BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN ANH HƯNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP Ở LỢN TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN ANH HƯNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP Ở LỢN TẠI VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà NGÀNH : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS. NGUYỄN BÁ HIÊN HÀ NỘI – 2014 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 23 tháng 01 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Anh Hưng Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện bản luận văn này, ngoài sự nỗ lực cố gắng hết mình của bản thân còn có sự tận tình hướng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Bá Hiên. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến thầy hướng dẫn, người ñã giành nhiều thời gian quý báu tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tới: - Ban giám ñốc, tâp thể phòng virus Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc thú y Trung ương 1. - Tập thể phòng Hóa sinh - Miễn dịch - Bệnh lý Viện Thú Y Quốc gia. - Khoa Thú Y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. ðã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia ñình,người thân, bạn bè và ñồng nghiệp - Những người luôn tạo ñiều kiện, ñộng viên, giúp ñỡ tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Hà nội, ngày 23 tháng 01 năm 2014 Học viên Nguyễn Anh Hưng Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv MỤC LỤC Lời cam ñoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục các chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix MỞ ðẦU 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Bệnh LMLM và tình hình bệnh LMLM trên thế giới 3 1.1.1 Bệnh lở mồm long móng 3 1.1.2 Dịch tễ học phân tử của virus LMLM 8 1.1.3 Tình hình bệnh LMLM trên thế giới 10 1.2 Tình hình và nghiên cứu bệnh LMLM ở Việt Nam 13 1.2.1 Tình hình bệnh LMLM ở Việt Nam 13 1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM ở Việt Nam 14 1.3 Một số ñặc tính của virus LMLM 15 1.3.1 ðặc tính nuôi cấy 15 1.3.2 Gây bệnh thực nghiệm: 17 1.4 ðặc ñiểm dịch tễ học bệnh LMLM 20 1.4.1 Lứa tuổi mắc bệnh 20 1.4.2 Mùa vụ 20 1.4.3 Khả năng lây lan 20 1.4.4 Tỉ lệ ốm và chết 20 1.4.5 ðường truyền lây 21 1.5 Triệu chứng và bệnh tích bệnh LMLM 21 1.5.1 Triệu chứng 21 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 1.5.2 Bệnh tích 22 1.6 Chẩn ñoán bệnh LMLM 23 1.6.1 Chẩn ñoán lâm sàng 23 1.6.2 Chẩn ñoán phòng thí nghiệm 24 1.7 Phòng bệnh LMLM 28 1.7.1 Phòng bệnh khi chưa có dịch xảy ra 28 1.7.2 Phòng bệnh khi có dịch xảy ra 28 PHẦN II: ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 ðối tượng nghiên cứu: 30 2.2 Nội dung nghiên cứu: 30 2.3 Nguyên liệu 30 2.3.1 Chủng vi sinh vật, ñộng vật thí nghiệm 30 2.3.2 Tế bào dòng BHK-21 30 2.3.3 Máy, thiết bị 30 2.3.4 Các vật liệu và hóa chất 31 2.4 Phương pháp nghiên cứu 31 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 31 2.4.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm virus gây bệnh LMLM 32 2.4.3 Chuẩn ñộ virus LMLM trên tế bào BHK-21 33 2.4.4 Gây nhiễm ñộng vật thí nghiệm 35 2.4.5 Phương pháp phát hiện kháng thể LMLM trên lợn bằng ELISA FMDV NSP ELISA. 36 2.4.6 Phương pháp RT-PCR 38 2.4.7 Phương pháp phân tích số liệu 39 2.4.8 Thời gian, ñịa ñiểm 39 PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi 3.1 Nguồn gốc chủng virus lở mồm long móng 40 3.2 Thích nghi chủng virus LMLM type O phân lập trên tế bào BHK-21 41 3.3 ðặc tính gây bệnh của virus LMLM type O chủng VP02 phân lập cho ñộng vật thí nghiệm 43 3.3.1 Chuẩn bị ñộng vật thí nghiệm: 43 3.3.2 Xác ñịnh liều gây nhiễm virus LMLM type O chủng VP02 cho lợn 45 3.3.3 Gây nhiễm ñộng vật thí nghiệm bằng chủng virus LMLM type O chủng VP02 45 3.3.4 Kết quả gây nhiễm ñộng vật thí nghiệm bằng chủng virus LMLM type O chủng VP02 46 3.4 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM trên lợn 55 3.4.1 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM trên lợn bằng phương pháp phân lập trên tế bào BHK-21 55 3.4.2 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM type O chủng VP02 trên lợn bằng phương pháp RT-PCR 56 4 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 60 4.1 Kết luận 60 4.2 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deroxyribonucleic ARN : Acid Ribonucleotit BHK-21 : Baby Hamster Kidney-21 cDNA : Complementary AND CPE : Cytopathogen Effect DMEM : Dulbecco Modified Eagle Medium DPI : Days Post-Inoculation ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetate FAO : Food and Agricultural Organization FCS : Fetal Calf Serum FMD : Foot and Mouth Disease FMDV : Foot and Mouth Disease Virus ID 50 : 50% Infective Dose LMLM : Lở mồm long móng OIE : Office International des Epizooties DPE : Days Post Exposure PBS : Phosphate Buffered Saline PD 50 : 50% Protective Dose PID 50 : 50% Pig Infective Dose PFU : Plaque Forming Units P : Trọng lượng RT-PCR : Reverse Trancription-Polymerase Chain Reaction TCID 50 : 50% Tissue Culture Infectious Dose WRL : World Reference Laboratory Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Triệu chứng lâm sàng và ñáp ứng miễn dịch của chuột lang sau khi gây nhiễm bằng ñường dưới da với các liều khác nhau. 18 3.1 Biến ñộng TCID 50 của virus LMLM type O chủng VP02 qua 10 lần tiếp truyền liên tục 42 3.2 Kiểm tra kháng thể LMLM của lợn trước thí nghiệm 44 3.3 Bố trí gây nhiễm cho lợn bằng chủng virus LMLM type O chủng VP02 46 3.4 Kết quả gây nhiễm virus LMLM type O chủng VP02 cho lợn 47 3.5 Biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở lợn sau khi gây bệnh LMLM 48 3.6 Bệnh tích ở lợn sau khi gây nhiễm chủng virut LMLM type O chủng VP02 51 3.7 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM trong các loại mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp phân lập virus trên tế bào BHK-21 55 3.8 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM trong các mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp RT-PCR 57 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Bản ñồ bộ gene của vi rút LMLM 4 1.2 Mô hình cấu trúc của hạt virion LMLM 5 1.3 Bản ñồ phân bố các chủng virus LMLM từ năm 2010-2013 13 1.4 ðiểm bệnh tích của lợn thí nghiệm sau ngày gây nhiễm và phơi nhiễm 19 3.1 Phả hệ gene VP1 virus LMLM chủng phân lập tại Việt Nam. 41 3.2 Diễn biến hiệu giá virus LMLM VP02 qua các lần tiếp truyền trên tế bào BHK21 42 3.3 Hình thái tế bào sau 10 lần tiếp truyền 43 3.4 Biến ñổi lâm sàng và bệnh tích ở chân lợn 49 3.5 Hình ảnh bệnh tích sau khi gây nhiễm 52 3.6 Bệnh tích ở niêm mạc miệng 52 3.7 Bệnh tích hình thành ở lưỡi (loét và hoại tử) 53 3.8 Bệnh tích hình thành ở lách và màng treo ruột 53 3.9 Diễn biến nhiệt ñộ của lợn trong thời gian gây bệnh thực nghiệm 54 3.10 Bệnh tích tế bào BHK-21 gây nhiễm 56 3.11 Kiểm tra sự có mặt của FMDV trong bệnh phẩm, huyết thanh bằng phương pháp RT-PCR 58 [...]... các type là nh ng bi n ch ng virus g i là phân type và hi n nay ñã phát hi n hơn 70 phân type virus Trong s 7 type LMLM, type A là type có tính bi n ñ i kháng nguyên l n nh t D a v o phân tích cây phát sinh ch ng lo i c a trình t gen VP1, type A ñư c chia thành 10 genotype chính (I-X) Tương t type O ñư c chia thành 10 genotype, ký hi u Europe-South America (Euro-SA), Middle East-South Asia (ME-SA), Southeast... t n t i r t nhi u phân type (subtype) C th có ít nh t 3 topotype là Southest Asia (SEA), Cathay, PanAsia thu c serotype O, 2 phân type là nhóm 4 (group IV) và nhóm 5 (group V) thu c serotype Asia 1, và 1 phân type là nhóm 9 (genotype IX) thu c serotype A Như v y có th th y virus LMLM Vi t Nam r t ña d ng và có ít nh t 6 phân type c a virus LMLM ñang lưu hành và gây b nh t i Vi t Nam (Le et al., 2011),... chúng tôi ti n hành nghiên c u ñ tài: Nghiên c u m t s ñ c tính sinh h c c a virus l m m long móng type O phân l p l n t i Vi t Nam 2 M c tiêu c a ñ tài: Xác ñ nh kh năng gây b nh c a ch ng virus LMLM type O phân l p th c ñ a 3 Ý nghĩa khoa h c ng d ng trong ki m nghi m văc xin l m m long móng và ñ nh hư ng nghiên c u khoa h c Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p... a virus LMLM Năm 2006, nư c ta xác ñ nh có 3 type virus LMLM: O, A, Asia1 (Tô Long Thành và c ng s , 2006) Các d ch LMLM do serotype O gây ra t 2005- 2007 ch y u là do: Virus LMLM serotype O_ Cathay ch gây b nh trên l n; Virus LMLM serotype O_ SEA-May98 gây b nh cho c trâu, bò và l n Giai o n 20082012 h u h t các d ch LMLM x y ra do type O Cu i năm 2008 type A xu t hi n t i t nh Ngh An Năm 2012, k t... do văc xin LMLM t o nên (H ðình Chúc và c ng s , 2003) K thuât RT-PCR ñã ñư c áp d ng trong ch n o n, ñ nh type virus LMLM Năm 2004, Tô Long Thành và c ng s ñã phân l p thành công virus LMLM trên t b o BHK-21 S d ng k thu t RT- PCR v i c p m i chung 1F/1R ñ c hi u cho 7 type c a virus LMLM gây b nh LMLM và c p m i P33/P38 ñ c hi u cho type O ñã ñư c xác ñ nh virus LMLM phân l p ñư c là virus LMLM type. .. c a virus LMLM luôn luôn bi n ñ i, ngay c trong cùng m t serotype, các ch ng phân l p các vùng ñ a lý khác nhau có m c ñ tương ñ ng v thành ph n nucleotid và acid amin cũng khác nhau, do v y chúng hình thành nên nhi u topotyp khác nhau 1.1.1.3 Cơ s phân lo i virus LMLM Virus LMLM ngoài 7 type (A, Asia1, C, O, SAT1, SAT2 và SAT3) cơ b n, còn có hơn 70 subtype M t s subtype v m t d ch t h c hoàn toàn... i B nh LMLM do virus thu c h Picornaviridae gây ra, có hư ng thư ng bì, g m 7 serotype: O, A, C, Asia 1, SAT1, SAT2 và SAT3 Trong m i serotype còn có nhi u phân type (subtype) do virus thư ng ñ t bi n xu t hi n ch ng m i, hi n nay ngư i ta ñã xác ñ nh ñư c hơn 70 subtype c a virus LMLM Các serotype và subtype gây b nh có tri u ch ng lâm sàng gi ng nhau nhưng không có ñáp ng mi n d ch ch o, văc xin phòng... (EA-3), Indonesia-1 (ISA1), và Indonesia-2 (ISA-2) Type Asia 1 ñư c chia thành 6 genotypes (I–VI) Nh ng nghiên c u g n ñây cho th y có ñ ng th i c 3 serotype O, A, và Asia 1 c a virus LMLM ñang lưu hành và gây b nh trên ñàn gia súc c a Vi t nam Trong 3 serotype O, A, và Asia 1 c a virus LMLM phân l p ñư c t i Vi t Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 9 Nam l i t... t b o này ñ t m 370C trong 24, 48, 72 gi trong ñi u ki n có 5% CO2, virus s làm hu ho i t b o nuôi (Nguy n Như Thanh và c ng s , 2001) Loeffer và Frosch ñã nghiên c u v ñ c tính nuôi c y virus ngay t khi phát hi n ra virus LMLM Nhi u tác gi ñã nuôi c y virus LMLM trên da c a thai l n, thai bò còn s ng ho c tiêm virus LMLM v o phúc xoang chu t nh t con, tính kháng nguyên c a virus này không thay ñ i,... Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 1 m m long móng Hai là s xu t hi n c a serotype m i v i ñ c tính cao Tuy nhiên, Vi t Nam chưa t s n xu t văc xin LMLM, các văc xin hi n dùng ñ u ñư c nh p t nư c ngoài Do v y vi c nghiên c u xác ñ nh kh năng gây b nh, ñ c tính gây b nh c a virus l m m long móng t i các d ch Vi t Nam ñ ñưa ra phương th c phòng thích h p là m t yêu c u c p thi t trong tình hình th . GI O DỤC VÀ ð O T O TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN ANH HƯNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP Ở LỢN TẠI VIỆT NAM. BỘ GI O DỤC VÀ ð O T O TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN ANH HƯNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP Ở LỢN TẠI VIỆT NAM . Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học của virus lở mồm long móng type O phân lập ở lợn tại Việt Nam 2. Mục tiêu của ñề tài: Xác ñịnh khả năng gây bệnh của chủng virus LMLM type O phân lập thực