BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG   ĐỖ TRUNG DŨNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ SÁN LÁ RUỘT NHỎ TRÊN NGƯỜI Ở MỘT SỐ TỈNH VÀ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ TẠI CỘNG ĐỒNG, NĂM 2010-2013 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Hà Nội, 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG ĐỖ TRUNG DŨNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ SÁN LÁ RUỘT NHỎ TRÊN NGƯỜI Ở MỘT SỐ TỈNH VÀ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ TẠI CỘNG ĐỒNG, NĂM 2010-2013 Chuyên ngành: Ký sinh trùng-Côn trùng Y học Mã số: 62 72 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Giáo viên hướng dẫn khoa học GS.TS Nguyễn Văn Đề PGS.TS Lê Thanh Hoà Hà Nội, 2014 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn GS.TS Nguyễn Văn Đề PGS.TS Lê Thanh Hoà, thầy giáo thực tâm huyết tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian truyền đạt kiến thức, trao đổi, định hướng, động viên giúp đỡ q trình thực luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Nguyễn Mạnh Hùng, nguyên Viện trưởng, TS Trần Thanh Dương, Viện trưởng; Ban Lãnh đạo Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương cán bộ, đồng nghiệp khoa, phịng Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Cơn trùng Trung ương tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn BS Nguyễn Thị Hợp, CN Nguyễn Thu Hiền, bạn đồng nghiệp Khoa Ký sinh trùng, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương, chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Thị Khuê cán Phòng Miễn dịch, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ thực cơng việc thu mẫu, thí nghiệm nghiên cứu hình thái học, sinh học phân tử cho nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS Jitra Waikagul, TS Urusa Thenkham tài trợ giúp đỡ tơi tiến hành thí nghiệm phịng thí nghiệm Bộ mơn Ký sinh trùng, khoa Y học nhiệt đới, trường Đại học Mahidol, Bangkok, Thái Lan Tôi xin chân thành cảm ơn tài trợ phần kinh phí để thực thẩm định sinh học phân tử, Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106.06-2012.05 “Nghiên cứu xác định loài đặc điểm phân tử ký sinh trùng gây bệnh động vật lây sang người thuộc họ Heterophyidae Echinostomatidae Việt Nam” PGS.TS Lê Thanh Hòa chủ nhiệm Xin chân thành cảm ơn Dự án “Ký sinh trùng có nguồn gốc Thuỷ sản Việt Nam - FIBOZOPA” phủ Đan Mạch tài ii trợ hỗ trợ phần kinh phí nghiên cứu đánh giá hiệu điều trị sán nhỏ cộng đồng Xin chân thành cảm ơn Hội đồng đào tạo sau đại học, TS Cao Bá Lợi, Phó trưởng Phịng Khoa học đào tạo, phụ trách đào tạo sau đại học cán Phòng Khoa học đào tạo, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương tạo điều kiện thuận lợi nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian nghiên cứu, học tập bảo vệ luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến lãnh đạo, cán y tế Trung tâm Phịng Chống Sốt rét-Ký sinh trùng-Cơn trùng/Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh cán y tế điểm nghiên cứu tạo điều kiện, hợp tác giúp đỡ tơi suốt q trình thu mẫu thực địa Tôi xin cảm ơn người bạn thân đồng nghiệp động viên, khuyến khích hỗ trợ tơi q trình học tập nghiên cứu Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến tới tồn thể gia đình, vợ tơi ln ln khuyến khích động viên, giúp đỡ chia sẻ khó khăn truyền nhiệt huyết giúp tơi hồn thành q trình học tập nghiên cứu Tác giả Đỗ Trung Dũng iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực Các số liệu, kết luận án hồn tồn trung thực, xác chưa cơng bố cơng trình khác Nếu có sai sót tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Tác giả Đỗ Trung Dũng iv MỤC LỤC Mục Nội dung Trang Lời cảm ơn i Lời cam đoan iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt ix Danh mục bảng x Danh mục hình xiii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm chung sán 1.1.1 Đặc điểm sinh học sán 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm phân loại hình thái học sán ruột nhỏ trưởng thành 1.1.4 Đặc điểm trứng sán ruột nhỏ họ Heterophyidae họ 10 Echinostomatidae 1.1.5 Đặc điểm ấu trùng sán họ ruột nhỏ họ Heterophyidae 11 họ Echinostomatidae 1.1.6 Đặc điểm chu kỳ phát triển (vòng đời) 12 1.1.7 Một số nghiên cứu số loài sán ruột nhỏ họ 16 Heterophyidae Echinostomatidae giới 1.1.8 Tình hình nghiên cứu số loài sán ruột nhỏ họ 20 Heterophyidae Echinostomatidae động vật người Việt Nam 1.2 Tổn thương giải phẫu bệnh, triệu chứng lâm sàng, chẩn đoán, điều trị phòng chống sán ruột nhỏ 23 v 1.2.1 Tổn thương giải phẫu bệnh 23 1.2.2 Triệu chứng lâm sàng 25 1.2.3 Chẩn đoán 26 1.2.4 Điều trị 28 1.2.5 Phòng bệnh 29 1.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng nghiên 29 cứu ký sinh trùng 1.3.1 Tầm quan trọng việc nghiên cứu giải mã hệ gen ty thể 30 loài sán ruột nhỏ thị phân tử hệ gen ti thể thường gặp 1.3.2 Đặc điểm sinh học phân tử hệ gen nhân thị phân tử 31 hệ gen nhân tế bào 1.3.3 Phương pháp nhân gen kỹ thuật Polymerase chain 33 reaction (PCR) 1.3.4 Một số ứng dụng phương pháp sinh học phân tử 34 nghiên cứu định loại, di truyền quần thể phả hệ ký sinh trùng CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 40 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 40 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 40 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 41 2.2 Phương pháp nghiên cứu 43 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 43 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 44 2.2.3 Quy trình thu thập mẫu sán trưởng thành 47 2.2.4 Nội dung nghiên cứu đặc điểm hình thái sán ruột nhỏ 48 trưởng thành vi 2.2.5 Nội dung ghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử 50 số loài sán nhỏ 2.2.6 Nội dung nghiên cứu đánh giá hiệu điều trị sán nhỏ 57 người cộng đồng 2.3 Y đức nghiên cứu 59 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 59 2.4.1 Xử lý số liều hình thái học 59 2.4.2 Xử lý số liệu sinh học phân tử 60 2.4.3 Phân tích số liệu nghiên cứu đánh giá hiệu điều trị sán 63 nhỏ cộng đồng CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 64 3.1 Kết điều tra xác định đối tượng nghiên cứu tỉnh 64 3.1.1 Kết điều tra cắt ngang đánh giá tình hình nhiễm giun 64 sán tỉnh 3.1.2 Kết thu thập mẫu sán ruột nhỏ trưởng thành 65 tỉnh 3.1.3 Đặc điểm hình thái học số loài sán ruột thu 68 nghiên cứu 3.2 Kết thẩm định phân tử loài sán nhỏ thu 77 3.2.1 Thu nhận chuỗi gen ty thể cox1 77 3.2.2 Thu nhận chuỗi gen nhân 28S 78 3.2.3 Kết thẩm định loài sán ruột nhỏ họ Heterophyidae 82 Echinostomatidae sử dụng thị gen ty thể cox1 3.2.4 Kết thẩm định loài sán ruột nhỏ họ Heterophyidae 88 Echinostomatidae sử dụng thị gen nhân 28S ribosome 3.2.5 Nghiên cứu gen cox1 Haplorchis taichui tỉnh 87 Hà Giang, Thanh Hoá Quảng Trị 3.3 Kết đánh giá hiệu điều trị sán nhỏ cộng đồng 97 vii CHƯƠNG BÀN LUẬN 106 4.1 Đặc điểm hình thái học số loài sán thu 106 4.1.1 Đặc điểm hình thái H taichui 106 4.1.2 Đặc điểm hình thái H pumilio 108 4.1.3 Đặc điểm hình thái S falcatus 109 4.1.4 Đặc điểm hình thái C formosanus 110 4.1.5 Đặc điểm hình thái Echinochasmus japonicus 111 4.2 Thẩm định loài sán ruột nhỏ trưởng thành họ 113 Heterophyidae Echinostomatidae phương pháp sinh học phân tử 4.2.1 So sánh trình tự nucleotide chuỗi gen cox1 thu nhận với 115 chuỗi gen tương ứng loài sán ruột nhỏ khác 4.2.2 Mối quan hệ phả hệ loài chủng sán ruột nhỏ 117 Việt Nam giới dựa trình tự gen cox1 4.2.3 So sánh trình tự nucleotide gen 28S chủng nghiên 119 cứu với chuỗi gen tương ứng loài sán khác 4.2.4 Mối quan hệ phả hệ chủng sán nghiên cứu dựa 120 phần trình tự gen 28S 4.2.5 Đặc điểm sinh học phân tử quần thể sán ruột nhỏ H 122 taichui Hà Giang, Thanh Hoá Quảng Trị 4.3 Hiệu điều trị sán nhỏ cộng đồng 126 4.3.1 Nhiễm phối hợp sán ruột nhỏ sán gan nhỏ người 126 Việt Nam 4.3.2 Chẩn đoán nhiễm sán gan nhỏ sán ruột nhỏ 129 4.3.3 Hiệu điều trị sán nhỏ cộng đồng sử dụng liều 131 Praziquantel 50mg/kg chia lần KẾT LUẬN 136 KIẾN NGHỊ 138 viii Những đóng góp luận án 139 Danh sách báo khoa học liên quan đến luận án công bố 140 Những hạn chế luận án 141 Tài liệu tham khảo 142 Phụ lục 163   158 129 Seo, B.S., Lee, S.H., Chai, J.Y., and Hong, S.J (1984a), Studies on intestinal trematodes in Korea XII Two cases of human infection by Stellantchasmus falcatus Korean J Parasitol, 22, pp 43-50 130 Seo, B.S., Lee, S.H., Chai, J.Y., and Hong, S.J (1985c), Studies on intestinal trematodes in Korea XX Four cases of natural human infection by Echinochasmus japonicus Korean J Parasitol, 23, pp 214-220 131 Seo, B.S., Park, Y.H., Chai, J.Y., Hong, S.J., and Lee, S.H (1984b) Studies on intestinal trematodes in Korea XIV Infection status of loaches with metacercariae of Echinostoma cinetorchis and their development in albino rats Korean J Parasitol, 22, pp 181-189 132 Simon, Y.W., Phillips, M.J., Cooper, A & Drummound, A.J (2005) Time dependency of molecular rate estimates and systematic overestimation of recent divergence time Molecular Biology and Evolution, 22, pp 1561 – 1568 133 Sithithaworn P, Sripa B, Kaewkes S, Haswell-Elkins MR (2009), Foodborne trematodes In: Cook GC, Zumla AI, eds Manson’s tropical diseases WB Saunders, 1461-1476 134 Sithithaworn P., Andrews R H., Nguyen V D., Wongsaroj T., Sinuon M (2012), The current status of opisthorchiasis and clonorchiasis in the Mekong Basin Parasitol Int, 61: 10–16 135 Skov, J., Kania, P.W., Dalsgaard, A., Jørgensen, T.R., Buchmann, K., (2009), Life cycle stages of heterophyid trematodes in Vietnamese freshwater fishes traced by molecular and morphometric methods Veterinary Parasitology 160, pp 66-75 136 Sohn, W.M., and Chai, Y.Y (2005), Infection status with helminthes in feral cats purchased from a market in Busan, Republic of Korea Korean J Parasitol, 43, pp 93-100   159 137 Somphou Sayasonea., Youthanavane Vonghajackc., Monely Vanmanyb., Oroth Rasphoned., Smarn Tesanae., Jürg Utzingera., Kongsap Akkhavong., Peter Odermatta (2009), Diversity of human intestinal helminthiasis in Lao PDR, Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 103, pp 247-254 138 Sripalwit, P., Wongsawad, C., Chai, J.Y., Anuntalabhochai, S., and Rojanapaibul, A (2003), Investigation of Stellantchasmus falcatus metacercariae in half-breaked fish, Dermogenus pusillus from four districts of Chiang mai Province, Thailand, Southeast asian J Trop Med Public Health, 34, pp 281-285 139 Tamura Koichiro., Daniel Peterson., Nicholas Peterson., Glen Stecher., Masatoshi Nei., Sudhir Kumar (2011), MEGA5: Molecular evolution- ary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods, Molecular Biology and Evolution, 28, pp 2731 – 2739 140 Tamura Koichiro., Glen Stecher., Daniel Peterson., Alan Filipski., and Sudhir Kumar (2013), MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0, Mol Biol Evol., 30(12), pp 2725–2729 141 Thaenkham U, Dekumyoy P, Komalamisra C, Sato M, Dung Do T, Waikagul J (2010), Systematics of the subfamily Haplorchiinae (Trematoda: Heterphyidae), based on nuclear ribosomal DNA genes and ITS2 region Parasitol Int, 59 (3), pp 460-465 142 Thaenkham U., Nawa Y., Blair D., Pakdee W (2011a), Confirmation of the paraphyletic relationship between families Opisthorchiidae and Heterophyidae using small and large subunit ribosomal DNA sequences Parasitol Int Dec 60(4), pp 521-523 143 Thaenkham U., Nuamtanong S., Sa-nguankiat S., Yoonuan T., Touch S., Manivong K., Vonghachack Y., Sato M., Waikagul J (2010), Monophyly of   160 Opisthorchis viverrini populations in the lower Mekong Basin, using mitochondrial DNA nad1 gene as the marker Parasitol Int., 59(2), pp 242247 144 Thaenkham U., Phuphisut O., Pakdee W., Homsuwan N., Sa-nguankiat S., Waikagul J., Nawa Y., Dung Do Trung (2011b), Rapid and simple identification of human pathogenic heterophyid intestinal fluke metacercariae by PCR-RFLP Parasitol Int 60(4), pp 503-506 145 Thaenkham U., Waikagul J (2008), Molecular phylogenetic relationship of Paragonimus pseudoheterotremus, Southeast Asian J Trop Med Public Health, Mar 39 (2), pp 217-221 146 Thaenkham Urusa, David Blair, Yukifumi Nawa, Jitra Waikagul (2012), Families Opisthorchiidae and Heterophyidae: Are they distinct?, Parasitology International, 61, 90–93 147 Thaenkhama Urusa., Kasidis Visetsuk., Do Trung Dung., Jitra Waikagul (2007), Discrimination of Opisthorchis viverrini from Haplorchis taichui using COI sequence marker, Acta Tropica, 103, pp 26–32 148 Tong-Soo Kim., Shin-Hyeong Cho., Sun Huh., Yoon Kong., Woon-Mok Sohn., Seung-Sik Hwang., Jong-Yil Chai., Soon-Hyung Lee., Yun-Kyu Park., Dae-Kyu Oh., and Jong-Koo Lee (2009), A Nationwide Survey on the Prevalence of Intestinal Parasitic Infections in the Republic of Korea, Korean J Parasitol, Vol 47, No 1, pp 37-47 149 Tran, T K Chi., Anders Dalsgaard., James, F Turnbull., Pham, A Tuan., and K, Darwin Murrell (2008), Prevalence of zoonotic trematodes in fish from a vietnamese fish-farming community, J Parasitol, 94(2), pp 423–428 150 Umadevi, K and Madhavi, R (2000), Observations on the morphology and life-cycle of Procerovum varium (Onji & Nishio, 1916) (Trematoda: Heterophyidae), Syst Parasitol, 46, pp.215-25   161 151 Umadevi, K and Madhavi, R (2006), The life cycle of Haplorchis pumilio (Trematoda: Heterophyidae) from the Indian region, Journal of Helminthology, 80, pp 327–332 152 Upatham ES, Viyanant V, Brockelman WY, Kurathong S, Lee P, et al (1988) Rate of re-infection by Opisthorchis viverrini in an endemic northeast Thai community after chemotherapy Int J Parasitol 18: 643–649 153 Vicente Y B J., Winifreda U D.L., Mary J.J.B P., Purnomo., Baird K.J., Michael J.B (2004), A focus of human infection by Haplorchis taichui (Trematoda: Heterophyidae) in the Southern Philippines, J Parasitol, 90 (5), pp 1165-1169 154 Waikagul J (1991), Intestinal fluke infections in Southeast Asia Southeast Asian J Trop Med Public Health, 22, Suppl, pp 158-62 155 Waikagul Jitra and Malinee Thairungroi, (1997), “Human worms in Southeast Asia”, Bangkok Thailand Press 156 Watthanakulpanich D., Waikagul J., Maipanich W., Nuamtanong S., Sanguankiat S., Pubampen S., Praevanit R., Mongkhonmu S., and Nawa Y (2010), Haplorchis taichui as a possible etiologic agent of irritable bowel syndrome-like symptoms Korean J Parasitol 48, pp 225–229 157 WHO (1994), Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasite, World Health Organization, Geneva 158 WHO (2004) Joint WHO/FAO workshop on food-borne trematode infections in Asia Geneva: World Health Organisation 159 WHO (2011) Report of the WHO expert consultation on foodborne trematode infections and taeniasis/cysticercosis Vientiane, Lao People’s Democratic Republic 12–16 October 2009 Geneva: World Health Organisation 160 WHO (1995), “Control of foodborne trematode infections” WHO Technical Report Series, 849, pp 1-157   162 161 WHO (2004), “Report of Joint WHO/FAO Workshop on Food-borne trematode infections in Asia, Ha Noi, Vietnam”, 26-28 November, 2002 World Health Organization, WPRO, pp 1-58 162 Wu, W., Qian, X., Huang, Y., Hong, Q (2012), A review of the control of Clonorchiasis sinensis and Taenia solium taeniasis/cysticercosis in China, Parasitol Res, 111, pp 1879–1884 163 Yatawara, L., Le, T.H., Wickramasinghe, S., Agatsuma, T (2008), Maxicircle (mitochondrial) genome sequence (partial) of Leishmania major: gene content, arrangement and composition compared with Leishmania tarentolae Gene 424(1-2), pp 80-86 164 Yu, S H and Mott, K E (1994), Epidemiology and morbidity of Foodborne Intestinal Trematode Infections, Trop Dis Bull, Vol 91, No 7, pp 125152 165 Yu, S.H., Xu, L.Q (2005), Intestinal trematode infections in China Foodborne Helminthiasis in Asia: Asian Parasitology, 1, pp 61–78 166 Zhang, S.L., and Fan, G.H (1990), Case report: brain abscess caused by heterophyid eggs Chin J Parasitol Parasitic Dis, 8, pp 178 163 PHỤ LỤC Phụ lục Dụng cụ hóa chất xét nghiệm: 1.1 Dụng cụ hóa chất sử dụng phương pháp nhuộm sán trưởng thành Phương pháp Semichon’s acetic carmine - Acetic acid 50ml - Distilled water 50ml - Bột carmine 5gram - Phương pháp pha dung dich nhuộm: Cho dung ding Axit acetic nước cất vào bình thủy tinh thót cổ, hịa tan nhiều bột carmine, dậy nút có nhiệt kế đo nhiệt độ, cho bình vào đun cách thủy đạt nhiệt độ 1000C 15 phút Lấy bình giảm nhiệt độ nơi thống mát, loại bỏ phần váng bề mặt lọc dung dinh qua lần gạc Dung dịch thu sau lọc dùng để nhuộm sán trưởng thành - Cồn nồng độ (70%, 80%, 90%, 95%, 100%) - Hộp petri có đường kính