ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN oOo TRẦN LÊ LƯU LY CHUYỂN GEN RETROTRANSPOSON Tnt1 VÀO CÂY ĐẬU NÀNH (Glycine max) BẰNG PHƯƠNG PHÁP Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2011 Lời cảm ơn Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi đã luôn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy, cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: TS . N guyễn Hữu Hổ đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. P GS . TS . Bùi Văn Lệ đã giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm và góp ý cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cô Cung Hoàng P hi P hượng, chò N guyễn Hồng N hã Trân, bạn N guyễn Thanh N hật Q uang đã ủng hộ, giúp đỡ về mọi mặt trong thời gian tôi làm luận văn xa nhà. Thầy Kiều P hương N am, Chò Q uách N gô Diễm P hương, bạn N guyễn Hữu Hoàng, bạn Bùi Xuân S ơn, em Trần Minh Tuấn, em Hoàng Thò Thanh Minh, cùng các em sinh viên đã và đang làm việc tại bộ môn CN S H Thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong công việc, học tập cũng như nghiên cứu. Chò Bùi Lan A nh, chò N guyễn P han Cẩm Tú đã tận tình góp ý và sửa chữa trong quá trình hoàn thiện luận văn. A nh và gia đình đã luôn bên cạnh, ủng hộ và nâng đỡ tôi. I would like to be grateful to: Dr Zhanyuan Zhang, the Director of P lant Transformation Core Facility (P TCF), University of Missouri for thoughtful recommendations and helpful scientific discussions. Dr Barapuram S hyam, Dr Heyoung Lee, J ennie and all staff members of P TCF for kindly showing me the soybean transformation protocol and friendly helping during my work. Dr Henry T. N guyen for providing the scholarship and financial support to me during this study. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 1 tháng 1 năm 2011 Trần Lê Lưu Ly i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG viii MỞ ĐẦU 1 1 TỒNG QUAN 3 1.1 Cây đậu nành 3 1.1.1 Vị trí phân loại 3 1.1.2 Đặc điểm sinh học 3 1.1.3 Điều kiện nuôi trồng 4 1.1.4 Nguồn gốc, phân bố và sản lượng đậu nành trên thế giới 4 1.1.5 Thành phần dinh dưỡng của hạt đậu nành 5 1.1.6 Nuôi cấy mô, tạo vật liệu cho quá trình chuyển gen ở cây đậu nành 5 1.1.7 Giá trị thương mại của cây đậu nành 7 1.2 Chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 8 1.2.1 Phân loại vi khuẩn A. tumefaciens 8 1.2.2 Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh của A. tumefaciens 8 1.2.3 Ti plasmid 8 1.2.4 Quá trình xâm nhiễm của A. tumefaciens 10 1.2.5 Ứng dụng Ti plasmid trong công nghệ gen thực vật 11 1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen bằng A. tumefaciens… 12 1.3 Một số phương pháp chuyển gen khác 17 1.3.1 Phương pháp bắn gen 18 ii 1.3.2 Phương pháp SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium- mediated transformation) 18 1.3.3 Phương pháp lọc chân không 19 1.3.4 Phương pháp Floral-dip 19 1.3.5 Phương pháp Agrolistic 19 1.3.6 Vi tiêm DNA 19 1.3.7 Vi sợi "whiskers" 20 1.3.8 Phương pháp PEG (Polyethylene glycol) 20 1.3.9 Phương pháp xung điện 20 1.4 Retrotransposon 20 1.4.1 Giới thiệu… 21 1.4.2 Cơ chế chuyển vị của retrotransposon 21 1.4.3 Phân loại retrotransposon thực vật 22 1.4.4 Phân lập và ứng dụng LTR retrotransposon thực vật 23 1.4.5 Retrotransposon Tnt1 24 1.5 Nghiên cứu chọn tạo giống đậu nành trên thế giới 25 1.5.1 Chọn tạo giống đậu nành bằng phương pháp truyền thống 25 1.5.2 Chọn tạo giống đậu nành bằng phương pháp chuyển gen 26 1.6 Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong phân tích cây chuyển gen 32 1.6.1 Phương pháp thử in vitro và ex vitro khả năng biểu hiện gen chọn lọc bar của cây chuyển gen 32 1.6.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền dùng polymerase) 32 1.6.3 Điện di trên gel agarose 34 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35 2.1 Vật liệu 35 2.1.1 Đậu nành… 35 2.1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và plasmid 36 2.1.3 Vật liệu cho các thí nghiệm sinh học phân tử 36 2.2 Phương pháp 38 iii 2.2.1 Tách chiết plasmid pZY 101 – Tnt1 và kiểm tra sự hiện diện của Tnt1 bằng phản ứng enzyme cắt giới hạn 38 2.2.2 Khử trùng và gieo in vitro hạt đậu nành 39 2.2.3 Các bước thực hiện quy trình chuyển gen bằng A. tumefaciens trên mẫu lá mầm cây đậu nành 40 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển gen………. 43 2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của tuổi lá mầm đậu nành lên hiệu quả chuyển gen 44 2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả chuyển gen 44 2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen 45 2.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 sau khi đồng nuôi cấy……… 45 2.2.9 Chọn lọc chồi chuyển gen, ra rễ và chuyển cây ra vườn ươm 47 2.2.10 Kiểm tra sự biểu hiện của gen bar ở cây chuyển gen ngoài vườn ươm bằng phương pháp leaf – painting 48 2.2.11 Tách chiết DNA cây chuyển gen giả định và kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong genome bằng phương pháp PCR 49 2.3 Phương pháp xử lí số liệu 50 2.4 Điều kiện thí nghiệm 50 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52 3.1 Tách chiết plasmid pZY 101 – Tnt1 và kiểm tra sự hiện diện của Tnt1 bằng phản ứng enzyme cắt giới hạn 52 3.2 Khử trùng và gieo in vitro hạt đậu nành 53 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển gen 54 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tuổi lá mầm đậu nành lên hiệu quả chuyển gen 56 iv 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả chuyển gen 60 3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen 62 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 sau khi đồng nuôi cấy…… 64 3.7.1 Ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự phát triển của vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 64 3.7.2 Ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ A. tumefaciens ra khỏi mẫu chuyển gen qua các giai đoạn nuôi cấy……… 66 3.8 Chọn lọc chồi chuyển gen, ra rễ và chuyển cây ra vườn ươm 69 3.9 Kiểm tra sự biểu hiện của gen bar ở cây chuyển gen ngoài vườn ươm bằng phương pháp leaf – painting 71 3.10 Tách chiết DNA cây chuyển gen giả định và kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong genome bằng phương pháp PCR 73 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 4.1 Kết luận 76 4.2 Đề nghị 77 5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone Asp Asparagine BA 6 – Benzyladenin Bp Base pair Cfu Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony forming unit) DNA Deoxyribonucleic Acid DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamine tetracetic acid GA 3 Gibberellic acid Glu Glutamine GM Môi trường nảy mầm (Germination medium) IAA Indole – 3 – acetic acid IBA Indole – 3 – butyric acid MES 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid MPN Meropenem OD Mật độ quang (Optical density) PCR Polymerase Chain Reaction RM Môi trường ra rễ (Rooting medium) Rpm Vòng/phút (Revolutions per minute) SE Môi trường kéo dài chồi (Shoot elongation medium) SI Môi trường cảm ứng tạo chồi (Shoot induction medium) TAE Tris - acetate - EDTA UV Ultra – Violet vi DANH MỤC HÌNH TỔNG QUAN Hình 1. 1: Cây đậu nành 3 Hình 1. 2: Các quốc gia chính sản xuất đậu nành trên thế giới, thống kê năm 2009 4 Hình 1. 3: Tái sinh in vitro cây đậu nành thông qua việc tạo phôi soma 6 Hình 1. 4: Một số sản phẩm từ đậu nành 7 Hình 1. 5: Trồng và thu hoạch đậu nành tại Mỹ 7 Hình 1. 6: Agrobacterium tumefaciens 8 Hình 1. 7: Cấu tạo của Ti plasmid 9 Hình 1. 8: Mô hình phân tử quá trình xâm nhiễm của A. tumefaciens 10 Hình 1. 9: Sơ đồ cấu trúc các loại retrotransposon. 22 Hình 1. 10: Cơ chế chuyển vị của DNA transposon và retrotransposon 22 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Hình 2. 1: Cấu trúc plasmid pZY 101 và pSH – Tnt1. 36 Hình 2. 2: Bình hút ẩm dùng để khử trùng (A) và hạt đã khử trùng trên môi trường GM (B) 40 Hình 2. 3: Quy trình tạo vết thương trên vùng nốt lá mầm. 41 Hình 2. 4: Mẫu lá mầm đậu nành sau khi ủ chung với vi khuẩn trên môi trường đồng nuôi cấy. 42 Hình 2. 5: Khuẩn lạc A. tumefaciens AGL1 mang plasmid pZY 101 – Tnt1 trên môi trường YEP + 30 mg/l rifampicin + 100 mg/l spectinomycin. 42 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Hình 3. 1: Kết quả điện di plasmid pZY 101 – Tnt1 và plasmid pZY 101 – Tnt1 cắt với enzyme EcoRI 52 Hình 3. 2: Hạt đậu nành giống Maverick đã khử trùng (A) và nảy mầm 5 ngày trên môi trường GM (B) 53 Hình 3. 3: Biểu đồ ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển gen. 55 vii Hình 3. 4: Ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển gen sau 2 tuần nuôi cấy 55 Hình 3. 5: Biểu đồ ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen cây đậu nành. 57 Hình 3. 6: Ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen qua các giai đoạn nuôi cấy: A – giai đoạn tái sinh, B – giai đoạn chọn lọc, C – giai đoạn kéo dài lần cấy chuyền thứ 1, D – giai đoạn kéo dài lần cấy chuyền thứ 2. 58 Hình 3. 7: Chồi trên môi trường SI không glufosinate (A) và có 10 mg/l glufosinate (B) quan sát dưới kính lúp 59 Hình 3. 8: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả biến nạp gen 61 Hình 3. 9: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen. 62 Hình 3. 10: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen qua các giai đoạn nuôi cấy. 63 Hình 3. 11: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp timentin lên sự phát triển của A. tumefaciens AGL1. 65 Hình 3. 12: Biểu đồ ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên hiệu quả chuyển gen qua các giai đoạn nuôi cấy. 67 Hình 3. 13: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ A. tumefaciens ra khỏi mẫu qua các giai đoạn nuôi cấy 68 Hình 3. 14: Chọn lọc chồi và ra rễ in vitro 70 Hình 3. 15: Cây đậu nành chuyển gen trong phòng tăng trưởng 71 Hình 3. 16: Cây đậu nành chuyển gen sau 15 ngày chuyển ra nhà kính. 72 Hình 3. 17: Thử nghiệm leaf – painting ngoài vườm ươm 73 Hình 3. 18: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen bar 74 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Hình 4. 1: Quy trình chuyển gen trên đậu nành bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens. 77 [...]... từ cây thuốc lá), Ac/Ds (phân lập từ cây bắp) và mPing (phân lập trên lúa)… Trong thời gian gần đây ở nước ta đã có nhiều nghiên cứu về chuyển gen vào thực vật gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumafaciens, tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu được thực hiện trên cây đậu nành Do đó, mục đích nghiên cứu của luận văn Chuyển gen Retrotransposon Tnt1 vào cây đậu nành (Glycine max) bằng phương pháp. .. dầu sinh học… Kể từ khi nghiên cứu chuyển gen trên cây đậu nành đầu tiên được công bố vào năm 1988 (Hinchee và cộng sự, 1988; McCabe và cộng sự, 1988), đậu nành biến đổi gen đã được nghiên cứu phát triển và nhân giống rộng rãi bởi các 2 nhà sản xuất của Mỹ, Argentina, Canada, Brazil…77% đậu nành thương mại hóa trên thị trường là đậu nành đã biến đổi gen Genome của đậu nành cũng đã được giải trình tự trong... quá trình chuyển gen 66 1 MỞ ĐẦU Thuốc lá chuyển gen ra đời đầu tiên năm 1983 đã mở đầu cho sự phát triển và tiến bộ của cây chuyển gen Các loại cây trồng chuyển gen như đậu nành, bông vải, bắp, lúa và các loại cây cảnh đã được nghiên cứu rộng rãi và thương mại hóa trên thế giới Theo thống kê của ISAAA (2010), có 14 triệu nông dân, ở 25 quốc gia, trồng 134 triệu hecta cây biến đổi gen vào năm 2009,... phương pháp Agrobacterium tumefaciens là tối ưu hóa một số thông số của qui trình chuyển gen dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên cây đậu nành, đồng thời thử nghiệm biến nạp gen mã hóa retrotransposon Tnt1 nhằm tạo ra các quần thể mang đột biến chèn cho nghiên cứu kiểu hình và làm vật liệu cho các nghiên cứu di truyền ngược tìm hiểu chức năng của gen Trang 3 1 TỒNG QUAN 1.1 Cây đậu nành 1.1.1... Ngoài ra, đậu nành còn chứa một lượng lớn phytic acid – một chất chống oxy hóa có tác dụng giảm ung thư, tiểu đường và chứng sưng viêm [38], [42], [67] 1.1.6 Nuôi cấy mô, tạo vật liệu cho quá trình chuyển gen ở cây đậu nành [50] Một trong những điều kiện cần thiết và trước tiên nhất cho mọi quy trình chuyển gen là khả năng nhân giống cây trong điều kiện in vitro Có hai phương pháp tái sinh cây đậu nành. .. trên 2 triệu đồng [66] 1.2 Chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1.2.1 Phân loại vi khuẩn A tumefaciens Ngành: Proteobacteria Lớp: Alpha Proteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Rhizobiaceae Loài: Agrobacterium tumefaciens Hình 1 6: Agrobacterium tumefaciens [62] 1.2.2 Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh của A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn... hiện của gen ở thực vật một lá mầm Việc chèn này không chỉ làm gia tăng hiệu quả biến nạp (vì nó nâng cao sự biểu hiện của htp), làm giảm số bản sao của gen chọn lọc, mà còn điều khiển sự phát triển của A tumefaciens trong quá trình biến nạp [33] 1.3 Một số phương pháp chuyển gen khác Tổng quan Trang 18 1.3.1 Phương pháp bắn gen Bắn gen là một phương pháp có vai trò quan trọng để thực hiện chuyển gen trên... truncatula (Trieu và cộng sự, 2000) [41] 1.3.4 Phương pháp Floral-dip Ở phương pháp này, cây chuyển gen được tạo ra bằng cách ngâm hoa trực tiếp vào dịch vi khuẩn A tumefaciens Ưu điểm của phương pháp Floraldip là không cần phải nuôi cấy in vitro, do đó có thể loại trừ nguy cơ biến dị soma (Clough và cộng sự, 1998) Sau đó, phương pháp này còn thành công trên cây Arabidopsis thaliana với mô mục tiêu là... kỹ thuật duy nhất đáng tin cậy để chuyển gen vào các bào quan như nhân, ty thể, lục lạp Ưu điểm của bắn gen so với các phương pháp khác là đơn giản và nhanh chóng, phù hợp cho các nghiên cứu biểu hiện gen Vùng mô đích để chuyển gen bằng phương pháp này cũng rất đa dạng và thành công trên nhiều đối tượng thực vật như phôi sinh dưỡng, phôi sinh dục còn non (đu đủ, đậu nành) , phôi trong dịch treo tế bào... lá, đu đủ)…[35] 1.3.2 Phương pháp SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium- mediated transformation) Đây là phương pháp biến đổi dựa trên phương pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn A tumefaciens Người ta xử lý mô cấy bằng sóng siêu âm trong một thời gian ngắn với sự hiện diện của A tumefaciens Sóng siêu âm sẽ tạo ra rất nhiều vết thương nhỏ và đồng đều trên mô cấy, cho phép A tumefaciens xâm nhiễm . luận văn Chuyển gen Retrotransposon Tnt1 vào cây đậu nành (Glycine max) bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens là tối ưu hóa một số thông số của qui trình chuyển gen dùng vi khuẩn Agrobacterium. dinh dưỡng của hạt đậu nành 5 1.1.6 Nuôi cấy mô, tạo vật liệu cho quá trình chuyển gen ở cây đậu nành 5 1.1.7 Giá trị thương mại của cây đậu nành 7 1.2 Chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp sử. NHIÊN oOo TRẦN LÊ LƯU LY CHUYỂN GEN RETROTRANSPOSON Tnt1 VÀO CÂY ĐẬU NÀNH (Glycine max) BẰNG PHƯƠNG PHÁP Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ