ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM GIANG ANH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN VÀ TỶ LỆ LOÀI KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TẠI HUYỆN BÙ ĐĂNG, TỈNH BÌNH PHƯỚC BẰNG KỸ THUẬT NHUỘM GIÊM SA VÀ NESTED - PCR Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. BS. HỒ VĂN HOÀNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2012 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. BS. Hồ Văn Hoàng, người đã định hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh, đã giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu cho chúng em. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng TP. Hồ Chí Minh, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện nghiên cứu tại Viện và đóng góp những ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh học phân tử - Miễn dịch, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng TP. Hồ Chí Minh, đã hỗ trợ các phương tiện, máy móc, hóa chất để thực hiện các thí nghiệm trong luận án; cán bộ trong khoa đã quan tâm động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. MỤC LỤC Trang phụ bìa Trang Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Bệnh sốt rét 5 1.1.1. Định nghĩa 5 1.1.2. Ký sinh trùng sốt rét 5 1.1.3. Véc tơ truyền bệnh sốt rét 7 1.1.4. Vật chủ cảm thụ 8 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lây truyền bệnh sốt rét 9 1.2. Phân bố và cơ cấu KSTSR trên thế giới và Việt Nam 9 1.2.1. Phân bố và cơ cấu KSTSR trên thế giới 9 1.2.2. Phân bố và cơ cấu KSTSR ở Việt Nam 10 1.3. Tình hình sốt rét của Việt Nam và huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 12 1.3.1. Tình hình sốt rét của Việt Nam 12 1.3.2. Tình hình sốt rét của huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 14 1.4. Các kỹ thuật xét nghiệm phát hiện KSTSR 15 1.4.1. Kỹ thuật nhuộm Giêm sa 15 1.4.2. Các test chẩn đoán nhanh (rapid diagnostic test) 18 1.4.3. Phương pháp nhuộm nhanh AO (Acridine Orange) 20 1.4.4. Phương pháp QBC (Quantative Buffy Coat) 20 1.4.5. Phươ ng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 20 1.5. Điều trị sốt rét 24 1.5.1. Nguyên tắc điều trị 24 1.5.2. Thuốc sốt rét theo nhóm người bệnh, chủng loại KSTSR 25 1.6. Các biện pháp phòng chống bệnh sốt rét 25 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 27 2.1.1. Đối tượng 27 2.1.2. Thời gian 27 2.1.3. Địa điểm 27 2.2. Vật liệu nghiên cứu 27 2.2.1. Mẫu chứng dương 27 2.2.2. Vật liệu của kỹ thuật nhuộm Giêm sa 27 2.2.3. Vật liệu của kỹ thuật PCR 28 2.2.3.1. Hóa chất dùng để tách chiết DNA 28 2.2.3.2. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 28 2.2.3.3. Hóa chất dùng cho điện di 29 2.3. Các thiết bị chính 30 2.4. Phương pháp nghiên cứu 30 2.4.1. Thiết kế nghiên cứu 30 2.4.2. Phương pháp thu thập số liệu 30 2.4.2.1. Cỡ mẫu 30 2.4.2.2. Thu thập mẫu máu ngoại vi trên lam kính 31 2.4.2.3. Thu thập mẫu máu trên giấy thấm Whatman 3MM 31 2.4.3. Kỹ thuật nghiên cứu 31 2.4.3.1. Kỹ thuật nhuộm Giêm sa 31 2.4.3.2. Kỹ thuật soi kính hiển vi phát hiện KSTSR 32 2.4.3.3. Kỹ thuật tách chiết DNA để thực hiện phản ứng PCR 33 2.4.3.4. Kỹ thuật Nested - PCR phát hiện KSTSR 34 2.4.3.5. Điện di trên gel agarose 35 2.5. Phương pháp giải trình tự 35 2.6. Các chỉ số đánh giá 36 2.7. Y đức 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38 3.1. Kết quả 39 3.1.1. Kết quả xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa 39 3.1.2. Kết quả xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật Nested - PCR 45 3.1.3. So sánh kỹ thuật nhuộm Giêm sa và kỹ thuật Nested - PCR trong việc phát hiện KSTSR 51 3.1.4. Kết quả giải trình tự 54 3.2. Bàn luận 55 3.2.1. Thành ph ần, tỷ lệ loài KSTSR tại các điểm thu thập mẫu 55 3.2.2. Những trường hợp khác biệt kết quả giữa kỹ thuật Giêm sa và kỹ thuật PCR 56 3.2.3. Phát hiện những ca nhiễm KSTSR hiếm gặp 59 3.2.4. Ký sinh trùng lạnh 60 3.2.5. Thay đổi về cơ cấu KSTSR của huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 A. Kết luận 64 B. Kiến nghị 65 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA: Acid deoxyribonucleic dNTPs: deoxynucleotide triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid KST: Ký sinh trùng KSTSR: Ký sinh trùng sốt rét Marker: Thang chuẩn QBC: Quantative Buffy Coat P.: Plasmodium P.f: P. falciparum P.v: P. vivax P.m: P. malariae P.o: P. ovale PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PCSR: Phòng chống sốt rét DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tình hình sốt rét cả nước giai đoạn 2006 - 2010 13 Bảng 1.2. Các vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp năm 2009 14 Bảng 1.3. Tình hình sốt rét tại huyện Bù Đăng 2008 - 2010 15 Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi đặc hiệu cho Plasmodium 28 Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho 4 loài KSTSR 28 Bảng 2.3. Kích thước sản phẩm PCR của 4 loài KSTSR 35 Bảng 3.1. Số ca KST dương tính xác định bằng Giêm sa 41 Bảng 3.2. Cơ cấu KSTSR xác định bằng Giêm sa 42 Bảng 3.3. Các trường hợp nhiễm phối hợp phát hiện bằng Giêm sa 44 Bảng 3.4. Tần suất các loài KSTSR xác định bằng Giêm sa 44 Bảng 3.5. Số ca KST dương tính xác định bằng Nested - PCR 47 Bảng 3.6.Cơ cấu KSTSR xác định bằng Nested - PCR 48 Bảng 3.7. Các trường hợp nhiễm phối hợp phát hiện bằng Nested - PCR 50 Bảng 3.8. Tần suất các loài KSTSR xác định bằng Nested - PCR 50 Bảng 3.9. So sánh kết quả của kỹ thuật Giêm sa và Nested - PCR 51 Bảng 3.10. Những trường hợp khác biệt giữa 2 kỹ thuật 51 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Chu kỳ phát triển của KSTSR (Nguồn CDC) 7 Hình 1.2. Hình thể 4 loài KSTSR nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi 17 Hình 1.3. Hình thể KSTSR P. knowlesi nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi 17 Hình 1.4. Test chẩn đoánh nhanh 19 Hình 1.5. KSTSR phát hiện bằng phương pháp QBC 20 Hình 1.6. Chu trình phản ứng PCR 21 Hình 1.7. Sơ đồ kỹ thuật Nested - PCR xác định 4 loài KSTSR 22 Hình 1.8. Hình ảnh kết quả chạy điện di các loài KSTSR 23 Hình 3.1. Lam máu nhuộm Giêm sa 39 Hình 3.2. KSTSR P. falciparum trên lam máu nhuộm Giêm sa 40 Hình 3.3. KSTSR P. vivax trên lam máu nhuộm Giêm sa 40 Hình 3.4. KSTSR P. malariae trên lam máu nhuộm Giêm sa 41 Hình 3.5 . Biểu đồ số ca KSTSR dương tính xác định bằng Giêm sa 42 Hình 3.6. Biểu đồ cơ cấu KSTSR tại các điểm nghiên cứu xác định bằng Giêm sa 43 Hình 3.7. Biểu đồ cơ cấu KSTSR xác định bằng Giêm sa 43 Hình 3.8. Biểu đồ tần suất loài KSTSR xác định bằng Giêm sa 43 Hình 3.9. Hình ảnh kết quả PCR những mẫu nhiễm P. falciparum 45 Hình 3.10. Hình ảnh kết quả PCR ca nhiễm phối hợp P. falciparum, P. vivax và P. ovale 46 Hình 3.11. Hình ảnh kết quả PCR sản phẩm nhiễm đơn P. falciparum 46 Hình 3.12. Hình ảnh kết quả nhiễm phối hợp P. falciparum, P. vivax, P. malariae và nhiễm đơn P. vivax 47 Hình 3.13. Biểu đồ số ca KSTSR dương tính xác định bằng Nested - PCR 48 Hình 3.14. Biểu đồ cơ cấu KSTSR tại các điểm nghiên cứu xác định bằng Nested - PCR 49 Hình 3.15. Biểu đồ cơ cấu KSTSR xác định bằng kỹ thuật Nested - PCR 49 Hình 3.16. Biểu đồ t ần suất các loài KSTSR xác định bằng Nested - PCR 50 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Sốt rét là một bệnh lây qua đường máu, do ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) truyền từ người bệnh sang người lành bởi muỗi Anopheles (hay còn gọi là muỗi đòn xóc). Sốt rét là một trong những căn bệnh gây tử vong hàng đầu thế giới. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện có 106 quốc gia và vùng lãnh thổ có sốt rét lưu hành. Hàng năm, có khoảng 350 đến 500 triệu người mắc sốt rét và gần 1 triệu ng ười tử vong do sốt rét, đa số là phụ nữ và trẻ em ở châu Phi [30] . Trước đây, được biết có 4 loài KSTSR gây bệnh cho người là Plasmodium falciparum (P. falciparum), Plasmodium vivax (P. vivax), Plasmodium malariae (P. malariae), Plasmodium ovale (P. ovale). Gần đây, một số báo cáo cho thấy Plasmodium knowlesi (P. knowlesi), một ký sinh trùng (KST) của loài khỉ, cũng có thể gây bệnh cho người. Bệnh sốt rét thường dễ bị nhầm lẫn với các bệnh gây sốt khác như: cảm cúm, sốt Dengue, sốt mò, thương hàn… Đồng thời, mỗi loài KSTSR có chu kỳ phát triển và bệnh lý khác nhau. Đặc biệt, ký sinh trùng (KST) P. falciparum nếu không đượ c chẩn đoán và điều trị kịp thời có thể dẫn đến sốt rét ác tính với các triệu chứng sốt rét não, đái huyết cầu tố, thiếu máu nặng, suy thận, suy gan, trụy tim mạch gây tử vong. Do đó, chẩn đoán chính xác và kịp thời loài KSTSR gây bệnh là một khởi đầu quan trọng đối với công tác điều trị. Xác định thành phần, cơ cấu của KSTSR tại một khu vự c góp phần cung cấp số liệu cho việc hoạch định chính sách thuốc, cung cấp phác đồ điều trị cho từng vùng, xây dựng bản đồ dịch tễ sốt rét và chiến lược phòng chống phù hợp. Phương pháp soi lam máu nhuộm Giêm sa nhận biết hình thể đặc trưng của các loài KSTSR dưới kính hiển vi là phương pháp xét nghiệm thường quy được áp dụng rộng rãi trong mọi điều kiện thực địa cũng như trong phòng thí nghiệm để chẩn đoán, phát hiện KSTSR. Phương pháp này được xem như là “chuẩn vàng” 2 trong đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sốt rét mới. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, một số phương pháp mới đã được nghiên cứu, triển khai đã cung cấp những hướng nghiên cứu mới về KSTSR. Đặc biệt, phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) ngoài việc phát hiện được KSTSR ở mật độ thấp (1KST/1μl máu) còn có khả năng xác định các trường hợp nhiễm phối hợp nhiều loài KSTSR giúp chẩn đoán, điều trị bệnh kịp thời; qua đó, hạn chế tình trạng KST kháng thuốc sốt rét, cung cấp dẫn liệu về thành phần và tỷ lệ loài KSTSR ứng dụng trong việc lập bản đồ dịch tễ sốt rét. Tại Việt Nam, trong những thập niên qua, cùng với sự phát triển và những thành tựu củ a ngành y tế, công tác phòng chống sốt rét (PCSR) đã đạt được những kết quả đáng kể, làm giảm số người mắc, số người chết và hạn chế bùng phát dịch sốt rét, góp phần vào sự nghiệp chăm sóc và bảo vệ sức khỏe nhân dân. Tuy nhiên, do nước ta có điều kiện thuận lợi về địa lý, khí hậu cho sự phát triển của muỗi Anopheles, trung gian truyền bệnh; cơ cấu KSTSR tại những vùng sốt rét lưu hành có sự thay đổi; đồng thời, trình độ dân trí và ý thức phòng chống bệnh một số nơi chưa cao, cộng với hiện tượng di dân tự do làm cho tình hình bệnh sốt rét vẫn còn diễn biến phức tạp. Được sự quan tâm và đầu tư của Chính phủ, tỉnh Bình Phước nằm trong vùng kinh tế trọng điểm phía Nam bao gồm các tỉnh, thành phố: TP. Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Dương, Bình Ph ước, Tây Ninh, Long An và Tiền Giang. Đây cũng là một trong những địa phương có tình hình sốt rét lưu hành nặng. Tỉnh Bình Phước với dân số 894.941 người (năm 2010), toàn tỉnh có 856.477 người sống trong vùng sốt rét lưu hành (chiếm 95,7% dân số). Theo thống kê năm 2010, cả nước có 54.297 ca mắc sốt rét, riêng tỉnh Bình Phước có 3.566 ca (chiếm tỷ lệ 6,7%) [21] . Do đó, để thực hiện tốt công tác chăm sóc sức khoẻ nhân dân, việc nghiên cứu thành phần, tỷ lệ loài KSTSR của tỉnh Bình Phước để có biện pháp can thiệp đúng, hạn chế sự lây truyền và tiến đến loại trừ bệnh sốt rét là việc làm cần thiết. [...]... sát thành phần và tỷ lệ loài KSTSR tại huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa và Nested - PCR 3 Nội dung thực hiện + Xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa + Xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật Nested - PCR + So sánh kỹ thuật nhuộm Giêm sa và kỹ thuật Nested - PCR trong việc phát hiện KSTSR 4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 BỆNH SỐT RÉT 1.1.1... của P ovale (kỹ thuật PCR) tại huyện Khánh Vĩnh, Khánh Hòa [7], [8] Tại khu vực Nam Bộ - Lâm Đồng, năm 2001, Lê Đức Đào và cộng sự áp dụng kỹ thuật PCR khảo sát thành phần 4 loài KSTSR ở 3 tỉnh: Lâm Đồng, Bình Phước và Đắk Lắk Kết quả cho thấy sự tồn tại của cả 4 loài KSTSR và tỷ lệ nhiễm phối hợp 2, 3 loài rất cao Tại Lâm Đồng tỷ lệ nhiễm phối hợp là 41%, Bình Phước 22%, Đắk Lắk 36,5% - Tại Lâm Đồng:... hình sốt rét của huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước Bình Phước là tỉnh thuộc miền Đông Nam Bộ, là trọng điểm sốt rét của cả nước và của khu vực Nam Bộ - Lâm Đồng Dân số 894.941 người trong đó có 856.477 người sống trong vùng sốt rét lưu hành (chiếm tỷ lệ 95,7%) Theo thống kê năm 2010, toàn tỉnh có 3.566 ca mắc sốt rét, trong đó có 52 ca sốt rét ác tính và 5 ca tử vong [21] Tại tỉnh Bình Phước, sốt rét lưu... kháng artesunat đầu tiên tại Việt Nam là tại xã Đak Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước với tỷ lệ điều trị thất bại là 14,6% càng gây khó khăn cho công tác PCSR 1.4 CÁC KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN KSTSR [4], [11], [13], [29] 1.4.1 Kỹ thuật nhuộm Giêm sa Kỹ thuật nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi quang học là kỹ thuật cổ điển được sử dụng để phát hiện KSTSR trong máu Kỹ thuật này do Ronald Ross... ca có kết quả âm tính đối với kỹ thuật nhuộm Giêm sa [31] Lê Đức Đào và cộng sự (2002) sử dụng đồng thời 3 kỹ thuật: soi lam máu nhuộm Giêm sa, Paracheck và PCR xác định P falciparum trên đối tượng trẻ em dưới 10 tuổi, bệnh nhân sốt rét P falciparum sau 14 ngày điều trị thuốc sốt rét và đồng bào dân tộc Bana, tại xã Đaksong huyện Krongchro tỉnh Gia Lai năm 2003 Kỹ thuật PCR phát hiện được 41,6% số mẫu... giúp cho kỹ thuật PCR nhanh, đơn giản và có thể thực hiện tự động trên máy luân nhiệt Hình 1.6 Chu trình phản ứng PCR Kỹ thuật PCR trong xét nghiệm KSTSR Kỹ thuật PCR sử dụng trong chẩn đoán, xác định loài KSTSR là Nested PCR (PCR lồng) Kỹ thuật này có khả năng phát hiện được KST ở mật độ rất thấp (1 KST/μl máu) Kỹ thuật Nested - PCR có thể phân tích được các mẫu máu thu thập từ thực địa và phát hiện... KSTSR Hiện nay, kỹ thuật soi lam máu nhuộm Giêm sa được xem như là “chuẩn vàng” trong đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sốt rét mới Nguyên lý: Khi nhuộm dung dịch Giêm sa, nguyên sinh chất của ký sinh trùng sẽ bắt màu xanh còn nhân bắt màu đỏ, sắc tố màu đen ánh vàng hay đen tùy thuộc vào chủng loại KST Dựa vào đặc điểm và màu sắc đó ta có thể nhận dạng và phân biệt được... Postigo M tiến hành tại Venezuela (1998) 100 mẫu máu bệnh nhân thu thập được phân tích bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật thường quy soi lam máu nhuộm Giêm sa Trong số 100 mẫu, PCR xác định được 99% các trường hợp nhiễm P vivax; 100% các trường hợp nhiễm P falciparum Có 6 trường hợp kỹ thuật Giêm sa không phát hiện được (6%) Kỹ thuật PCR phát 24 hiện: 29% (17/59) các trường hợp Giêm sa xác định nhiễm đơn... mưa và sự tiếp xúc giữa véc tơ truyền bệnh và người làm gia tăng sự lây lan của bệnh [10] 1.1.2 Ký sinh trùng sốt rét KSTSR thuộc giới đơn bào, lớp Protozoa, họ Plasmodidae, giống Plasmodium Có khoảng 120 loài trong đó có ít nhất 22 loài ký sinh ở động vật tứ chi, 19 loài ký sinh ở động vật có vú, khoảng 70 loài ký sinh ở chim và bò sát Có 4 loài Plasmodium ký sinh ở người là: Plasmodium malariae (P malariae)... có kết quả Paracheck âm tính Kỹ thuật PCR cũng phát hiện 3 mẫu có P falciparum trong 25 và 20 mẫu mà kỹ thuật Giêm sa và Paracheck có kết quả âm tính ở ngày thứ 14 của bệnh nhân sau khi điều trị Fansidar hoặc Artesunate [6] Nguyễn Quốc Hưng và cộng sự (2003) tiến hành xét nghiệm 2770 bệnh nhân bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa và test Paracheck Pf Kết quả so sánh với nhuộm Giêm sa thì Paracheck Pf có độ nhạy . định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa 39 3.1.2. Kết quả xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật Nested - PCR 45 3.1.3. So sánh kỹ thuật nhuộm Giêm sa và kỹ thuật. KSTSR tại huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa và Nested - PCR. 3. Nội dung thực hiện + Xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa. + Xác định thành phần. GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM GIANG ANH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN VÀ TỶ LỆ LOÀI KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TẠI HUYỆN BÙ ĐĂNG, TỈNH BÌNH PHƯỚC BẰNG