Đang tải... (xem toàn văn)
Phụ lụcPhần 1 Giới thiệu về phương pháp PCR1.1Khái niệm21.2 Lịch sử phát triển21.3Nguyên tắc phương pháp PCR51.4Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR91.5Giải pháp tối ưu hóa cho phản ứng PCR111.6Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR131.7Ứng dụng của PCR15Phần 2 Ứng dụng của PCR trong kỹ thuật DGGE2.1Khái niệm DGGE162.2Ứng dụng của kỹ thuật DGGE16Phần 3 Ứng dụng3.1 Ứng dụng 1: Nghiên cứu khả năng phân hủy dioxin và phân loại gen mã hóa dioxin dioxingienaza của hỗn hợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20 từ đất nhiễm độc hóa học tại Đà Nẵng173.2 Ứng dụng 2: Xác định cấu trúc và sự đa dạng của tập đoàn vi khuẩn khử sunfate trong mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ dioxin tại sân bay Đà Nẵng bằng kỹ thuật PCRDGGE26
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ Phụ lục PHẦN 1 GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP PCR 1.1 Khái niệm PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp invitro để tổng hợp và khuếch đại một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase. 1.2 Lịch sử phát triển 1.2.1 Lịch sử ra đời phương pháp PCR Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này. 1 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase. DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng nhân DNA khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung. Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96°C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR. Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110°C. DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA. Từ đó, không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn. Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể 2 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA. PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = kilo cặp base=1000 cặp base). DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọi là cặp base. Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base. Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng. 1.2.2 Hai bước tiến quan trọng đã đưa PCR đến cuộc đại cách mạng sinh học phân tử a, Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ Chính việc phát hiện được các men polymerase chịu nhiệt là bước tiến đầu tiên đã làm thử nghiệm PCR trở nên đơn giản hơn. Chúng ta thử tưởng tượng nếu không có men polymerase chịu nhiệt thì thử nghiệm PCR sẽ phức tạp và kém hiệu quả như thế nào khi mà cứ sau mỗi chu kỳ nhiệt lại phải thêm men polymerase mới vào vì men cũ đã bị hủy bởi nhiệt độ trong chu kỳ nhiệt trước đó? Cũng nhờ sự sử dụng các men polymerase chịu nhiệt mà giai đoạn bắt cặp của đoạn mồi vào nucleic acid đích được đặc hiệu hơn vì được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, do đó phản ứng PCR trở nên đặc hiệu hơn. Cho đến nay, đã có hàng chục loại polymerase chịu nhiệt đã được phát hiện và tổng hợp ra. Có những men polymerase trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu),. Có những men polymerase chịu nhiệt được tổng hợp từ các vi khuẩn không chịu nhiệt nhưng mang gen tái tổ hợp từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Ampli Taq, Vent (exo),. Có những men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3’-5’exonuclease) như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu,. Nhờ vậy mà người dùng có rất nhiều chọn lựa để sử dụng cho đúng mục đích của mình. 3 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ Thermus aquaticus Thermus thermophiles b, Máy chu kỳ nhiệt Máy PCR Trước đây, khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR được thực hiện bằng cách liên tục chuyển các ống nghiệm phản ứng PCR vào các máy cách thủy có nhiệt độ khác nhau để tạo ra được các chu kỳ nhiệt cho phản ứng. Sau đó công việc bằng tay nhàm chán và nặng nhọc này được thay thế bằng các robot tương đối cồng kềnh và đắt tiền. Ngày nay, thử nghiệm PCR được thực hiện trong các buồng ủ PCR của máy chu kỳ nhiệt, còn gọi là máy luân nhiệt. Một cách tổng quát, máy luân nhiệt gồm các bộ phận chính như sau: • Một bàn phím đơn giản để lập các chương trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnh lệnh để máy thực hiện. • Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình đã nạp vào máy, thực hiện các mệnh lệnh đến buồng ủ PCR, cũng như ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR trong các chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang được thực hiện. • Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua sự điều khiển của bộ vi xử lý. Trong các chu kỳ nhiệt, nhiệt độ trong buồng ủ PCR có thể đưa lên 4 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ cao hay hạ xuống thấp trong một thời gian rất ngắn. Ðể làm thay đổi được nhiệt độ trong buồng ủ PCR, có hai phương pháp: 1. Liên tục thổi lên buồng ủ những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát nhiệt, hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạch. Với phương pháp này, máy luân nhiệt hãy còn tương đối cồng kềnh, khá đắt tiền và khi máy hoạt động âm thanh cũng khá ồn ào. 2. Phương pháp thứ hai hoạt động dựa theo hiệu quả Peltier ngược. Hiệu quả Peltier là nguyên tắc của các máy đo nhiệt độ điện tử: Khi áp hai mảnh kim loại vào nhau và khi có sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại thì sẽ sinh ra một dòng điện và chính sự lưu thông của dòng điện này khi đo lường ra sẽ phản ánh sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại. Hiệu quả Peltier ngược lại vận hành theo kiểu ngược lại, nghĩa là khi tạo ra một dòng điện giữa hai mãnh kim loại thì sẽ tạo ra được một sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh: bên này nóng, bên kia lạnh. Khi thay đổi chiều dòng điện thì nhiệt độ của hai mãnh cũng thay đổi ngược lại: bên này lạnh, bên kia nóng. Các máy chu kỳ nhiệt hiện nay đều được chế tạo dựa theo phương pháp thứ hai này, nhờ vậy mà máy trở nên rất gọn nhẹ, giá thành rẽ hơn gấp nhiều lần so với trước đây. 1.3 Nguyên tắc phương pháp PCR Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể như: Đoạn DNA cần nhân bản phải mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu, điều kiện môi trường thích hợp và enzym DNA polymerase. Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (94oC) tháo xoắn thay cho helicase kết hợp với enzym DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động. Nhờ kỹ thuật PCR mà với một lượng nhỏ DNA ban đầu chúng ta có thể thu được đủ lượng DNA cần thiết để tiến hành các thí nghiệm về DNA. Một phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài chuỗi. Giai đoạn biến tính (denaturation): Tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch đơn. Phân tử DNA sợi đôi được hình thành bởi mối liên kết hydro giữa hai mạch đơn. Trong quá trình biến tính, nhiệt độ phản ứng gia tăng lên nhanh chóng đến 95oC và giữ ở nhiệt độ này trong khoảng 15-50 giây. Ở nhiệt độ này mối liên kết hydro giữa hai mạch 5 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ đơn của phân tử DNA sợi đôi bị phá vỡ. Trong giai đoạn bắt cặp tiếp theo, nhiệt độ phản ứng giảm nhanh chóng làm cho mối liên kết hydro ban đầu không hình thành lại được kết quả làm tạo thành hai phân tử DNA mạch đơn. Tuy nhiên, việc tăng nhiệt độ đột ngột hoặc thời gian biến tính kéo dài có thể làm giảm hoạt tính của enzyme DNA polymerase. Đối với những enzyme DNA polymerase được sử dụng trong phản ứng PCR, nhiệt đô ở giai đoạn biến tính thường từ 95 0 C đến 98 0 C. Về thời gian biến tính, đối với các genome lớn như thực vật thường giai đoạn biến tính được kéo dài trong 5 phút. Ngoài ra, sau khi đã tối ưu phản ứng PCR, để giảm sự ảnh hướng của nhiệt độ và thời gian biến tính đối với sự hoạt động của enzyme DNA polymerase, enzyme này có thể được bổ sung sau khi kết thúc giai đoạn biến tính ban đầu. Đối với mỗi hệ thống luân nhiệt của các hang sản xuất khác nhau, tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ là khác nhau. Giai đoạn bắt cặp (anealation): Gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung. Trong giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ lai thường duy trì khoảng 50- 600C, trong thời gian 15-60 giây. Quá trình này giúp cho các mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự đích (DNA hoặc cDNA) tại vị trí mong muốn. Nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào số lượng G, C có trong mồi (primer). Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường hoạt động ở Tm thấp nhất + 3°C. Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường thấp hơn Tm thấp nhất, có thể dùng grandient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ưu (khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thường là 0.5°C). Đối với các cặp Tm cao hoặc tự bắt cặp, có loop thì có thể khắc phục bằng PCR 2 bước (95°C và 68°C). Giai đoạn kéo dài chuỗi (elongation): Tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc. Sau khi mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sung với trình tự đích, nhiệt độ của phản ứng lại nhanh chóng chuyển về nhiệt độ thích hợp với hoạt động của enzyme DNA polymerase thường là 720C và giữ ở nhiệt độ này 30 giây đến 2 phút tùy theo chiều dài của đoạn DNA đích cần tổng hợp. Trong quá trình tổng hợp DNA polymerase sẽ lấy nucleotide (A, T, G, C) từ môi trường phản ứng để gắn vào đầu 3’ của mồi (primer) theo nguyên tắc bổ sung với trình tự trên phân tử DNA hoặc cDNA đích. Năng lượng dùng trong quá trình gắn kết này là ATP cũng có trong môi trường phản ứng. Kết quả quá trình này phản ứng PCR đã tạo ra hai phân tử DNA mạch đôi mới từ một phân tử DNA mạch đôi ban đầu. Nhiệt độ kéo dài thường tiến hành ở 72°C tuy nhiên, hoạt tính 5'-3' DNA polymerase vẫn xảy ra ở nhiệt độ 68°C. Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase, chiều dài sản phẩm và loại template. 1) Đối với DNA đồng nhất (plasmid, lambda hoặc BAC DNA) thì tốc độ có thể đạt tới 15s/kb; 2) đối với DNA genome lớn, phức tạp thì tốc độ thường 30s- 1min/kb. Như vậy sau nhiều chu kỳ khuyếch đại (thường từ 30-40 chu kỳ) từ một phân tử đích ban đầu phản ứng PCR đã tạo ra vô số phân tử bản sao (khoaûng 106 baûn sao) có kích thước 6 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ xác định mong muốn. Cuối cùng sản phẩm PCR được nhuộm với Ehididum bromide và đem quan sát sự phát quang dưới tia UV (bước sóng 312 nm) sau khi phân tách sản phẩm PCR trên gel. Sơ đồ tổng hợp nguyên tắc của phương pháp PCR 7 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ 1.4 Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR 1.4.1 Mồi Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Việc lựa chọn mồi tuân theo các quy tắc đơn giản sau: chiều dài mồi khoảng 18 - 24bp hoặc hơn và phần trăm GC chiếm 35%-60%, do vậy, nhiệt độ gắn mồi vào khoảng 55-58 0 C hoặc cao hơn. Những mồi dài hơn (mồi DMD, 28-30bp) cho phép phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ gắn mồi cao hơn và thu được ít sản phẩm không đặc hiệu hơn. Để kiểm tra các trình tự có khả năng lặp lại, các mồi sử dụng đã được đối chiếu với cơ sở dữ liệu trình tự tại Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học (National Center for Biotechnology Information - NCBI) sử dụng các công cụ tìm kiếm (Basic Local Alignment Search Tool - BLAST). 1.4.2 DNA mẫu Kết quả phản ứng PCR lệ thuộc rất lớn vào DNA mẫu. • Phản ứng PCR tối ưu khi DNA thật tinh sạch. Bụi bẩn sẽ làm giảm đáng kể hiệu suất của phản ứng. Tuy nhiên nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả đối với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào hoặc ngay cả mẫu DNA không được bảo quản tốt • Phản ứng PCR tối ưu cũng lệ thuộc vào lượng bản mẫu. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) khi sử dụng các DNA polymerase cho hiệu quả cao. Việc giảm lượng mẫu còn hạn chế được sự khuếch đại ký sinh tạo những sản phẩm phụ không mong muốn. 8 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ 1.4.3 Enzyme Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. Ðây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp. Hiện nay, một số enzyme mới có hiệu quả hơn. DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi khuẩn hiện diện trong suối nước nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này được viết tắt Taq polymerase. Tth polymerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mn 2+ ; ngược lại, khi khuôn là DNA và có ion Mg 2+ , enzyme này lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. Nồng độ enzyme được khuyến cáo là 1- 2,5 đv/1µl. Nồng độ phản ứng quá cao hoặc quá thấp đều khiến phản ứng không đạt kết quả tốt. Tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc vào hoạt tính 3´-5 ´exonuclease. Tùy thuộc mục đích thí nghiệm mà cần lựa chọn loại DNA polymerase co hay không có hoạt tính. 1.4.4 dNTP • Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200µM/mỗi nucleotide. Nồng độ thích hợp trên cho kết quả ổn định, trung thực và chính xác. • Nồng độ của các dNTP phải bằng nhau để giảm các lỗi sao chép của Taq polymerase, tránh sự gắn kết nhầm lẫn mã di truyền. 1.4.5 Nồng độ ion Mg 2+ Mg2+ là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA polymerase chịu nhiệt thường dùng. • Nồng độ Mg2+ quá thấp (<0,5mM) làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế. • Nồng độ Mg2+ quá thừa làm ổn định sự bắt cặp sai của mồi với khuôn, dẫn đến nhiều sản phẩm không đặc hiệu. • Nồng độ tối ưu của Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. 9 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ 1.4.6 Chu kỳ của phản ứng PCR Trong thực tế, số lượng chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40 chu kỳ do hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau. 1.4.7 Biến tính • Việc tăng nhiệt độ hoặc thời gian kéo dài thời gian biến tính có thể làm tăng tính đặc hiệu của PCR nhưng làm giảm tuổi thọ của enzyme DNA polymerase. • Đối với những enzyme DNA polymerase bền nhiệt thường nên sử dụng nhiệt độ biến tính 95ºC-98ºC. Bao gồm bước biến tính dài lúc khởi đầu và một bước biến tính ngắn trước từng chu kỳ nhiệt. • Đối với từng genome lớn như thực vật thường sử dụng bước biến tính dài đến 5min. Để làm giảm ảnh hưởng đối với enzyme thì có thể bổ sung enzyme DNA polymerase sau khi biến tính ban đầu. • Khi đã tối ưu phản ứng PCR thì cần giảm tối thiểu thời gian biến tính mỗi chu kỳ để tăng lượng sản phẩm. Thông thường là từ 10s-30s. • Tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ ở mỗi hệ thống luân nhiệt là khác nhau phụ thuộc hãng sản xuất. Một số hệ thống cho phép thay đổi thông số này khi PCR tối ưu. 1.5 Giải pháp tối ưu hóa cho phản ứng PCR Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các DNA khác có trong phòng thí nghiệm (vi khuẩn, virus, DNA , ). Vì vậy các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quy trình DNA, ngoài ra còn có phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong một khu vực riêng biệt. Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị phòng riêng biệt với đèn UV. Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như thay thế các pipet. Thuốc thử dùng trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục đích này. Các mẫu phải được giữ riêng biệt với các mẫu DNA khác. Phản ứng có kiểm soát (kiểm soát bên trong), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải luôn được htực hiện, để kiểm tra sự nhiễm bẩn. Các giải pháp cụ thể: Không có sản phẩm hoặc lượng sản phẩm quá thấp: 10 [...]... 1 ,2, 3,4,7,8 HxCDD 0 ,22 0,177 1 ,2, 3,6,7,8 HxCDD 0,956 0,834 1 ,2, 3,7,8,9 HxCDD 1 ,2, 3,4,6,7,8 HpCDD 0,566 0,356 0,495 0,307 1 ,2, 3,4,6,7,8,9 OCDD 0,89 0,737 2, 3,7,8 TCDF 8,433 7,313 1 ,2, 3,7,8 PeCDF 2, 3,4,7,8 PeCDF 0,040 0, 923 0,037 0,744 1 ,2, 3,4,7,8 HxCDF 0,098 0,0 82 1 ,2, 3,6,7,8 HxCDF 0,036 0 1 ,2, 3,7,8,9 HxCDF 0 0 2, 3,4,6,7,8 HxCDF 0,031 0,038 1 ,2, 3,4,6,7,8 HpCDF 0,038 0,031 1 ,2, 3,4,7,8,9 HpCDD 0 0 1 ,2, 3,4,6,7,8,9... đồng thời nhiều vi sinh vật khác nhau 13 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ 1.7 Ứng dụng của PCR • • • • • • • • Sử dụng PCR để tạo nhanh các gen tổng hợp Tạo dòng cDNA Gây đột biến điểm Xác định kiểu gen của các đột biến So sánh mức độ biểu hiện của gen Vân tay di truyền Kiểm tra huyết thống Ưng dụng trong chẩn đoán lâm sàng PHẦN 2 ỨNG DỤNG CỦA PCR TRONG KỸ THUẬT DGGE 1.Khái niệm DGGE... Sarcina 3 .2 Khả năng sử dụng dioxin và furan trong dịch nuôi cấy của mẫu có SETDN20 Độ tồn lưu của dioxin và furan trong dịch nuôi cấy của mẫu có SETDN20 và mẫu đối chứng (không có vi sinh vật) được trình bày ở bảng 1 Nồng độ độc tương đương (pg TEQ/I ml) Tên đồng phân Đối chứng không có VSV Hỗn hợp vi khuẩn kị khí SETDN20 PCDDs 19 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 2, 3,7,8-TCDD GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ 427 2,774 3506,466... 1 ,2, 3,4,6,7,8,9 OCDF 0,0 02 0,001 429 9 ,24 3 3 528 ,7 42 0 17,9% 1 ,2, 3,7,8 PeCDD PCDFs Tổng số độc Phần trăm phân hủy Bảng 1.Khả năng sử dụng các đồng phân PCCDs và PCDFs của hỗn hợp vi khuẩn SETDN20 Hỗn hợp chủng SETDN20 sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường xử lý có bổ sung dịch chiết đất đã loại bỏ 17,9% tổng độ độc, trong đó 2, 3,7,8-TCCD giảm từ 429 9 ,24 3 pg TEQ/ml xuống còn 3 528 ,742pg TEQ/ml So với một số... http://d.violet.vn/uploads/resources /20 4/1137338/preview.swf 9 Bản chất của kỹ thuật PCR from http://luanvan.co/luan-van/ban-chat-cua-ky-thuat -pcr- 3196/ 10 Đề tài phương pháp PCR from http://www.zun.vn/tai-lieu/de-tai-phuong-phap -pcr- 4854/ 11 PCR from http://vi.wikipedia.org/wiki /PCR 12 Ứng dụng của PCR trong y học from http://www.bvtwhue.com.vn/index.asp? folder=HDCM&lang=vn&q=10 13 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng from http://duybiotech.wordpress.com /20 10/08 /29 /cac-k... Hằng Đặng Thị Cẩm Hà, 20 07: Tạp chí công nghệ sinh học, 5(4): 523 - 528 5 Nguyễn Bá Hữu,Đàm Thúy Hằng Đặng Thị Cẩm Hà: Tạp chí khoa học và công nghệ, tập 46, số 6, 20 08 Tr 59-65 6 Vân, N.T.B., Bài giảng thí nghiệm cơ sở di truyền và công nghệ gen 20 10 7 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) from http://www.zjpostdoctor.com/userfiles/file/13093318 829 705.pdf 8 Phương Pháp PCR from http://d.violet.vn/uploads/resources /20 4/1137338/preview.swf... -20 ºC đến khi sử dụng 2) Đoạn gen mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn KSF được nhân lên nhờ kỹ thuật PCR lồng Đầu tiên, đoạn gen gần 1.500 bp của vi khuẩn được nhân lên bừng phản ứng PCR với DNA tổng số mẫu bùn, cặp mồi 27 F và 142R Phản ứng PCR tiếp theo sử dụng DNA khuôn từ sản phẩm PCR kể trên với cặp mồi đặc hiệu (DCC305GC và DSV838) cho một số nhóm vi khuẩn KSF 3)Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: 94-... dioxygenaza có độ dài khoảng 700 bp bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi DF, DR với thể tích là 25 µl, thành phần phản ứng gồm 2, 5 µl PCR buffer 10x, 4 mM MgCl2, 0 ,25 mM hỗn hợp dNTPs, 20 pM mỗi loại mồi DF và DR, 1 đơn vị Taq AND polymeraza, nhiệt độ gắn mồi là 50ºC Sản phẩm PCR được điện di trên gel agaroza nồng độ 0,8 %, sau đó gắn trực tiếp vào vector PCRR 2. 1 nhờ biến nạp vào chủng E.coli INV F' và chọn... khuôn và chạy lại PCR ở cùng điều kiện phản ứng như lần đầu Kết quả vẫn chỉ được một đoạn ADN (sản phẩm PCR) có kích thước như ban đầu khoảng 700 bp (hình 3, giếng 2) 22 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ ADN plasmit có mang sản phẩm PCR như mong muốn đã được tách và làm sạch lượng lớn phục vụ cho đọc trình tự Trình tự gen dioxin dioxygenaza của SETDN20 được xác định tren máy đọc trình tự tự... tích tính đa dạng vi sinh vật cần sử dụng DNA chung của quần thể vi sinh vật chứ không thể sử dụng DNA của các vi sinh vật nuôi cấy thuần khiết PHẦN 3 ỨNG DỤNG Ứng dụng 1 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DIOXIN VÀ PHÂN LOẠI GEN MÃ HÓA DIOXIN DIOXINGIENNAZA CỦA HỖN HỢP CHỦNG VI KHUẨN KỊ KHÍ KHÔNG BẮT BUỘC SETDN20 TỪ ĐẤT NHIỄM ĐỘC HÓA HỌC TẠI ĐÀ NẴNG 1 MỞ ĐẦU 15 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ . sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR (gọi là phản ứng Multiplex PCR) để có thể phát hiện đồng thời nhiều vi sinh vật khác nhau. 13 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ 1.7 Ứng. Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. 9 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ 1.4.6 Chu kỳ của phản ứng PCR Trong thực tế, số lượng chu kỳ của phản ứng PCR. sóng 3 12 nm) sau khi phân tách sản phẩm PCR trên gel. Sơ đồ tổng hợp nguyên tắc của phương pháp PCR 7 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ 1.4 Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR 1.4.1