I . Khái niệm Kỹ thuật tách dòng bao gồm việc phải cài một mảnh (chuỗi) DNA lạ vào một vector (plasmide hoặc phage λ ) bằng phương pháp hóa sinh. Sau đó, đưa phân tử lai này vào tế bào chủ đã lựa chọn bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp. Trường hợp muốn tạo dòng tổng hợp enzyme thì mảnh DNA định cài phải mã hóa cho gen cấu trúc của một enzyme nào đó. II-Nguyên liệu 1.1- DNA lạ cần tách dòng 1.2- Enzym 1.3- Vector chuyển gen 1.4- Hệ thống tế bào chủ 1- DNA cần tách dòng • Là đoạn DNA lạ, cần nghiên cứu 1- Enzym • 5 nhóm enzym: 1. Các enzym làm đứt gãy liên kết photphodieste (enzym giới hạn, enzym Mungbean nuclease) 2. Các enzym nối khung phân tử DNA(E. coli ligase, T4 DNA ligase, T4 RNA ligase) 3. Các enzym bổ sung hoặc loại nhóm phosphate 4. Các enzym tổng hợp mối liên kết phosphodieste mới trong phân tử DNA (DNA polymerase, Reverse transcriptase) 5. Các enzyme tham gia bảo vệ, phân giải, xoắn và giãn xoắn DNA (methylase) A-Enzym cắt giới hạn (RE) • Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự ADN nhất định và cắt ADN ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận. • VT: cắt DNA ở vị trí đặc trưng • RE cắt liên kết phosphodieste làm cho phân tử ADN bị đứt thành nhiều đoạn nhỏ • ADN của ký chủ không bị cắt bởi RE nhờ các vị trí cắt đã được methyl hóa (enzyme methylase gắn nhóm –CH3 vào base A hoặc C tại vị trí cắt) • Có hai kiểu cắt của enzym giới hạn là kiểu cắt tạo đầu bằng (blunt ends) và đầu sole (đầu dính - cobesive ends). • Enzym giới hạn cắt đầu bằng không tự nối các đoạn ADN lại với nhau( sd enzym nối ligase) • Enzym giới hạn cắt đầu sole tạo đầu dính. Sau khi cắt chúng có thể tự nối lại với nhau theo nguyên tắc bổ sung B-Các loại enzym khác ENZYM VAI TRÒ DNA polymerase Nối các nu với nhau theo NTBS -> mạch DNA Enzym phiên mã ngược TH mạch DNA bổ sung với mach khuôn RNA theo chiều 5’-3’ Enzym nối ligase Nối các đoạn acid nucleic với nhau bằng lk phosphodieste Enzym methylase Thay đổi tính đặc hiệu của một số enzym giới hạn 2- Vector tách dòng • Vector là một phân tử DNA thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và tự sao chép. Lựa chọn vector tách dòng Loại vector tách dòng Kích thước đoạn gen đích có thể cài Plasmid 1-5 kb Phage 15-25 kb Phagemid 20-10kb Cosmid 30-50 kb BAC (thiết kế từ một phần DNA E.colivà các plasmid) 100-300 kb TAC (thiết kế từ một phần đoạn vir gen của Ti plasmid) 100-300 kb BiBac (thiết kế từ một phần DNA bộ gen của Agrobacterium) 100-500 kb PAC (bộ gen của phage P1+plasmid) 100-300 kb YAC (thiết kế từ một phần DNA bộ gen của nấm men) 2000 2.1- Plasmid - Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2-5kb), dạng vòng, nằm ngoài nhiễm sắc thể, có ở vi khuẩn. • Ưu điểm  Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ  Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp  Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh • Nhược điểm  Đôi khi hiệu suất biến nạp vào TBVC thấp  Không hiệu quả khi biến nạp ở Eukaryote  Không tách dòng được các phân đoạn DNA có kích thước lớn (>10kb) [...]... plasmit không chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh, còn plasmit thứ 2 cho khuẩn lạc màu trắng -> chứng tỏ nó chứa DNA lạ được cài trong gen lacZ và chọn những khuẩn lạc màu trắng IV-Mục đích của sự tách dòng • Thiết lập ngân hàng bộ gen • Thiết lập ngân hàng cDNA • Sản xuất protein, enzyme • Sản xuất vaccine • Sản xuất kháng sinh 1- Ngân hàng gen (genomic library) - Là tập hợp các trình tự DNA tái tổ hợp... xảy ra với sự có mặt của enzyme DNA ligase của E Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai Quy trình tạo vector tái tổ hợp • B1: chuẩn bị nguyên liệu, gen tách dòng tinh sạch được nhân lên bằng PCR • B2: Nối gen cần tách dòng với vector bằng Pư nối gen với các thành phần Pư thích hợp • B3: Hỗn hợp các TP phản ứng được ủ qua đêm ở 16oC -> tiến hành điện di với thang DNA chuẩn kiểm tra KQ tạo vector... thường được dùng hơn do tính chính xác Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng một gen chưa biết, người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng khi dự đoán cấu trúc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA 2- Chọn vector • Chọn vector dựa vào kích thước và bản chất đoạn ADN • Yêu cầu của vector tách dòng:  Kích thước tương đối nhỏ so với NST của TB chủ  Có thể nhân đôi... xảy ra giữa DNA và DNA, RNA và DNA, RNA và RNA • Khái niệm đầu dò: các đầu dò là những mảnh DNA được đánh dấu , có khả năng nhận biết 1 chuỗi DNA hoặc RNA đồng đẳng qua lai hóa • Đặc điểm: là 1 đoạn axit nucleic (DNA , RNA) sợi đơn Đầu dò phải bổ sung các bazo nito, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận biết Đầu dò phải so mốc được, đó là các đầu đánh dấu phóng xạ • Các loại đầu dò: cDNA, mRNA,... đứt • Khi hạ nhiệt độ từ từ của khối DNA đã biến tính cùng với các điều kiện thích hợp khác, các mạch đơn bắt cặp trở lại.Sự bắt cặp chỉ xảy ra khi 2 trình tự DNA hoàn toàn bổ sung cho nhau Cách tiến hành • Chuẩn bị mẫu ( đầu ) dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc hóa chất • Biến tính dòng cần tìm ở dưới dạng 1 sợi bắng cách tăng nhiệt độ lên 80- 95oC • Hạ nhiệt độ từ từ, các sợi đơn tương... di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận  phải có nhân tố trung gian là virus  được thực hiện với vector chuyển gen có nguồn gốc là vius như phage, comid.thực khuẩn thể ) 5 Phát hiện dòng cần tìm Kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn Các dòng vi khuẩn mọc lên theo 3 khả năng  tế bào vi khuẩn không nhận plasmit tái tổ hợp  Tế bào nhận plasmit nhưng không có gen lạ  tế bào vi... nhân đôi độc lập trong TB chủ  Có vùng nhận biết enzym giới hạn  Có thể nhận biết bằng gen chỉ thị hoặc gen đánh dấu  Trình tự nu đã xác định  Phải thích hợp với tế bào vật chủ  Có vị trí gắn phân tử DNA ngoại lai (polycloning site) 3.Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp) Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép... phương pháp xác định dòng cần tìm Phương pháp lai axit nucleic Phương pháp sử dụng kháng thể Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn Phương pháp phát hiện do thay đổi kiếu hình Phương pháp lai axit nucleic Nguyên tắc • Dựa vào khả năng biến tính khi nhiệt độ tăng và hồi tính khi hạ nhiệt độ từ từ • Khi tăng nhiệt độ lên quá nhiệt độ sinh lý ( 80-95oC), 2 sợi đơn DNA sẽ tách dời nhau do liên... Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình Nguyên tắc • Dựa vào sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc, chứng tỏ rằng khuẩn lạc đó chứa gen lạ Cách tiến hành • Chuẩn bị 2 mẫu thử nghiệm mà plasmit tạo dòng có chứa gen lacZ , 1 mẫu để so sánh còn mẫu kia để cài DNA lạ vào gen lacZ • Nuôi cấy cả 2 mẫu trong môi trường có chất cảm ứng X-Gal (5-brom-4chloro3indolyl D- galactopynoside) chất cảm ứng này bị phân... kích thước 1501000kb 1.4- Hệ thống TB vật chủ • Mục đích: tạo DNA tái tổ hợp • Có thể sử dụng cả TB nhân sơ và nhân chuẩn làm TBVC • Yc: Dễ nuôi cấy để giữ và nhân giống, chấp nhận được nhiều loại vector Click icon to add picture Click to edit Master text styles VK E.coli Nấm men III- Quy trình 1 .Tách lập các DNA cần tạo dòng • Chọn và cắt DNA của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế (RE) • Khi sử . đoạn vir gen của Ti plasmid) 100-300 kb BiBac (thiết kế từ một phần DNA bộ gen của Agrobacterium) 100-500 kb PAC (bộ gen của phage P1+plasmid) 100-300 kb YAC (thiết kế từ một phần DNA bộ gen của. hợp muốn tạo dòng tổng hợp enzyme thì mảnh DNA định cài phải mã hóa cho gen cấu trúc của một enzyme nào đó. II-Nguyên liệu 1.1- DNA lạ cần tách dòng 1.2- Enzym 1.3- Vector chuyển gen 1.4- Hệ. biệt, để tạo dòng một gen chưa biết, người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng khi dự đoán cấu trúc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA 2- Chọn