LỜI CẢM ƠN Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Sinh lý Thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh. Để hoàn thành luận văn này, em xin chân thành tỏ lòng biết ơn đến: Cố GS. TS Mai Trần Ngọc Tiếng, người Thầy đã sáng lập nên Bộ môn Sinh lý Thực Vật và tạo điều kiện cho em có cơ hội được học và thực tập về chuyên ngành này. PGS.TS. Bùi Trang Việt, người Thầy đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức và cả những kinh nghiệm quý. Thầy đã tạo điều kiện tốt cho em làm quen với môi trường mới và gợi mở nhiều vấn đề trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tại Bộ môn. TS. Nguyễn Du Sanh, trưởng khoa Sinh học đã nhận em vào chuyên ngành này và tận tình giảng dạy, góp ý cho em trong học tập. PGS. TS. Võ Thị Bạch Mai, PGS. TS. Bùi Văn Lệ, PGS. TS Nguyễn Minh Châu, PGS. TS Dương Tấn Nhựt, TS. Nguyễn Thị Quỳnh, TS. Nguyễn Hữu Hổ và TS. Lê Thị Thủy Tiên đã tận tình giảng dạy, góp ý cho em trong học tập. Th.S Phan Ngô Hoang, Thầy đã tận tình góp ý, giúp đỡ em những lúc khó khăn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Em xin chân thành cảm ơn: Th.S Trần Thanh Hương, Th.S Trịnh Cẩm Tú, Th.S Trần Thị Thanh Hiền, Cô Lê Thị Thanh Xuân, Th.S Đỗ Thường Kiệt đã luôn chỉ dẫn và động viên em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Các anh chị và các bạn cao học khóa 16, 17, 18, 19, các em sinh viên khóa 2005, 2006, 2007, em Hiệp, chị Huyền đã giúp đ ỡ và chia sẻ cùng Bình trong thời gian qua. Con xin vô cùng biết ơn Ba, Mẹ đã sinh thành, nuôi dư ỡng và tạo mọi điều kiện cho con có cơ hội được tiếp tục học tập. Xin cảm ơn anh Hai, gia đình Má cùng tất cả những người thân đã quan tâm và giúp đỡ con trong thời gian qua. TP. Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2011. Nguyễn Thị Duy Bình 1 MỞ ĐẦU Nghệ đen Curcuma zedoaria Rosc. (Zingiberaceae) là loài cây thân thảo lâu năm, có thân rễ (củ) được tìm thấy ở nhiều nước thuộc vùng nhiệt đới như Việt Nam, Ấn Độ và Thái Lan. - Tìm hiểu tăng trưởng thân rễ, tích lũy tinh dầu và liên hệ giữa tăng trưởng và tích lũy tinh dầu ở thân rễ. Trong y học cổ truyền, củ Nghệ đen được dùng để trị bệnh xanh xao, thiếu máu, viêm loét dạ dày,… Thành phần quan trọng của củ Nghệ đen là tinh dầu có tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, diệt côn trùng và chống oxi hóa, ngoài ra còn dùng để làm gia vị, nước hoa,… Hiện nay, nhiều nghiên cứu về loài cây này như tạo củ in vitro (Anisuzzaman và cs, 2008), phân tích thành phần hóa học và tính kháng oxi hóa của tinh dầu Nghệ đen (Trần Thị Việt Hoa và cs, 2007), nuôi cấy dịch treo tế bào (Nguyễn Hoàng Lộc và cs, 2009), đã được thực hiện. Nhằm làm tăng sự tích lũy tinh dầu trong sự phát triển củ, đề tài: “Tìm hiểu sự tăng trưởng và tích lũy tinh dầu trong thân rễ của cây Nghệ đen Curcuma zedoaria Rosc.” được thực hiện nhằm mục đích: - Áp dụng chất điều hòa tăng trưởng thực vật vào thời điểm thích hợp để làm tăng sự tích lũy tinh dầu trong thân rễ. MỤC LỤC Trang CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC ẢNH v MỞ ĐẦU 1 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1 NGHỆ ĐEN 2 1.1.1 Phân loại 2 1.1.2 Đặc điểm sinh học 2 1.1.3 Phân bố 3 1.1.4 Tác dụng dược lý 3 1.1.5 Thành phần hóa học 4 1.1.6 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về Nghệ đen 4 1.2 CỦ 6 1.2.1 Sự hình thành củ 7 1.2.2 Các giai đoạn của quá trình tạo củ 7 1.2.3 Hình thái ngoài của củ 8 1.2.4 Các biến đổi cấu trúc giải phẫu trong quá trình tăng tr ưởng củ ở cây đơn tử diệp 9 1.3 TINH DẦU 10 1.3.1 Định nghĩa 10 1.3.2 Cơ quan tích lũy 10 1.3.3 Thành phần hóa học và tổng hợp tinh dầu 11 1.3.4 Hoạt tính sinh hoc của tinh dầu đối với cây 14 1.3.5 Sự dùng tinh dầu trong nông nghiệp và y dược 14 1.4 Ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật đến sự tăng trưởng củ và tích lũy hợp chất thứ cấp 16 1.4.1 Auxin 16 1.4.2 Gibberellin 17 1.4.3 Acid abscisic 17 1.4.4 Cytokinin 18 1.4.5 Acid jasmonic 19 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 2.1 VẬT LIỆU 20 2.1.1 Vật liệu dùng để phân tích và xử lý. 20 2.1.2 Vật liệu dùng trong nuôi cấy 20 2.1.3 Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm 20 2.2 PHƯƠNG PHÁP 21 2.2.1 Quan sát cấu trúc giải phẫu 21 2.2.2 Theo dõi sự tích lũy tinh dầu ở củ Nghệ đen trong vườn 21 2.2.3 Xác định trọng lượng khô 21 2.2.4 Đo cường độ hô hấp 22 2.2.5 Xác định lượng tinh bột 22 2.2.6 Ly trích và đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 23 2.2.7 Tạo cây in vitro 25 2.2.8 Xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên cây in vitro 26 2.2.9 Xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên cây Nghệ đen trong vườn. 26 2.2.10 Xử lý số liệu 27 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 KẾT QUẢ 28 3.1.1 Sự tăng trưởng, cấu trúc giải phẫu và tích lũy tinh dầu của củ cây Nghệ đen trong vườn 28  Sự tăng trưởng của củ cây Nghệ đen trong vườn 28  Cấu trúc giải phẫu của cây Nghệ đen 29  Sự tích lũy tinh dầu của củ Nghệ đen trong vườn 29 3.1.2 Sự thay đổi trọng lượng khô, cường độ hô hấp, hàm lượng tinh bột và hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật của củ Nghệ đen cấp một trong vườn. 36  Sự thay đổi trọng lượng khô, cường độ hô hấp và hàm lượng tinh bột của củ Nghệ đen cấp một trong vườn. 36  Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng tr ưởng thực vật của củ Nghệ đen cấp một trong vườn. 38 3.1.3 Sự nuôi cấy in vitro và quan sát hoạt động của mô phân sinh dày cấp một 41  Sự nuôi cấy in vitro 41  Quan sát hoạt động của mô phân sinh dày cấp một 41 3.1.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng tr ưởng thực vật lên sự gia tăng đường kính thân và hoạt động tích lũy tinh dầu ở cây Nghệ đen in vitro .46  Ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (IAA, GA 3 , BA) lên sự gia tăng đường kính thân và hoạt động tích lũy tinh dầu ở cây Nghệ đen in vitro 46  Ảnh hưởng của BA lên sự gia tăng đường kính thân và hoạt động tích lũy tinh dầu ở cây Nghệ đen in vitro 51 3.1.5 Ảnh hưởng của BA lên trọng lượng khô và hàm lượng tinh dầu ở cây Nghệ đen trong vườn. 57 3.2 THẢO LUẬN 60 3.2.1 Sự tăng trưởng, cấu trúc giải phẫu và tích lũy tinh dầu của củ cây Nghệ đen 60 3.2.2 Sự thay đổi trọng lượng khô, cường độ hô hấp, hàm lượng tinh bột và hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật của củ Nghệ đen cấp một .63 3.2.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự tăng trưởng và tích lũy tinh dầu ở cây Nghệ đen 65 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 68 4.1 KẾT LUẬN 68 4.2 ĐỀ NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 - Thành phần môi trường MS PHỤ LỤC - Bài báo gởi đăng tạp chí Khoa học và Công nghệ, ĐHQGTPHCM i CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA abscisic acid (acid abscisic) BA (BAP) benzyl adenine (benzyl amino purin) 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid GA 3 gibberellic acid (acid gibberellic) IAA indol acetic acid (acid indol acetic) IBA indol butyric acid (acid indol butyric) JA jasmonic acid (acid jasmonic) NAA α-naphthalene acetic acid (acid α-naphthalene acetic) PTM primary thickening meristem, mô phân sinh dày cấp một TLK trọng lượng khô TLT trọng lượng tươi v DANH MỤC ẢNH Trang Ảnh 1.1. Cây Nghệ đen Curcuma zedoaria. 3 Ảnh 3.1. Sự phát triển củ Nghệ đen từ củ mẹ (m). 30 Ảnh 3.2. Củ nghệ đen trong vườn sau 4 (A), 6 (B), 8 (C) và 10 (D) tháng trồng. 31 Ảnh 3.3. Lát cắt ngang củ cây Nghệ đen với bó libe mộc xếp chồng lên nhau và bó mộc chuyên hóa ly tâm. 32 Ảnh 3.4. Lát cắt ngang củ Nghệ đen cho thấy tinh bột tích trữ nhiều ở vùng vỏ và lõi. 32 Ảnh 3.5. Lát cắt ngang củ Nghệ đen trong vườn cho thấy tinh dầu (mũi tên) được tích trữ trong nhu mô. 33 Ảnh 3.6. Lát cắt ngang rễ cây Nghệ đen. 33 Ảnh 3.7. Cây Nghệ đen in vitro sáu tuần tuổi trên môi trường MS (A) và sau ba tháng tuổi trên môi trường MS bổ sung BA 2 mg/l và IBA 0,5 mg/l (B). 42 Ảnh 3.8. Mô phân sinh dày cấp một ở thân cây Nghệ đen in vitro ba tháng tuổi. 43 Ảnh 3.9. Sự hình thành bó mạch từ vùng mô phân sinh dày cấp một ở các lát cắt ngang thân cây Nghệ đen in vitro tại vị trí xa mô phân sinh ngọn. 44 Ảnh 3.10. Nội bì và trụ bì hình thành ở lát cắt ngang phần gốc thân cây Nghệ đen in vitro. 45 Ảnh 3.11. Lát cắt dọc qua vùng mô phân sinh ngọn của thân cây Nghệ đen in vitro cho thấy ở phần gốc thân (khoảng nách lá thứ bảy trở đi) vùng mô phân sinh dày cấp một đã biệt hóa hoàn toàn (mũi tên). 45 Ảnh 3.12. Lát cắt dọc thân cây Nghệ đen in vitro sau 2 tuần nuôi cấy với môi trường có bố sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau cho thấy sự thay đổi đường kính vùng lõi thân. 49 Ảnh 3.13. Sự phân bố hạt tinh dầu ở vị trí nách lá thứ sáu của thân cây Nghệ đen in vitro sau hai tuần nuôi cấy (mũi tên: hạt tinh dầu). 50 vi Ảnh 3.14. Khúc cắt thân cây Nghệ đen in vitro sau hai tuần nuôi cấy với môi trường bổ sung BA 3 mg/l mang chồi bên tăng trưởng ở phần gốc thân (vị trí nách lá thứ bảy và tám). 55 Ảnh 3.15. Sự phân bố hạt tinh dầu tại các nách lá 5, 6, 7 và 8 (A –D) ở thân cây Nghệ đen in vitro sau hai tuần nuôi cấy với môi trường bổ sung BA 3 mg/l. 56 Ảnh 3.16. Củ ở giai đoạn 10 tháng trồng của cây Nghệ đen trong vườn sau khi xử lý. 59 [...]... và củ cấp ba ở giai đoạn 10 tháng trồng của cây Nghệ đen trong vườn sau khi xử lý .58 Hình 3.13 Sự thay đổi thể tích tinh dầu củ cấp một và củ cấp ba ở giai đoạn 10 tháng trồng của cây Nghệ đen trong vườn sau khi xử lý .58 28 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ 3.1.1 Sự tăng trưởng, cấu trúc giải phẫu và tích lũy tinh dầu của củ cây Nghệ đen trong vườn  Sự tăng trưởng của củ cây Nghệ đen. .. điều hòa tăng trưởng thực vật (IAA, GA3, BA) lên sự gia tăng đường kính thân và hoạt động tích lũy tinh dầu ở cây Nghệ đen in vitro Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có tác động khác nhau lên sự gia tăng đường kính thân và hoạt động tích lũy tinh dầu ở cây Nghệ đen in vitro Sau 2 tuần nuôi cấy, đường kính thân cây Nghệ đen in vitro tại vị trí nách lá thứ sáu ở các nghiệm thức khác nhau có sự thay... 3.2 Sự thay đổi hàm lượng tinh dầu phần giữa củ cấp một, hai và ba ở giai đoạn 10 tháng tuổi của cây Nghệ đen trong vườn 36 3.1.2 Sự thay đổi trọng lượng khô, cường độ hô hấp, hàm lượng tinh bột và hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật của củ Nghệ đen cấp một trong vườn  Sự thay đổi trọng lượng khô, cường độ hô hấp và hàm lượng tinh bột của củ Nghệ đen cấp một trong vườn Trọng lượng khô và. .. chất điều hòa tăng trưởng thực vật của củ cấp một ở các giai đoạn 4, 6, 8 và 10 tháng trồng của cây Nghệ đen trong vườn .38 Bảng 3.5 Đường kính thân và số hạt tinh dầu/ lát cắt ngang của cây Nghệ đen in vitro ở vị trí nách lá số sáu sau hai tuần nuôi cấy với môi trường có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau .47 Bảng 3.6 Sự thay đổi đường kính thân cây Nghệ đen in vitro... Số hạt tinh dầu/ thị trường kính có trong lát cắt ngang phần giữa củ cấp một ở các giai đoạn phát triển của cây Nghệ đen trong vườn 34 Bảng 3.2 Thể tích tinh dầu phần giữa củ cấp một, hai và ba ở giai đoạn 10 tháng tuổi của cây Nghệ đen trong vườn .35 Bảng 3.3 Trọng lượng khô, cường độ hô hấp và hàm lượng tinh bột ở phần giữa củ cấp một ở các giai đoạn phát triển của cây Nghệ đen trong vườn... 0,05 39 Hình 3.5 Sự thay đổi hoạt tính auxin của củ cấp một ở các giai đoạn phát triển của cây Nghệ đen trong vườn Hình 3.6 Sự thay đổi hoạt tính cytokinin của củ cấp một ở các giai đoạn phát triển của cây Nghệ đen trong vườn 40 Hình 3.7 Sự thay đổi hoạt tính gibberellin của củ cấp một ở các giai đoạn phát triển của cây Nghệ đen trong vườn Hình 3.8 Sự thay đổi hoạt tính acid abscisic của củ cấp một... .34 Hình 3.2 Sự thay đổi hàm lượng tinh dầu phần giữa củ cấp một, hai và ba ở giai đoạn 10 tháng tuổi của cây Nghệ đen trong vườn .35 Hình 3.3 Sự thay đổi trọng lượng khô và hàm lượng tinh bột phần giữa củ cấp một ở các giai đoạn phát triển của cây Nghệ đen trong vườn .37 Hình 3.4 Sự thay đổi cường độ hô hấp phần giữa củ cấp một ở các giai đoạn phát triển của cây Nghệ đen trong vườn ... nội bì và trụ bì nằm ngay dưới nội bì 1 mm Ảnh 3.11 Lát cắt dọc qua vùng mô phân sinh ngọn của thân cây Nghệ đen in vitro cho thấy ở phần gốc thân (khoảng nách lá thứ bảy trở đi) vùng mô phân sinh dày cấp một đã biệt hóa hoàn toàn (mũi tên) 46 3.1.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự gia tăng đường kính thân và hoạt động tích lũy tinh dầu ở cây Nghệ đen in vitro  Ảnh hưởng của các... 37 Hình 3.5 Sự thay đổi hoạt tính auxin của củ cấp một ở các giai đoạn phát triển của cây Nghệ đen trong vườn .39 Hình 3.6 Sự thay đổi hoạt tính cytokinin của củ cấp một ở các giai đoạn phát triển của cây Nghệ đen trong vườn 39 Hình 3.7 Sự thay đổi hoạt tính gibberellin của củ cấp một ở các giai đoạn phát triển của cây Nghệ đen trong vườn 40 Hình 3.8 Sự thay đổi hoạt... 0,05 Hình 3.1 Sự thay đổi số hạt tinh dầu/ thị trường kính ở lát cắt ngang phần giữa củ cấp một ở các giai đoạn phát triển của cây Nghệ đen trong vườn 35 Bảng 3.2 Thể tích tinh dầu phần giữa củ cấp một, hai và ba ở giai đoạn 10 tháng tuổi của cây Nghệ đen trong vườn Cấp củ Thể tích tinh dầu (ml/100 g TLT) 1 2 3 1,35 ± 0,06a 1,18 ± 0,04b 0,95 ± 0,03c Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau . tài: Tìm hiểu sự tăng trưởng và tích lũy tinh dầu trong thân rễ của cây Nghệ đen Curcuma zedoaria Rosc. ” được thực hiện nhằm mục đích: - Áp dụng chất điều hòa tăng trưởng thực vật vào thời. lên sự gia tăng đường kính thân và hoạt động tích lũy tinh dầu ở cây Nghệ đen in vitro 46  Ảnh hưởng của BA lên sự gia tăng đường kính thân và hoạt động tích lũy tinh dầu ở cây Nghệ đen in. 27 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 KẾT QUẢ 28 3.1.1 Sự tăng trưởng, cấu trúc giải phẫu và tích lũy tinh dầu của củ cây Nghệ đen trong vườn 28  Sự tăng trưởng của củ cây Nghệ đen trong vườn