Đang tải... (xem toàn văn)
Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM GVHD: BÙI HỒNG QUÂN LỚP: ĐHTP5 – NHÓM 5 SVTH: Lê Thị Mỹ Vân MSSV: 09078531 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011 1 BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH THỰC PHẨM MỤC LỤC Bài 1: Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm và các phương pháp tiệt trùng vi sinh vật 3 Bài 2: Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật 6 Bài 3: Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 10 Bài 4: phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học 16 Bài 5: Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật 19 Bài 6: Phương pháp phân lập vi sinh vật 20 Bài 10: Khảo sát đặc tính sinh hóa của vi sinh vật 23 Bài 13: Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp 35 Bài 14: Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 37 Bài 15: Định lượng Coliform bằng phương pháp MPN 39 Bài 19: Phương pháp định lượng E.coli trong thực phẩm 41 Bài 20: Phương pháp phân tích Salmonella spp. trong thực phẩm 43 Bài 21: Phương pháp phân tích định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm 46 Bài 22: Phương pháp phân tích định lượng Staphilococcus aureus trong thực phẩm 48 Bài 24: Phương pháp phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm 50 2 BÀI 1: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT Báo cáo thực tập 1. Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi ấy vi sinh vật? Yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật: - Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín - Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt - Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt. - Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ. Có thể dùng hộp nhôm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng. 2. Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật? Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật: a. Nồi hấp ướt (autoclave): Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao, được sử dụng để hấp khử trùng mô trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm. b. Kính hiển vi: Công dụng: dùng để nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về đặc điểm hình thái, sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của kính. c. Các dụng cụ thí nghiệm Dụng cụ thủy tinh có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bình định mức… - Phiến kính (lame): dùng làm tiêu bản quan sát hình thái, sinh lý tế bào vi sinh vật. - Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản cố định vi sinh vật trong qua trình nghiên cứu. - Đĩa petri: dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy và phân lập của tế bào vi sinh vật. - Que trãi: phân lập vi sinh vật theo phương pháp trãi đĩa. 3 - Que cấy: + Que cấy đầu tròn: dùng để thao tác vi sinh trên đối tượng đơn bào như vi khuẩn, nấm men. + Que cấy nhón: dùng để cấy sâu trên môi trường rắn. + Que cấy móc: dùng để lấy khuẩn ty hay một đoạn tơ nấm. - Micro pipette: sử dụng khi cần hút một lượng chính xác môi trường. 4.Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật? Phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật: a. Phương pháp lý học: Nhiệt khô: - Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tinh, phương pháp thường dùng là đốt trục tiếp trên ngọn lửa đèn cồn. - Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói và sấy ở 160 0 C trong 1-2 giờ hoặc 180 0 C trong 30 phút. Nhiệt ẩm: - Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vào mẫu vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật. Chỉ diệt tế bào sinh dưỡng, bào tử vẫn còn. - Phương pháp Pasteur: chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh, không diệt bào tử và vi khuẩn hoại sinh. Phương pháp này thường dùng ở nhiệt độ 70-75 0 C trong thời gian 10-15 phút. - Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70-80 0 C, mỗi lần 30-60 phút và liên tiếp trong ba ngày liền. - Phương pháp hơi nước bão hòa ở áp suất cao: dùng autoclave. Thường dùng ở nhiệt độ 121 0 C trong 15-30 phút. Diệt trùng bức xạ: - Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật. - Tia âm cực dùng trong tiệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Vật khử trùng phải bao gói kính. Diệt trung bằng cách lọc: 4 - Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose,… có kích thước lỗ lọc từ 0,2-0,45μm, thường dùng để lọc những vật phẩm lỏng không khử trùng bằng nhiệt được. - Đối với khử trùng không khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn. b. Phương pháp hóa học. - Chỉ sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu. - Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor… 5 BÀI 2: CÁCH PHA CHẾ CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG I. TRẢ LỜI CÂU HỎI 1. Trình bày khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật • Khái niệm môi trường dinh dưỡng Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất này có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pH trong môi trường. trong đó các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào. • Phân loại môi trường dinh dưỡng o Theo nguồn gốc Môi trường tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như: trứng, sữa, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám. Môi trường tổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác. Ví dụ như: Czapeck, Hansen, EMB Môi trường bán tổng hợp: chứa cả các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên, ví dụ như: PGA, giá đậu đường o Theo trạng thái vật lý Môi trường lỏng: thành phần môi trường này không chứa agar và thường được sử dụng để nghiên cứu quá trình tổng hợp của vi sinh vật. Môi trường đặc: cứ 1000ml môi trường có 15 – 20 Agar Môi trường bán lỏng: chứa khoảng 0,3 – 0,7% agar o Theo công dụng 6 Môi trường phân lập Môi trường tăng sinh Môi trường nuôi giữ giống: nghèo dinh dưỡng Môi trường thử nghiệm sinh hóa 2. Trình bày qui trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật Bao gồm các bước sau: • Chuẩn bị dụng cụ • Cân hóa chất • Phối chế tạo môi trường nuôi cấy • Điều chỉnh độ pH của môi trường • Phân phối môi trường vào dụng cụ • Khử trùng môi trường • Làm thạch nghiên, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri • Kiển tra độ vô trùng và bảo quản 3. Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch đứng • Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường và môi trường chưa đông đặc. - Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng và không được để môi trường chạm vào nút bông. - Để yên cho đến khi môi trường đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải thẳng, nhẵn và liên tục • Làm thạch đứng: - Đặt các ống nghiệm có môi trường là thạch đứng vào giá, để yên cho môi trường đông đặc • Đổ môi trường vào đĩa petri: - Toàn bộ quá trình đổ thạch vào đĩa petri được thực hiện trong tủ cấy vô trùng và gồm các thao tác sau: o Mở bao giấy gói các đĩa petri o Một tay cầm dụng cụ chứa môi trường 7 o Tay còn lại mở nút bông và hơ miệng bình trên ngọn lửa đền cồn. o Mở hé nắp đĩa petri. Nghiêng bình và rót môi trường vào đĩa petri. o Đậy nắp đĩa lại, xoay tròn đĩa để môi trường được phân phối đều bên trong đĩa. o Để yên cho môi trường đông đặc. o Lật ngược đĩa lại và bảo quản. 4. Giải thích tại sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng Vì sẽ làm nhiễm các vi sinh vật không mong muốn, có thể nhiễm một số tạp chất vì vậy sau quá trình nuôi cấy khó có thể xác định được kết quả. Có thể tránh được hơi nước tiếp xúc vào môi trường nuôi cấy và vì sau khi cấy phải để yên môi trường để cứng môi trường 5. Đĩa petri chứa môi trường trước khi cấy vi sinh vật nên úp hay ngửa? Tại sao? Nên để ngửa bởi vì làm kín khu vực nuôi cấy, tránh lây nhiễm các vi sinh vật khác và cũng tránh tiếp xúc với hơi nước. 6. Ý nghĩa của việc pha chế môi trường? Chúng ta phải pha chế môi trường cho vi sinh vật vì môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa- khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường để vi sinh vật có thể sinh trưởng và phát triển một cách tối ưu nhất có thể. Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng 7. Yêu cầu của một môi trường dinh dưỡng nuôi cấy? Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: có đủ chất dinh dưỡng cần thiết, có độ pH phù hợp. có độ nhớt nhất định, không chứa các yếu tố độc hại, hoàn toàn vô trùng, đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật. 8. Nêu ý nghĩa của các thành phần trong môi trường nuôi cấy? 8 Peptone chiết xuất cao thịt bò dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ. Cao thịt bò chứa các axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất khoáng. Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm B cũng như nguồn nitơ và cacbon. 9. Có bao nhiêu loại peptone? Có 3 loại peptone o Từ động vật: chiết xuất từ thịt, cao thịt bò, dịch thuỷ phân một phần của thịt bò, cazêin,… dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ. Cao thịt bò chứa các axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất khoáng. o Từ thực vật: chiết xuất từ đậu nành,…. o Nấm men: cao nấm men, Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm B cũng như nguồn nitơ và cacbon). 10. Cơ chế làm trong nước của lòng trắng trứng Cách làm trong nước bằng lòng trắng trứng: lòng trắng trứng: nước tỉ lệ 1:1→ đánh tan nổi bọt → cho vào 1 lít môi trường → đun sôi khoảng 5 phút → để nguội → lắng cặn →lọc. Cơ chế: các protein trong lòng trắng trứng như albumin, ovalbumin dưới tác động của sự khuấy trộn và gia nhiệt bị biến tính không thuận nghịch, các liên kết trong protein được kéo dãn làm lộ ra nhiều nhóm chức → hình thành lực hút tĩnh điện với các ion, bụi bẩn có trong nước → sau khi lắng, lọc nước trong hơn. 9 BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT PHÂN LẬP SINH VẬT I. Nguyên tắc 1. Mục đích của việc nuôi cấy - Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu. - Tiến hành việc phân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng. - Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết. - Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển từng loại của vi sinh vật. 2. Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài. Môi trường và dụng cụ nuôi cấy đều phải khử trùng triệt để. Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển thuận lợi. II. Dụng cụ, môi trường và hóa chất III. Tiến hành thí nghiệm 1. Phương pháp cấy truyền thạch (môi trường thạch). 1.1. Cấy truyền trên thạch đĩa Có thể cấy trên đĩa pêtri theo 1 trong 2 cách sau: * Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau: - Để đĩa pêtri lên bàn. - Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở phương pháp chung. - Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào. - Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một trong các kiểu sau: + Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch (hình 3.3a) + Theo những đường song song (hình 3.3b) + Theo 4 hình chữ chi 4 góc (hình 3.3c) Hình 3.1 Các kiểu cấy trên thạch đĩa 10 [...]... VI SINH VẬT Báo cáo thực tập 1 Sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm có màu đỏ vàng hay đỏ tía Giải thích nguyên nhân? Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ có màu xanh đen hay tím, còn vi khuẩn Gram âm có màu đỏ vang (nhuộm safranin O) hay đỏ tía (Fuchsin Ziehl) Sở dĩ có màu như vậy là do vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm có sự khác biệt về thành phần hóa sinh. .. được chủng vi sinh vật thuần khiết 20 BÀI 10: CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA 1 Phản ứng tạo indol Mục đích: Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol các VSV có hệ emzym tryptophanase Sơ đồ: Chủng Vi Sinh Vật Môi Trường: NB và Tripton Thuốc thử Kovac’s 37oC 24h 21 Kết quả, dương tính (màu hồng) và âm tính (màu vàng) 37oC / 24h Âm tính Chủng Vi Sinh Vật Môi Trường Dương tính Âm tính Cơ chế phép thử: Vi sinh vật... trong 5 ô lớn 2 Phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách đếm trực tiếp thường áp dụng cho những đối tượng vi sinh vật nào? Giải thích Đối tượng: những vi sinh vật có kích thước lớn nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc dễ quan sát trên kính hiển vi Do quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính x40, nghĩa là độ phóng đại lên 400 lần nên chỉ có thể đếm được những vi sinh vật có kích thước lớn Mẫu Đồng nhất... TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC Nguyên tắc Tổng số vi khuẩn hiếu khí là tổng số những vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí tồn tại trong môi trường Tổng số các nhóm vi khuẩn này trong thực phẩm có thể xác định bằng phương pháp nuôi cấy trải lên bề mặt thạch hoặc bằng phương pháp tạo hộp đổ Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa peptri cho phép xác định được lượng vi sinh. .. nguồn cacbon khác nhau và có khả năng sinh H2S, khả năng sinh hơi Thường được dùng để định danh các vi khuẩn gram (-), vi sinh đường ruột 6 Phản ứng LDC Mục đích: dùng để định danh các loài vi khuẩn có khả năng sinh enzyme Lysine decarboxylase, thường dùng để định danh salmonella… Cơ chế: Trong môi trường có NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2-COOH, trong môi trường có vi sinh vật có khả năng tiết enzyme Lysine... test Cơ chế: một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzym coagulase, enzyme này có khả năng làm đông huyết tương người hoặc thỏ Khi cấy vi sinh vật vò môi trường, nếu vi sinh vật có khả năng tiết enzyme coagulase, enzyme coagulase có khả năng phân cắt fibrinogen tạo thành fibrin và prothromibis, tạo thành cách khối đông Môi trường: Huyết tương người hay thỏ đông khô dạng thương phẩm Cách đọc kết quả:... trong 24h => nhỏ thuốc thử Cress A và Cress B=> đọc kết quả 32 BÀI 13: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP Báo cáo thực tập 1 Nguyên tắc và cách tiến hành của phương pháp định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp a Nguyên tắc Dựa trên sự quan sát và đếm trực tiếp số lượng tế bào VSV bằng kính hiển vi và buồng đếm Phương pháp này dùng để xác định số lượng các loại VSV đơn bào...Hình 3.2: Cách dàn vi sinh vật lên bề mặt môi trường A – que gạt B – dàn bằng que gạt; C: Sự sinh trưởng của VSV sau khi dàn đều bằng que gạt; D : Sự sinh trưởng của VSV sau khi dàn bằng que cấy 1.2 - Phương pháp cấy trên thạch nghiêng Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên Thực hiện vi c cấy giống vào... thạch đứng: cấy sinh vật kị khí Sử dụng que cấy hình kim Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát thành ống tuỳ yêu cầu • Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường IV Trả lời câu hỏi 1 Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật 11 - Cấy truyên vi sinh vật trên môi... như táo, lê hoặc trong rượu nếp, bia, nước mía 5 So sánh sự giống và khác nhau của cách phân lập vi sinh vật hiếu khí và kị khí Trả lời: - Giống nhau: nhằm phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên và cô lập chúng nhằm chọn lựa những giống vi sinh vật thuần khiết.Khác nhau: Phân lập vi sinh vật hiếu khí - Hút dịch mẫu đã pha loãng cho vao dĩa petri có môi trường thích hợp - Dùng que . 2011 1 BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH THỰC PHẨM MỤC LỤC Bài 1: Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm và các phương pháp tiệt trùng vi sinh vật 3 Bài 2: Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật. trong thực phẩm 48 Bài 24: Phương pháp phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm 50 2 BÀI 1: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT Báo cáo. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 10 Bài 4: phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học 16 Bài 5: Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật 19 Bài 6: Phương pháp phân lập vi sinh vật 20 Bài