Thu thâp và phân lập nguồn nấm Phytophthora palmivora và VSV ñối kháng nấm Phytophthora palmivora 2.3.2. Phương pháp ñánh giá kh ả năng ñối kháng của nấm có ích với nấm Phytophthora palmivora 2.3.3. Phương pháp nghiên c ứu ñặc ñiểm sinh học, sinh thái, yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng phát triển và ph ản ứng sinh lý, sinh hóa của các nguồn VSV ñối kháng 2.3.4. Chuẩn ñoán và giám ñịnh các loài VSV bằng phương pháp sinh h ọc phân tử (PCR) Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tình hình bệnh phytophthora palmivora trên sầu riêng 3.2. Thu thập nấm Phytophthora palmivora gây bệnh trên sầu riêng 3.3. Khả năng ñối kháng của vi sinh vật ñối với nấm Phytophthora palmivora gây hại trên sầu riêng 3.3.1. Thu thập vi sinh vật có ích 3.3.2. Xác ñịnh khả năng ức chế nấm bệnh của các VSV có ích 3.4. Nghiên cứu các ñặc ñiểm sinh học của các nguồn vi khuẩn và x ạ khuẩn ñối kháng 3.4.1. ðặc ñiểm hình thái của 7 nguồn vi khuẩn và x ạ khuẩn có có triển vọng 3.4.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dư ỡng nhân tạo khác nhau ñến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng 3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sự sinh trưởng và phát tri ển của vi khuẩn và xạ khuẩn ñối kháng 3.4.4. Ảnh hưởng của pH trong môi trường nuôi cấy ñến sự sinh trưởng v à phát triển của vi khuẩn và xạ khuẩn ñối kháng 3.5. Xác ñịnh một số ñặc tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn và x ạ khuẩn ñối kháng có triển vọng 56 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 57 59 61 63 67 70 71 71 71 3.5.1. Xác ñịnh tính yếm khí của các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn ñối kháng 3.5.2. Khả năng khử Nitrat của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng 3.5.3. Khả năng ñồng hóa nguồn Cacbon từ ñường Glucose và Sacarose c ủa 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng 3.5.4. Khả năng ñồng hóa nguồn Cacbon từ tinh bột tan (Starch) và rư ợu Mannitol của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng 3.5.5. Tính chịu muối (NaCl) của 7 nguồn vi khuẩn và x ạ khuẩn có triển vọng 3.5.6. ðịnh tính hoạt ñộ enzym Amylaza, chitinase, β- glucanase và cellulase của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn triển vọng 3.6. Nghiên cứu nhân sinh khối vi sinh vật ñối kháng nấm P. Palmivora 3.7. ðánh giá ñộc tính của vi sinh vật ñối kháng trên chuột bạch 4.8. Giám ñịnh nấm Phytophthora và VSV có ích KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ Kết luận ðề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Tiếng Anh PHỤ LỤC Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC CÁC BẢNG TT bảng Tên bảng Trang 3.1 Tình hình bệnh do nấm Phytophthora palmivora gây ra trên sầu riêng 38 3.2 Thu thập nguồn nấm Phytophthora palmivora gây bệnh trên sầu riêng 39 3.3 Kết quả phân lập nấm Phytophthora từ mồi bẫy cánh hoa hồng 40 3.4 Phân lập vi sinh vật có ích từ ñất trồng cây bị bệnh nấm Phytophthora palmivora 42 3.5 Khả năng ñối kháng của 7 nguồn vi sinh vật có triển vọng với nấm Phytophthora palmivora gây bệnh trên hồ tiêu và sầu riêng 43 3.6 Hiệu quả ức chế bằng ký sinh trực tiếp của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn với nấm Phytophthora palmivora gây bệnh trên sầu riêng 44 3.7 Khả năng ức chế của nấm Trichoderma với nấm Phytophthora trên môi trường nuôi cấy 46 3.8 Hiệu quả hạn chế nấm Phytophthora palmivora của các nguồn VSV dạng ñơn chủng và khi tổ hợp trong ñiều kiện nhà lưới 47 3.9 Sự sinh trưởng và phát triển của các dòng VSV có triển vọng trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo 50 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến khả năng phát triển các các dòng VSV tuyển chọn 53 3.11 Khả năng sinh trưởng của các nguồn vi khuẩn, xạ 54 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii khuẩn ñối kháng trong các ñiều kiện pH khác nhau. 3.12 Xác ñịnh tính yếm khí của các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn ñối kháng 55 3.13 Khả năng khử nitrat của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn ñối kháng có triển vọng 56 3.14 Khả năng ñồng hóa nguồn Cacbon từ ñường Glucose và Sacarose của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng 57 3.15 Khả năng ñồng hóa nguồn Các bon từ tinh bột tan và rượu Mannitol của 7 dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng 59 3.16 Khả năng phát triển của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn triển vọng ở các nồng ñộ NaCl thí nghiệm 60 3.17 ðịnh tính hoạt ñộ enzyme của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng 62 3.18 Ảnh hưởng của các loại môi trường nhân nuôi ñến khả năng nhân sinh khối của nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn 63 3.19 Ảnh hưởng của lượng bột ñậu tương ñến khả năng nhân sinh khối của 2 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn 64 3.20 Ảnh hưởng của tốc ñộ vòng lắc ñến sự phát triển sinh khối của nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn 65 3.21 Ảnh hưởng th ời gian lắc ñến sự sự phát triển của nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn trong môi trường nhân sinh khối 66 3.22 Trọng lượng trung bình của chuột thí nghiệm và chuột không tham gia thí nghiệm 67 3.23 Kết quả ñịnh danh các VSV ñối kháng và nấm Phytophthora gây bệnh trên sầu riêng 69 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC CÁC HÌNH TT hình Tên hình Trang 3.1 Phân lập vi sinh vật có ích từ ñất 42 3.2 Khả năng ñối kháng nấm Phytophthora palmivora bằng chất kháng sinh của vi khuẩn & xạ khuẩn 45 3.3 Hình thái khuẩn lạc của một số nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn ñối kháng cao 49 3.4 Tính chịu muối (NaCl) và ñộ pH của nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn triển vọng 52 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ, ánh sáng ñến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn & xạ khuẩn ñối kháng có triển vọng 52 3.6 Khả năng ñồng hóa nguồn Cácbon từ tinh bột tan (Starch) và rượu Manitol nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn 58 3.7 Khả năng ñồng hóa nguồn Các bon từ ñường Glucose và Sacarose của nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn triển vọng 58 3.8 ðịnh tính hoạt ñộ enzyme Chitinase, β-glucanase và Cellulase của nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn triển vọng 61 3.9 Khả năng khử Nitrat và tính yếm khí của nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn triển vọng 61 3.10 Ảnh hưởng của thời gian lắc ñến nhân sinh khối các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng 66 3.11 ðánh giá ñộc tính (LD50) của các nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn có triển vọng trên chuột bạch 68 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ix DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Chữ viết tắt Chú giải BVTV Bảo vệ thực vật PCA Môi trường khoai tây, cà rốt, agar PDA Môi trường khoai tây, ñường, agar CA Môi trường cà rốt, agar WA Môi trường nước cất, agar VSV Vi sinh vật NA Môi trường: nutrient agar 23g, nước cất 1000ml PSA Môi trường: saccharoza 20 g; Pepton 5,0 g; K 2 HPO 4 0,5g; MgSO 4 .7H 2 O 0,25 g; Nước cất 1000 ml; pH = 6,8 – 7,1 YS Môi trường: yeast extract 2g, Soluble starch 10g, Malt extract 3g, agar 18g, H 2 O 1000ml Gause1 Môi trường: starch 20g, KNO 3 1g, NaCl 0,5g, MgSO 4 .7H 2 O 0,5g, K 2 HPO 3 0,5g, FeSO 4 0,01g, H 2 O 1000ml VK Vi khuẩn XK Xạ khuẩn ðC ðối chứng HQ Hiệu quả [...]... tiêu Tìm ra ñư c m t s vi sinh v t có kh năng ñ i kháng cao v i n m Phytophthora palmivora gây b nh trên cây s u riêng, có kh năng s d ng trong nghiên c u ch ph m sinh h c 1.2.2 Yêu c u - Thu th p và phân l p m u n m Phytophthora palmivora gây b nh trên cây s u riêng - Xác ñinh ñư c m t s dòng vi sinh v t có kh năng ñ i kháng cao v i n m Phytophthora palmivora gây b nh trên cây s u riêng - Th nghi m kh... này, làm ch ph m sinh h c phòng tr b nh Phytophthora palmivora trên s u riêng 1.3.2 Ý nghĩa th c ti n Các k t qu nghiên c u, ñánh giá kh năng ñ i kháng n m Phytophthora palmivora gây b nh trên s u riêng và ñ an toàn c a các vi sinh v t này, là cơ s cho vi c s n xu t ch ph m sinh h c phòng tr b nh Phytophthora palmivora trên s u riêng, góp ph n quan tr ng trong vi c ng d ng bi n pháp sinh h c phòng tr... a vi sinh v t có ích v i n m Phytophthora palmivora trong ñi u ki n nhà lư i 1.3 Ý nghĩa khoa h c và th c ti n c a ñ tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa h c ð tài ñã xác ñ nh ñư c m t s vi sinh v t có kh năng ñ i kháng n m Phytophthora palmivora gây b nh trên s u riêng, ñ ng th i cung c p d n li u khoa h c v kh năng ñ i kháng c a m t s vi sinh v t này, làm cơ s khoa h c cho vi c nghiên c u và ng d ng các vi sinh. .. Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 2 1.4 ð i tư ng, ph m vi và th i gian nghiên c u - ð i tư ng nghiên c u: n m Phytophthora palmivora gây b nh trên cây s u riêng, vi sinh v t ñ i kháng n m Phytophthora palmivora - ð a ñi m nghiên c u: Phòng thí nghi m và nhà lư i B môn B nh cây, Vi n B o v th c v t, ðông Ng c, T Liêm, Hà N i - Th i gian nghiên c u: 6/2012 ñ n 9/2013 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà... ñi m sinh h c, sinh thái, y u t nh hư ng ñ n sinh trư ng phát tri n và ph n ng sinh lý, sinh hóa c a các ngu n VSV ñ i kháng 4 Chu n ñoán và giám ñ nh các VSV ñ i kháng b ng phương pháp sinh h c phân t 2.3 Phương pháp nghiên c u 2.3.1 Thu thâp và phân l p ngu n n m Phytophthora palmivora và VSV ñ i kháng n m Phytophthora palmivora 2.3.1.1 ði u tra tình hình b nh h i s u riêng Theo phương pháp nghiên. .. ký sinh thì b nh do n m Phytophthora gây ra là m t trong nh ng b nh nguy hi m B nh có th phát sinh và gây h i trong su t quá trình sinh trư ng và phát tri n c a s u riêng B nh th i g c và th i qu s u riêng có th gây h i trên 30% di n tích, gây thi t h i trên 50% năng su t và ch t lư ng thương ph m Hi n nay vi c phòng tr b nh ch y u b ng bi n pháp hóa h c Tuy nhiên vi c s d ng nhi u thu c hóa h c ñã gây. .. tiêu Nói chung vi c nghiên c u s d ng các vi sinh v t ñ i kháng, các h p ch t h u cơ, th o dư c như là tác nhân ñ s n xu t ch ph m sinh h c phòng tr b nh Phytophthora trên các cây tr ng chính nư c ta h u như còn riêng l và chưa ñ ng b , ch là nh ng th nghi m quy mô nh h p trong phòng hay trên vư n cây di n tích nh T các thí nghi m trên ñã m ra hư ng ñi nghiên c u ng d ng các VSV ñ i kháng, h p ch t... trên th gi i cũng như Vi t Nam quan tâm Bi n pháp sinh h c là vi c s d ng các vi sinh v t có ích, các loài th o m c, các h p ch t h u cơ như là tác nhân sinh h c trong b o v th c v t r t c n thi t ñ có s n ph m s ch b nh Vì v y, chúng tôi ti n hành th c hi n ñ tài: Nghiên c u vi sinh v t ñ i kháng n m Phytophthora palmivora gây b nh trên s u riêng Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ... tra ñã xác ñ nh ñư c 13 loài Phytophthora Vi t Nam Xem xét s loài Phytophthora các nư c trong vùng hy v ng s xác ñ nh ñư c nhi u loài Phytophthora n a Vi t Nam ði u này hoàn toàn có th vì hi n có s tăng nhanh v s lư ng cây công nghi p, cây ăn qu và cây th c ph m khác nhau ñư c tr ng trên c nư c 1.2.2.2 Thi t h i do n m Phytophthora spp gây ra trên s u riêng Vi t Nam S u riêng là m t trong nh ng cây... m Phytophthora gây h i cây tr ng Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 24 Chương 2 V T LI U, N I DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 V t li u nghiên c u - S u riêng, n m Phytophthora palmivora gây b nh, các vi sinh v t có ích - Các môi trư ng phân l p n m Phytophthora: môi trư ng hay dùng: cà r t – agar, khoai tây – dextrose – agar, b t y n m ch – agar Các ch t kháng . tượng, phạm vi và thời gian nghiên cứu - ðối tượng nghiên cứu: nấm Phytophthora palmivora gây bệnh trên cây sầu riêng, vi sinh vật ñối kháng nấm Phytophthora palmivora. - ðịa ñiểm nghiên cứu: Phòng. kháng nấm Phytophthora palmivora gây bệnh trên sầu riêng và ñộ an toàn của các vi sinh vật này, là cơ sở cho vi c sản xuất chế phấm sinh học phòng trừ bệnh Phytophthora palmivora trên sầu. ñối kháng của vi sinh vật ñối với nấm Phytophthora palmivora gây hại trên sầu riêng 3.3.1. Thu thập vi sinh vật có ích 3.3.2. Xác ñịnh khả năng ức chế nấm bệnh của các VSV có ích 3.4. Nghiên