ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHI Ê N NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM, GANODERMA COLOSSUM; NẤM VÂN CHI TRAMETES VERSICOLOR VÀ NẤM THƯỢNG HOÀNG PHELLINUS LINTEUS NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG TH Ư Chuyên ngành: DI TRUYỀN Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌ C NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời cám ơn đến PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương. Cô đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Và tôi cũng rất biết ơn Trung tâm Sâm và Dược liệu T.P.Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện đề tài tại Trung tâm. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy D ươ ng đã tạo cho tôi cơ hội được thực hiện khóa luận tại phòng thí nghiệm SHPT của trường và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học t ậ p. Tôi cũng trân trọng cảm ơn GS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng cùng các Thầy Cô, các anh chị em trong khoa Hóa đã cho tôi rất nhiều tình thương cũng như nhiệt tình tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này. Đặc biệt, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới em Nguyễn Thái Hoàng Tâm và em Lê Minh Triết đã nhiệt tình giúp đỡ tôi rất nhiều về mặt chuyên môn. Tôi chân thành biết ơn cha mẹ và những người bạn thân đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành xong luận văn này. Nguyễn Thị Thúy H ằ ng MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơ n Mục lục Danh mục chữ viết t ắ t Danh mục các b ả ng Danh mục các hình LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát về ung thư 3 1.1.1. Sơ lược về nguyên nhân gây ung thư 3 1.1.2. Đặc tính của tế bào ung thư 4 1.2. Apoptosis và ung thư 4 1.2.1. Phân biệt apoptosis với necrosis 5 1.2.2. Caspase- enzyme đóng vai trò trung tâm trong apoptosis 7 1.2.3. Các con đường hoạt hoá caspase trong tiến trình apoptosis 11 1.2.4. Apoptosis - mục tiêu trị liệu ung thư 17 1.3. Tóm tắt những nghiên cứu về nấm dược liệu 19 1.3.1. Khái quát chung về nấm dược li ệ u 19 1.3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học 24 1.3.3. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý 27 1.3.4. Nghiên cứu và ứng dụng nấm dược liệu theo hướng điều trị ung thư 31 1.4. NCI và việc sàng lọc dược liệu kháng ung thư 32 i CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 34 2.1.1. Ba dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela, ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi NCI-H460 sử dụng trong đề tài 34 2.1.2. Thuốc đối chiếu Camptothecin 35 2.1.3. Nấm dược liệu 35 2.1.4. Hóa ch ấ t 37 2.1.5. Thiết bị 40 2.2. Phương pháp 40 2.2.1. Phương pháp thu nhận cao chiết từ nấm dược liệu 40 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật 43 2.2.3. Phương pháp đếm tế bào với Tryphan blue 44 2.2.4. Thử nghiệm SRB 46 2.2.5. Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang v ớ i thuốc nhuộm kép AO/EB 50 2.2.6. Phương pháp tách chiết và điện di DNA phân tử lượng nhỏ (phương pháp DNA phân mảnh) 51 2.2.7. Phương pháp xác định hoạt tính caspase-3 53 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết thô (cao chiết cồn và cao chiết nước) từ các mẫu nấm Linh chi, Vân chi, Thượng hoàng trên ba dòng tế bào ung thư HeLa, NCI-H460 và MCF-7 57 3.1.1. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào HeLa 57 3.1.2. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào MCF-7 61 i 3.1.3. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết nước trên dòng tế bào NCI-H460 63 3.2. Kết quả khảo sát độc tính tế bào của các cao chi ế t phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô chiết từ nấm Linh chi vàng trên ba dòng tế bào HeLa, NCI-H460 và MCF-7 66 3.2.1. Tế bào HeLa 67 3.2.2. Tế bào ung thư vú MCF-7 69 3.2.3. Tế bào ung thư phổi NCI-H460 70 3.2.4. Kết quả xác định cao chiết tiềm năng 72 3.3. Xác định giá trị IC 50 của cao chiết cồn nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum) trên dòng tế bào HeLa 73 3.4. Kết quả xác định khả năng gây apoptosis của cao chiết cồn nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum) trên dòng tế bào ung thư HeLa 75 3.4.1. Kết quả nhuộm huỳnh quang với thuốc nhuộm kép AO/EB 75 3.4.2. Kết quả phân tích DNA phân mảnh 78 3.4.3. Kết quả xác định hoạt tính caspase-3 80 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN Kết luận 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 PHỤ LỤC i DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa apoptosis và necrosis 5 Bảng 1.2. Các nhóm caspase và vai trò của nó trong tế bào 8 Bảng 1.3. Thành phần hóa học của nấm Linh chi Ganoderma lucidum 24 Bảng 2.1. Các loại nấm dược liệu sử dụng trong đề tài 35 Bảng 2.2. Độ ẩm của nguyên liệu và cao chiết 36 Bảng 3.1. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chi ế t nước trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 58 Bảng 3.2. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chi ế t nước trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 61 Bảng 3.3. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của các cao chiết cồn và cao chiết n ướ c trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 63 Bảng 3.4. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao chi ế t phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô chiết xuất từ nấm Linh chi vàng trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứ ng 68 v Bảng 3.5. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao chi ế t phân đoạn có chứa triterpen và polysaccharid thô chiết xuất từ nấm Linh chi vàng trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứ ng 69 Bảng 3.6. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn, các cao chiết phân đoạn có chứa triterpen và polysaccharide thô chiết xuất từ nấm Linh chi vàng trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 71 Bảng 3.7. Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết cồn nấm Linh chi vàng trên dòng tế bào HeLa ở các nồng độ thử nghiệm sau 48 giờ cảm ứng 74 Bảng 3.8. Kết quả hoạt tính caspase-3 của quần thể tế bào Hela ở nh ữ ng thời điểm khác nhau 82 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIF : apoptosis inducing factor Apaf-1 : protease-activating factor 1 AO/ EB : acridine orange/ ethidium bromide BuOH : buthanol CAD : caspase activated DNase CARD : caspase recruitment domain CPT : camptothecin DD : death domain DEVD : Asp-Glu-Val-Asp DED : death effector domain DISC : death inducing signalling complex DNA : deoxyribose nucleic acid DMSO : dimethyl sulphoxide E’MEM : eagle minimal essential medium EDTA : ethylenediaminetera-acetic acid FasL : Fas-ligand FasR : Fas- receptor FADD : Fas-associated death domain FBS : fetal bovine serum HEPES : n-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethane sulfonic acid IC 50 : inhibitor concentration of 50% ICAD : inhibitor of caspase activated DNase MeOH :methanol MTT : 3-(4,5 Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide NCI : national cancer institute NST : nhiễm sắc th ể 8 PARP : enzyme nuclear polymerase PARP PSK : polysaccharopeptide Krestin PSP : polysaccharopeptide PBS : phosphate buffer saline RAIDD : RIP associated Ich-1/CED3 homologous protein with death domain R110 : rhodamine 110 SRB : sulforhodamine B STD : standard deviation TCA : trichloroacetic acid TNF : tumor necrosis factor TRAIL : TNF- related apoptosis induced- ligand TRADD : TNF receptor – associated death domain WHO : world health organization XTT : sodium 3,3,-[(phenylamino)carbonyl]-3,4-tetrazolium-bis(4- methoxy-6-nitro)benzenesulfonic acid hydrate DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sự hình thành tế bào ung thư 4 Hình 1.2. Sự khác biệt hình thái giữa tế bào apoptosis và necrosis 7 Hình 1.3. Cơ chế tự hoạt hóa của caspase 9 Hình 1.4. “Thác” caspase 10 Hình 1.5. Hai con đường khởi phát quá trình apoptosis 11 Hình 1.6. Cơ chế hoạt hóa caspase thông qua thụ thể gây chết TNF 13 Hình 1.7. Sự truyền tín hiệu apoptosis thông qua ty thể 15 Hình 1.8. Con đường khởi phát apoptosis thông qua granzyme A, B 17 Hình 1.9. Hình thái quả thể nấm Linh chi 20 Hình 1.10. Hình thái quả thể nấm Vân chi 21 Hình 1.11. Hình thái quả thể nấm Thượng hoàng mọc trên mạt cưa 23 Hình 2.1. Ba dòng tế bào ung thư sử dụng trong đề tài 34 Hình 2.2. Quy trình thu nhận cao chiết phân đoạn có chứa triterpen 42 Hình 2.3. Tế bào nhuộm với Tryphan blue quan sát trong buồng đếm hồng cầu 44 1 [...]... Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các cao chi t cồn và cao chi t nước của 7 mẫu nấm (Linh Chi, Vân Chi và Thư ng Hoàng) trên ba dòng tế bào là ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung Hela và ung thư phổi NCI-H460 bằng thử nghiệm Sulforhodamine B (SRB) Từ đó, chọn ra một loại nấm có tiềm năng nhất Bước đầu khảo sát khả năng gây độc trên ba dòng tế bào Hela, NCI-H460 và MCF-7 của các dịch chi t phân đoạn... trăm gây độc tế bào của cao chi t cồn, các cao chi t phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi vàng trên dòng tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 71 Hình 3.8 Biểu đồ so sánh tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chi t cồn, các cao chi t phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi vàng trên 3 dòng tế bào HeLa, MCF-7 và NCI-H460 ở nồng độ 100... thể hiện phần trăm gây độc tế bào của cao chi t cồn, các cao chi t phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi vàng trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ 100 µg/ml, sau 48 giờ cảm ứng 68 Hình 3.6 Đồ thị thể hiện phần trăm gây độc tế bào của cao chi t cồn, các cao chi t phân đoạn có chứa triterpene và polysaccharide thô của Linh chi vàng trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml, sau... nhiên ở nước ta, việc tiếp cận theo hướng nghiên cứu thử nghiệm và sàng lọc in vitro các hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng ung thư từ các loại nấm này vẫn còn là bước đầu và chỉ mới có một vài nghiên cứu được công bố [3],[6] Nhằm làm rõ hơn về tác dụng kháng ung thư của các loại nấm Linh Chi, Vân Chi và Thư ng Hoàng nuôi trồng tại Việt Nam trên ba loại ung thư được xem là phổ biến nhất hiện nay ở nước... pháp Nấm Thư ng hoàng thuộc ngành Basidiomycota, lớp Basidiomycetes, bộ Hymenochaetales, họ Hymenochaetaceae, chi Phellinus, có tên khoa học là Phellinus linteus Nấm Thư ng hoàng còn gọi là nấm Hoàng sơn Ở Trung Quốc, nấm Thư ng hoàng được gọi là Song-gen, ở Hàn Quốc là Sang-hwang và ở Nhật là Meshimakobu Hình 1.11 Hình thái quả thể nấm Thư ng hoàng mọc trên mạt cưa ƒ Môi trường sống Đây là các loài nấm. .. thụ tầng năm trước Nấm thư ng mọc ở những vùng rừng sâu, trên núi cao hiểm trở hoặc trong các khu rừng nguyên sinh Tuổi của nấm có khi lên đến vài chục năm Đến nay, Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu đã trồng thành công loài nấm Thư ng hoàng (Phellinus linteus) với công thức do Trung tâm phối chế trong bịch mạt cưa Đây là công trình trồng nấm Thư ng hoàng đầu tiên ở Việt Nam từ nguồn giống... thuộc họ Linh chi (xem hình 1.9.A) Ngày nay, các nhà khoa học đã xác định Linh chi đỏ là loài nấm có tên khoa học là Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst Ngoài ra, ở Việt Nam nó còn có tên thông dụng là Linh chi, ở Trung Quốc gọi Lingzhi, Hàn Quốc gọi là Youngzhi và Nhật gọi là Reishi Linh chi đỏ được gọi là Linh chi chuẩn” để phân biệt với những loài khác cùng chi Ganoderma Hiện nay, nấm Linh chi đỏ... tăng sinh, khả năng đi vào mạch máu và khả năng di chuyển của tế bào Thông thư ng, những tế bào mang những sai hỏng trong DNA như thế sẽ trải qua apoptosis để “tự sát Nhưng trong trường hợp tế bào ung thư, những đột biến sẽ ngăn cản không cho tế bào đi vào quá trình apoptosis Những đột biến của tế bào ung thư làm cho tế bào không nhận diện được những tín hiệu điều hòa tăng trưởng và chúng trở nên... khoa học phương Đông và cả phương Tây Đến nay có ít nhất hơn 2.000 báo cáo khoa học về Linh chi đã được công bố trên thế giới [7] ƒ Phân loại – danh pháp Có rất nhiều loài Linh chi khác nhau Các loài Linh chi được xếp vào một họ riêng là họ nấm Linh chi Ganodermataceae, trong đó chi Ganoderma có gần đến 80 loài Khi nói đến Linh chi tức là đề cập đến loài Linh chi đỏ, đây là loại Linh chi tốt nhất trong... chi m tỷ lệ và gây tử vong cao nhất ở nam giới, kể cả ở các nước phát triển và đang phát triển Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, ung thư vú và ung thư cổ tử cung là hai loại ung thư thường gặp và có tỷ lệ tử vong cao nhất trong các loại ung thư phụ khoa ở nữ giới, đặc biệt là phụ nữ ở các nước đang phát triển Tại Việt Nam, hai loại ung thư này đứng đầu trong các loại ung thư thường gặp ở nữ giới . CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHI Ê N NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM, GANODERMA COLOSSUM; NẤM VÂN CHI TRAMETES. CHI TRAMETES VERSICOLOR VÀ NẤM THƯỢNG HOÀNG PHELLINUS LINTEUS NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG TH Ư Chuyên ngành: DI TRUYỀN Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌ C NGƯỜI. bào của các cao chi t thô (cao chi t cồn và cao chi t nước) từ các mẫu nấm Linh chi, Vân chi, Thư ng hoàng trên ba dòng tế bào ung thư HeLa, NCI-H460 và MCF-7 57 3.1.1. Kết quả khảo sát