1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đương đầu với đại dịch HIV/AIDS nguy hiểm, có tốc độ lây truyền cao, chưa có vắc xin phịng bệnh chưa có thuốc điều trị đặc hiệu HIV/AIDS không nguyên nhân cướp hàng triệu sinh mạng người giới mà hiểm họa tác động nghiêm trọng đến khía cạnh đời sống xã hội, làm ảnh hưởng tới kinh tế, văn hóa, xã hội nịi giống quốc gia Đại dịch HIV/AIDS tiếp tục lan rộng toàn cầu với tốc độ 13.000 ca nhiễm ngày Theo báo cáo Tổ chức phòng chống AIDS Liên Hợp Quốc (UNAIDS) Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tồn giới có khoảng 40,3 (36,7- 45,3) triệu người sống với HIV/AIDS khoảng 25 triệu bệnh nhân tử vong (UNAIDS/WHO, 2010) Như vậy, kể từ bắt đầu đại dịch đến nay, giới có tới gần 65 triệu người nhiễm HIV Trong năm 2008, có 2,7 (2,4- 3,0) triệu trường hợp nhiễm 2,0 (1,7-2,4) triệu bệnh nhân AIDS chết (UNAIDS/WHO, 2009), điều có nghĩa phút có 5,1 trường hợp nhiễm 3,8 trường hợp chết AIDS 6-7 giây có trường hợp nhiễm 14-16 giây có người chết AIDS giới Đông Nam Á Đông Âu khu vực có tốc độ lây nhiễm HIV cao thơng qua đường tiêm chích ma túy Việt Nam xếp vào danh sách nước có tỷ lệ nhiễm HIV cao giới khu vực Theo Bộ Y tế, Việt Nam nước có số lượng người nhiễm HIV cao thứ Châu Á Ở Việt Nam 15 phút lại có người bị nhiễm HIV Số lượng người nhiễm HIV/AIDS gia tăng kéo theo nhu cầu chăm sóc hỗ trợ ngày tăng Theo đánh giá Tổ chức Y tế giới, HIV/AIDS xếp hàng thứ nguyên nhân gây tử vong (chiếm 7,5%) nước phát triển, có Việt Nam (Bao, 2009) Sự đa dạng chủng HIV số khó thống kê HIV có khả biến đổi lớn tùy thuộc vào vùng địa lý khác Quá trình xâm nhiễm HIV vào thể vật chủ diễn phức tạp HIV công trực tiếp vào hệ thống miễn dịch thể Hiện nay, việc sử dụng vaccine phòng lây nhiễm HIV khó khăn vaccine phịng chống HIV giai đoạn nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm giá thành cao Vì kiểm sốt ngăn chặn q trình lây nhiễm HIV chủ yếu dựa vào việc phát nguồn bệnh lây lan giai đoạn sớm Chẩn đoán lây nhiễm HIV mối quan tâm toàn cầu Nắm bắt chế lây nhiễm HIV trình đáp ứng miễn dịch theo giai đoạn thể việc công HIV điều quan trọng để ứng dụng nghiên cứu chẩn đoán Các phương pháp chẩn đốn HIV ngày phát triển, địi hỏi chuẩn xác độ nhạy cao để phát sớm HIV sau HIV xâm nhiễm vào thể người Vì vậy, chuyên đề nhằm "Xây dựng quy trình cải tiến kỹ thuật giải trình tự DNA phù hợp việc tiến hành tự động phân tích phần mềm từ phương pháp Sanger kinh điển" HIV VÀ HỆ MIỄN DỊCH 1.1 Các loại tế bào bị nhiễm HIV HIV có khả xâm nhập vào nhiều loại tế bào tế bào máu, tế bào não, tế bào da chủ yếu công vào tế bào TCD4 đại thực bào (Alimonti JB, Ball TB, Fowke KR, 2003) Các loại tế bào bị nhiễm HIV hình Hình 1: Các tế bào bị nhiễm HIV Những tế bào bị nhiễm HIV chết chí sớm mà người ta nghĩ Nếu tế bào nhiễm có chu kỳ sống ngắn điều làm tăng khả trốn thoát virus khỏi kiểm soát hệ thống miễn dịch (Christian L Althaus et al 2009) 1.2 Các giai đoạn dấu hiệu người nhiễm HIV Nhiễm trùng khởi phát Chuyển đổi huyết Nhiễm trùng tiềm tàng Nhiễm trùng cấp 1.2.1 Giai đoạn nhiễm trùng khởi phát (Primary infection) Đây giai đoạn đầu tiên, virus bắt đầu thâm nhập vào thể (http://www.sfaf.org/hiv-info/basics/) Sau từ hai đến bốn tuần 87% người nhiễm HIV trải qua dấu hiệu giống cúm vài ngày, biểu hệ miễn dịch thể bắt đầu chiến đấu với lây nhiễm HIV Những dấu hiệu bệnh bao gồm: sốt, ớn lạnh, đau đầu, đổ mồ hôi (Bradley Hare, 2004) Thông thường từ 6-12 tuần hệ miễn dịch bắt đầu sản xuất kháng thể để chống lại virus Nghĩa máu người nhiễm HIV khơng thể có kháng thể kháng HIV vài tuần Người nhiễm khả lây nhiễm giai đoạn cao số lượng lớn HIV dịch quan sinh dục (NIAID, 2003) Ở giai đoạn kháng nguyên p24 xuất 1.2.2 Giai đoạn chuyển đổi huyết Giai đoạn chuyển đổi huyết miêu tả thời gian thể bắt đầu sản xuất kháng thể kháng lại virus Đây giai đoạn khó chẩn đốn lượng kháng nguyên p24 giảm dần thay xuất kháng thể kháng p24 cịn q Hầu hết người phát triển kháng thể vòng tháng Một vài người tháng phát triển kháng thể kháng HIV(http://www.sfaf.org/hiv-info/basics/) 1.2.3 Thời kỳ nhiễm trùng tiềm tàng (clinical latency) Đây thời kỳ dấu hiệu bệnh hay cịn gọi khơng triệu chứng Phải để người bị nhiễm HIV phát triển dấu hiệu bệnh? Đây câu hỏi khơng có câu trả lời kéo dài từ tháng đến 10 năm chí kéo dài lâu tuỳ thuộc sức khỏe chức hệ miễn dịch thể Mặc dù khơng có dấu hiệu bệnh virus tiếp tục nhân lên công tế bào hệ miễn dịch (NIAID, 2003) Ở giai đoạn nồng độ IgM anti-HIV giảm dần để thay hình thành IgG anti-HIV Ngồi ra, giai đoạn ta tìm thấy kháng nguyên gp120 máu người bệnh Mức độ HIV thể ngưòi nhiễm HIV tương quan với suy giảm tế bào CD4(sự suy giảm hệ miễn dịch) Mức độ HIV tăng, số lượng tế bào CD4 giảm nhanh tiến đến giai đoạn AISD chết (NIAID, 2003) Khi hệ miễn dịch bị phá hủy số người bắt đầu xuất số dấu hiệu nhẹ, không đặc hiệu trình nhiễm HIV, bao gồm: - Nổi hạch vòng tháng - Mệt mỏi - Giảm cân - Thường xuyên sốt đổ mồ hôi - Liên tục nhiễm nấm (miệng âm đạo) - Liên tục phát ban bong da - Khung chậu dễ bị viêm không đáp ứng với thuốc điều trị - Mất trí nhớ thời gian ngắn - Thường xuyên nhiễm herpes miệng, phận sinh dục đau hậu môn - Bệnh zona 1.2.4 Giai đoạn nhiễm trùng cấp (Acute infection) Giai đoạn có xuất hội chứng AIDS Thời kỳ đầu có biểu suy giảm miễn dịch giảm sút tế bào TCD4 rối loạn miễn dịch tế bào lympho B đại thực bào nên lâm sàng có hạch sưng nhiều nơi kéo dài 2-4 tháng điều trị viêm khơng tác dụng Sau đó, hệ miễn dịch suy giảm trầm trọng, hội chứng AIDS xuất toàn diện, người bệnh suy mòn dẫn đến tử vong Trong huyết bệnh nhân thấy xuất trở lại kháng nguyên p24 thấy xuất kháng nguyên gp41, kháng thể kháng gp41, kháng thể kháng gp120 Hình 2: Sự thay đổi số lượng TCD4+ biểu lâm sàng bệnh nhân nhiễm HIV chưa điều trị 1.3 Suy giảm miễn dịch HIV Khi HIV xâm nhập vào thể, khơng làm giảm số lượng mà cịn làm suy giảm chức tế bào miễn dịch đặc biệt tế bào lympho T, lympho B đại thực bào Tuy nhiên, HIV có tính đặc biệt với phân tử CD4 nằm bề mặt tế bào lympho T (tế bào đóng vai trị nhạc trưởng quan trọng huy điều hòa trình đáp ứng miễn dịch) làm ly giải bất hoạt chức tế bào dẫn đến suy giảm tất loại đáp ứng miễn dịch Cơ chế giảm tế bào TCD4 tác động trực tiếp HIV (Bộ Y tế, 2004): - Tế bào TCD4 bị phá hủy HIV xâm nhập nhân lên làm tăng tính thấm màng tế bào, gây ứ đọng calci nước - Khi virus nhân lên giải phóng lượng lớn cDNA, RNA tự bào tương tế bào, gây độc cho tế bào - Dưới tác động HIV làm tế bào TCD4 chết theo chương trình nhanh bình thường - Các phân tử CD4 hình thành bào tương chưa diện bề mặt tế bào bị liên kết với gp120 sản phẩm gp120-CD4 bào tương làm chết tế bào Cơ chế suy yếu tế bào TCD4 tác động gián tiếp HIV - HIV phong bế q trình chín TCD4 chưa bị nhiễm thông qua cytokine tế bào bị nhiễm - Do KN gp120 bề mặt tế bào TCD4 bị nhiễm lại tiếp tục gắn với CD4 TCD4 chưa bị nhiễm tạo thành hợp bào tế bào khổng lồ nhiều nhân có đời sống ngắn khơng q 48 - Do chế tự miễn, gp120 virus bong từ tế bào TCD4 bị nhiễm HIV lại gắn với phân tử CD4 tế bào chưa bị nhiễm nên máu xuất KT kháng gp120 virus làm huỷ hoại tế bào T có cấu trúc bề mặt tương tự gp120 theo chế gây độc tế bào (ADCC) theo chế kết hợp bổ thể - Do HIV phá hủy tế bào nguồn, tế bào non để biệt hoá thành tế bào lympho Do TCD4 giảm số lượng chất lượng, cytokine TCD4 bị thiếu hụt làm giảm khả hỗ trợ hoạt hoá với tế bào lympho B, đại thực bào tế bào lympho T khác dẫn dến hệ thống miễn dịch thể suy giảm miễn dịch dịch thể miễn dịch tế bào 1.4 Chẩn đoán sinh học có suy giảm miễn dịch có rối loạn miễn dịch - Dấu hiệu tin cậy trực tiếp giảm TCD4+ (bình thường 4501280/ mm3) giảm số lượng TCD8+ (bình thường 258- 800/mm3) - Dấu hiệu tin cậy gián tiếp tỷ lệ TCD4+/ T CD8+ giảm (bình thường: 1,4- 2,2) - Qui định : Nếu T CD4+ < 400/mm tiên lượng xấu, chứng tỏ suy giảm miễn dịch đáng kể Nếu T CD4+ < 200 /mm suy giảm miễn dịch nghiêm trọng, giảm lympho B, bình thường 25- 280/mm3 - Theo dõi kháng nguyên p24: + Vừa có giá trị phát sớm bệnh 50-70% (+) giai đoạn sơ nhiễm + Khi có hội chứng AIDS đầy đủ 50-70% (+) trở lại + Bệnh tiến triển trầm lặng kháng nguyên p24 giảm dần theo thời gian - Dấu hiệu gián tiếp suy giảm miễn dịch (Bùi Đại et al, 2000, Nguyễn Triệu Vân et al, 1999) Chẩn đốn phát HIV Chẩn đốn nhiễm HIV thơng thường phát cách gián tiếp thông qua kháng thể đặc hiệu kháng virus (Gurtler 1996) Đây dấu hiệu đáp ứng miễn dịch dịch thể, chống lại tác nhân tìm thấy gần 100% người nhiễm HIV Chẩn đoán trực tiếp lây nhiễm HIV tiến hành nhờ việc xác định virus truyền nhiễm (sử dụng nuôi cấy tế bào thực phịng thí nghiệm an tồn sinh học cấp 3), kháng nguyên virus (ELISA phát hiên kháng nguyên p24) axit nucleic virus (tức gen virus; NAT = phát axit nucleic) Để xác định tình trạng nhiễm trùng bệnh nhân, phát virus trực tiếp cần thiết trường hợp định, chẳng hạn nhiễm trùng nguyên phát nhiễm trùng theo đường từ mẹ sang (mô tả chi tiết dưới) Bên cạnh xét nghiệm định tính ( trả lời câu hỏi "có khơng có"), xét nghiệm đính lượng để phát số lượng virus trở nên quan trọng: Nồng độ virus huyết thanh, gọi "lượng virus", trở thành công cụ thiếu cho việc định hướng liệu pháp kháng retrovirus (Berger 2001) Thuật ngữ "xét nghiệm HIV" (vẫn thường hiểu khơng xác "xét nghiệm AIDS”), nhiên thuật ngữ luôn đề cập đến việc phát kháng thể đặc hiệu kháng HIV, dấu ấn nhiễm trùng HIV * Tiêu chuẩn đánh giá Để đánh giá chất lượng kit, người ta vào hai tiêu chuẩn quan trọng độ nhạy độ đặc hiệu chúng + Độ nhạy - Độ nhạy = số trường hợp dương tính thật/ số trường hợp dương tính thật + số trường hợp âm tính giả PA - Độ nhạy (SE %) = X 100 N+ PA: Tổng số mẫu cho kết dương tính thật ND: Số mẫu cho kết âm tính giả N+: ND + PA + Độ đặc hiệu - Độ đặc hiệu = số trường hợp âm tính thật/ số trường hợp âm tính thật + số trường hợp dương tính giả NA N- 10 Độ đặc hiệu (SP %): SP = X 100% NA: Tổng số mẫu cho kết âm thật PD: Số mẫu cho kết dương tính giả N-: NA + PD 2.1 Những vấn đề chẩn đoán giai đoạn cửa sổ Sau nhiễm HIV phải vài tuần trước kháng thể phát Hiện tượng gọi chẩn đoán cửa sổ xác định giai đoạn thể đòi hỏi sản phẩm phát mức độ kháng thể (Busch 1997) Sự chuyển đổi kháng thể từ âm tính sang dương tính gọi q trình chuyển đổi huyết Những xét nghiệm sàng lọc gần sử dụng chẩn đoán ghi nhận phát HIV sau sáu tuần giai đoạn tiền lây nhiễm vào khoảng 80% sau tuần thứ 12 100%; vài trường hợp phát sau tháng Kỹ thuật sàng lọc hệ thứ cố gắng để rút ngắn thời gian q trình chẩn đốn giai đoạn cửa sổ cách phát đồng thời kháng thể HIV kháng nguyên p24 (Gurtler 1998, Ly 2001) Mặc dù kỹ thuật phát hệ thứ phát sớm giai đoạn tiền nhiễm, giai đoạn cửa sổ lại phát muộn nhiều lý mặt kỹ thuật Thậm chí giai đoạn lại phát (Meier 2001) Trong giai đoạn sớm trình chuyển đổi huyết thanh, kỹ thuật kiểm tra sàng lọc kháng thể cho phản ứng yếu Sử dụng kỹ thuật Western blot để khẳng định giai đoạn không xuất băng xuất không đầy đủ, thường băng p24 xuất nhìn thấy Trong trường hợp thường khó phân biệt với nguời khơng bị lây nhiễm xảy phản ứng không đặc hiệu Đây thông tin quan trọng cho phòng xét nghiệm thấy hết tầm quan trọng trình tiến hành kiểm tra 34 Mỗi cặp mồi gồm mồi xuôi mồi ngược Mồi xi có trình tự acid nucleic tương đồng với trình tự mạch DNA khơng mang mã (mạch antisense), mồi xuôi bắt cặp đầu ’ mạch không mang mã (mạch , - 3’) Mồi ngược có trình tự tương đồng với trình tự mạch DNA mang mã di truyền (mạch sense), mồi ngược bắt cặp với mạch sense đầu , (mạch 3’- 5,) Nồng độ mồi khoảng 0.1- 1μM Nồng độ thường xác định dựa vào giá trị OD (optical density) đo bước sóng 260 nm Mồi chào bán nhiều công ty thương mại Tuy nhiên thực tế nhà nghiên cứu tự thiết kế mồi dựa số nguyên tắc sau: - Có chiều dài khoảng 20-30 nucleotid, đặc hiệu với đoạn gen đích - Có số lượng tương đương nucleotid - Tránh lặp lại trình tự nucleotid đoạn chứa nucleotid giống - Khơng nên có ≥ 3G C đầu , (dễ dẫn đến bắt cặp nhầm vùng DNA khn giàu GC) - Tránh hình thành cấu trúc bậc mồi vùng mồi có khả liên kết bổ sung với - Trình tự nucleotid đầu , khơng liên kết bổ sung với với mồi khác để hình thành phức hợp mồi * Kiểm tra độ tinh định lượng DNA quang phổ kế + Phương pháp đo quang phổ kế cho phép xác định cách tương đối nồng độ DNA có mẫu nghiên cứu, đồng thời kiểm tra độ tinh mẫu tách chiết + Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm bazơ purin primidin Từ giá trị mật độ quang học (OD - Optical Density) bước sóng 260 nm mẫu đo cho phép xác định nồng độ axit nucleic mẫu + Một đơn vị OD tương ứng với nồng độ là: 35 50 µg/ml cho dung dịch DNAsợi đơi µg/ml cho dung dịch RNAhay DNA sợi đơn 40 + Nồng độ DNA hay RNA tính theo cơng thức sau: - Cơng thức tính nồng độ DNA sợi đôi (CADN): CDNA = OD260 x 50 x d d : độ pha lỗng mẫu - Cơng thức tính nồng độ RNA hay DNA sợi đơn (CDNA/RNA): CDNA/RNA = OD260 x 40 x d Cách tính xác dung dịch axit nucleic sau tách chiết tinh giá trị thật nồng độ axit nucleic bị sai lệch protein (cấu trúc từ acid amin thơm dị vòng) sản phẩm tách chiết khơng tinh có khả hấp thụ bước sóng 260 nm Tuy nhiên, protein lại hấp thụ cao bước sóng 280 nm, ta đo thêm bước sóng 280 nm để kiểm tra độ dung dịch Để đánh giá mức độ dung dịch tách, người ta tính tỉ số OD260/OD280 = T Nếu 1,8 < T < 2,0 dung dịch axit nucleic coi tinh + Cách tiến hành đo mật độ quang DNA sản phẩm tách chit bng mỏy NanoDrop: ã Nh 1àl nc ct tinh khiết vơ trùng (đã sử dụng q trình pha loãng DNA tách chiết) vào buồng đọc để xác định kết ống trắng • Trộn nhẹ nhàng sản phẩm tách chiết, ly tâm nhẹ Nhỏ 1µl sản phẩm vào buồng đọc • Máy tự động đánh giá nồng độ DNA độ tinh sản phẩm đồ thị 4.2.2 Tạo DNA chuỗi đơn Thành phần Thể tích/ống (μmol/l) 36 Nước cất tinh Dung dich đệm 5X Oligonucleotid mồi Thuốc nhuộm Big Dye DNA khuôn Tổng Chu trình nhiệt: Bước Biến tính Khuếch đại (25 chu kỳ) Giữ khuôn 4.2.3 Tinh DNA giải trình tự DNA khuếch đại 20 µl 125mM EDTA µl 3M NaOAc µl 99% EtOH 50 µl Tổng : : : : 10,0 3,5 1,5 1,0 4,0 20,0 Nhiệt độ (oC) 96 50 60 Thời gian 10 giây giây phút Dừng 74 µl Votex, giữ nhiệt độ phịng 15 phút Ly tâm lạnh: 14000rpm 20 phút Loại bỏ dịch Bổ xung 70 µl EtOH 70% Lắc nhẹ Ly tâm lạnh: 14000rpm 10 phút Loại bỏ dịch Để khơ nhiệt độ phịng 10 phút Giữ đá – 30oC giải trình tự (tiếp) Bơ xung 25 µl Hi-di formanide 37 Votex spin down 95oC phút Cắm đá 15 phút Cài đặt máy tự động 4.3 Những phương pháp tìm liệu trình tự DNA nghiên cứu 4.3.1 FASTA Đây chương trình tìm kiếm sở liệu có tốc độ nhanh, giới thiệu vào nãm 1988 William Pearson David Lipman FASTA sử dụng nghiên cứu sinh học thực cách quét chuỗi ngắn xác dạng "chữ" Các cặp trình tự týõng ðồng có đoạn ký tự ngắn chung Chương trình FASTA sử dụng hữu ích để so sánh tương đồng hai chuỗi DNA có sẵn http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta/lalign2.htm 4.3.2 BLAST Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) phương pháp sử dụng rộng rãi để tìm kiếm tương đồng giũa trình tự, cơng cụ tìm kiếm gene nhanh dựa lý thuyết thống kê nghiêm ngặt Giống FASTA, BLAST xác định trình tự tương đồng cách tìm kiếm dạng ký tự giúp loại bỏ trình tự khơng thích hợp, làm giảm đáng kể thời gian tìm kiếm Chương trình tìm kiếm ban đầu cho ký tự đoạn DNA có chiều dài định, thường 11 nucleotide 38 Phiên gốc BLAST (được biết đến BLAST 1.4) có lý thuyết thống kê nghiêm ngặt Mặc dù thực tế, chương trình thực tốt cho nhiều mục đích tìm kiếm sinh học có độ nhạy thấp hơn so với thuật tốn Smith-Waterman chương trình FASTA, chạy với thơng số mặc định BLAST chương trình có sẵn để tìm kiếm trang web NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) nhiều trang web khác giới Có ba chương trình làm việc giúp tìm kiếm nucleotide hai chương trình giúp tiềm kiếm trình tự acid amin protein 39 KẾT LUẬN HIV virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải người, đến chưa có vắc xin phịng bệnh chưa có thuốc điều trị đặc hiệu Đại dịch HIV/AIDS tiếp tục lan rộng toàn cầu mối nguy hại cho sức khỏe cộng đồng Vì kiểm sốt ngăn chặn trình lây nhiễm HIV chủ yếu dựa vào việc phát nguồn bệnh lây lan giai đoạn sớm Có nhiều phương pháp phát HIV khác khơng ngừng phát triển góp phần khơng nhỏ tiến vượt bậc kỹ thuật công nghệ sinh học mà đặc biệt giá ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen nói chung kỹ thuật giải trình tự gen tự động nói riêng TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2005c), “Hướng dẫn chẩn đoán điều trị HIV/AIDS ” Bùi Đại, Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Hoàng Tuấn (2005), “Bệnh học truyền nhiễm”, NXB Y học, (335, 355-362) Đỗ Trung Phấn (1999), “HIV/AIDS an toàn truyền máu”, NXB Y học, ( 24-47) Dự án quỹ toàn cầu HIV/AIDS Việt Nam, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương, Bộ Y tế (2004), “Tăng cường chăm sóc, tư vấn, hỗ trợ người nhiễm HIV/AIDS hoạt động phòng chống HIV dựa vào cộng đồng Việt Nam”, Báo cáo điều tra dự án Dự án quỹ toàn cầu HIV/AIDS Việt Nam, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương, Bộ Y tế (2004), “Tăng cường chăm sóc, tư vấn, hỗ trợ người nhiễm HIV/AIDS hoạt động phòng chống HIV dựa vào cộng đồng Việt Nam”, Báo cáo điều tra dự án Nguyễn Triệu Vân, Đỗ Trung Phấn Số lượng lymphocyte T số thông số huyết học bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS Tạp chí Y học Việt Nam, năm 1999 Phạm Nhật An Cs (1995), “Nhiễm HIV/ AIDS y học sở lâm sàng phòng chống”, NXB Y học, Hà Nội (26-51) Trường Đại học Y khoa Hà Nội (1995), “Nhiễm HIV/AIDS, y học sở, lâm sàng phòng chống”, NXB Y học TIẾNG ANH Alimonti JB, Ball TB, Fowke KR (2003) "Mechanisms of CD4+ T lymphocyte cell death in human immunodeficiency virus infection and AIDS." J Gen Virol 84 (7): 1649–1661 doi:10.1099/vir.0.19110-0 PMID 12810858 Berger A, Preiser W, Doerr HW The role of viral load determination for the management of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus and hepatitis C virus infection J Clin Virol 2001; 20: 23-30 http://amedeo.com/lit.php?id=11163579 Bradley Hare, C (2004) Clinical overview of HIV disease In L Pieperl, S Coffey, O Bacon, & Brenchley JM, Price DA, Schacker TW, Asher TE, Silvestri G, Rao S, Kazzaz Z, Bornstein E, Lambotte O, Altmann D, Blazar BR, Rodriguez B, Teixeira-Johnson L, Landay A, Martin JN, Hecht FM, Picker LJ, Lederman MM, Deeks SG, Douek DC, 2006, "Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection" Nat Med 12 (12): 1365–71 doi:10.1038/nm1511 PMID 17115046 Brenchley JM, Schacker TW, Ruff LE, Price DA, Taylor JH, Beilman GJ, Nguyen PL, Khoruts A, Larson M, Haase AT, Douek DC , 2004, "CD4+ T cell depletion during all stages of HIV disease occurs predominantly in the gastrointestinal tract" J Exp Med 200 (6): 749– 59 doi:10.1084/jem.20040874 PMID 15365096 Busch MP, Satten GA Time course of viremia and antibody seroconversion following human immuno-deficiency virus exposure Am J Med 1997; 102 (suppl 5B): 117ñ24 http://amedeo.com/lit.php? id=9845513 Cheynet V, Verrier B, Mallet F, 1993, Overexpression of HIV-1 proteins in Escherichia coli by a modified expression vector and their one-step purification Protein Expr Purif 4(5):367-72 Christian L Althaus,* Anneke S De Vos, and Rob J De Boer, 2009, Reassessing the Human Immunodeficiency Virus Type Life Cycle through Age-Structured Modeling: Life Span of Infected Cells, Viral Generation Time, and Basic Reproductive Number, R0 Journal of Virology, p 7659-7667, Vol 83, No 15 Ghrayeb J, Kato I, McKinney S, Huang JJ, Chanda PK, Ho DD, Sarangadharan MG, Chang TW, Chang NT, 1986, Human T-cell lymphotropic virus type III (HTLV-III) core antigens: synthesis in Escherichia coli and immunoreactivity with human sera DNA 5(2):93-9 10 Gupta S, Arora K, Gupta A, Chaudhary VK, 2000, Gag-derived proteins of HIV-1 isolates from Indian patients: cloning, expression, and purification of p24 of B- and C-subtypes Protein Expr Purif 19(3):321-8 11 Gupta SK, Sengupta J, Bisht R, Bhatnagar A, Kaul R, 1997, Human immunodeficiency virus type-1 p24 sequence from an Indian strain: expression in Escherichia coli and implications in diagnostics : Gene., 29;190(1):27-30 12 Gurtler L, M¸hlbacher A, Michl U, et al, 1998, Reduction of the diagnostic window with a new combined p24 antigen and human immunodeficiency virus antibody screening assay J Virol Meth 75:27ñ38 http://amedeo.com/lit.php?id=9820572 13 Hel Z, McGhee JR, Mestecky J, 2006, "HIV infection: first battle decides the war" Trends Immunol 27 (6): 274–81 doi:10.1016/j.it.2006.04.007 PMID 16679064 14 Kenealy W, Reed D, Cybulski R, Tribe D, Taylor P, Stevens C, Matthews T, Petteway S, 1987, Analysis of human serum antibodies to human immunodeficiency virus (HIV) using recombinant ENV and GAG antigens AIDS Res Hum Retroviruses 3(1):95-105 15 Larcher C, Bröker M, Huemer HP, Sölder B, Schulz TF, Hofbauer JM, Wachter H, Dierich MP, 1990 Characterization of monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus type gp41 by HIV-1 polypeptides expressed in Escherichia coli FEMS Microbiol Immunol., 2(2):103-10 16 Lenz A, von Hintzenstern J, Erlwein O, Ellinger S, Bröker M, Fleckenstein B, Jahn G, 1987 Serologic AIDS diagnosis with polypeptides obtained by genetic technics of the human immunodeficiency virus (HIV-1) Klin Wochenschr 2;65(21):1042-7 17 Lundberg, G D., 1988 Serological Diagnosis of Human Immunodeficiency Virus Infection by Western Blot Testing JAMA 260:674-679 18 Ly TD, Laperche S, CouroucÈ AM Early detection of human immunodeficiency virus infection using third-and fourth-generation screening assays Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001; 20:104ñ10.http://amedeo.com/lit.php?id=11305462 19 Meier T, Knoll E, Henkes M, Enders G, Braun R,2001, Evidence for a diagnostic window in fourth generation assays for HIV J Clin Virol ; 23:113-6 http://amedeo.com/lit.php?id=11595590 20 Nelson KE, Costello C, Suriyanon V, Sennun S, Duerr A, (2007) “Survival of blood donors and their spouses with HIV-1 subtype E (CRF01 A_E) infection in northern Thailand, 1992-2007”, Department of Epidemiology, Johns Hopkins University, Bloomberg School of PublicHealth, 615N Wolfe Street, Baltimore, Maryland 21205, USA kenelson@jhsph.edu, 21 Suppl 6:S47-54 21 P Volberding (Eds.), HIV InSite knowledge base San Francisco: Center for HIV Information, University of California, San Francisco.http://www.sfaf.org/hiv-info/basics/ 22 Popovic M, Sarngadharan MG, Read E, et al, 1984 Detection, Isolation,and Continuous Production of Cytopathic Retroviruses (HTLV-III) from Patients with AIDS and Pre-AIDS Science 224:497- 23 Riabinina SA, Baranova EN, Sharipova IN, Susekina MI, Puzyrev VF, Obriadina AP, Burkov AN, Ulanova TI, 2007 Evaluation of diagnostic efficiency of the recombinant protein modeling immunodominant epitope V3 of envelope gp120 for immunoenzyme detection for HIV-1 infection antibodies Mol Gen Mikrobiol Virusol.;(3):33-6 24 Saha K, Zhang J, Gupta et al, 2001 Isolation of primary HIV-1 that target CD8+ T lymphocytes using CD8 as receptor Nat Med, 7: 65-72 http://amedeo.com/lit.php?id=1135618 25 Samuel KP, Seth A, Zweig M, Showalter SD, Papas TS, 1988 Bacterial expression and characterization of nine polypeptides encoded by segments of the envelope gene of human immunodeficiency virus Gene.15;64(1):121-34 26 Shoeman RL, Young D, Pottathil R, Victor J, Conroy RR, Crowl RM, Coleman T, Heimer E, Lai CY, Ganguly K, et al, 1987 Comparison of recombinant human immunodeficiency virus gag precursor and gag/env fusion proteins and a synthetic env peptide as diagnostic reagents Anal Biochem 161(2):370-9 27 Tanaka N, Saitoh A, Nakata A, Shinagawa H, 1992 A simple method for overproduction and purification of p24 Gag protein of human immunodeficiency virus type Microbiol Immunol 36(8):823-31 28 Textbook of Pathology by Harsh Mohan, ISBN 81-8061-368-2 29 Thorn RM, Beltz GA, Hung CH, Fallis BF, Winkle S, Cheng KL, Marciani DJ, 1987 Enzyme immunoassay using a novel recombinant polypeptide to detect human immunodeficiency virus env antibody 30 Centers for Disease Control and Prevention (2001) "Revised guidelines for HIV counseling, testing, and referral" MMWR Recomm Rep 50 (RR-19): 1-57 31 Clin Microbiol 25(7):1207-12 TÀI LIỆU THAM KHẢO QUA MẠNG http:// www.aids.org/ http:// www.unaids.org.vn http://en.wikipedia.org/wiki/HIV http://www Dostquangtri.gov.vn http://www Who.int/ reproductive- health/rtpcr/MTCT http://www.cdsco.nic.in/html/Listofdiakits.html: List of HIV Diagnostic Kits Approved For Blood Bank Use Till 1st September 2004 http://www.cureresearch.com/hiv_aids/causes.htm http://www.hiv structure and genome Information, Answers_com mht http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 10 H ttp://www.vaac.gov.vn 11 UNAIDS OUTLOOK report 2010 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HẢI PHỊNG ******************** Chun đề : XÂY DỰNG QUY TRÌNH CẢI TIẾN KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ DNA PHÙ HỢP VIỆC TIẾN HÀNH TỰ ĐỘNG VÀ PHÂN TÍCH BẰNG PHẦN MỀM TỪ PHƯƠNG PHÁP SANGER KINH ĐIỂN (DIDEOXY SEQUENCING) Đề tài: Chủ nhiệm đề tài: GS.TS PHẠM VĂN THỨC Người viết chuyên đề: THS HỒNG THỊ THANH HUYỀN HẢI PHỊNG- 2012 MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ... Vì vậy, chuyên đề nhằm "Xây dựng quy trình cải tiến kỹ thuật giải trình tự DNA phù hợp việc tiến hành tự động phân tích phần mềm từ phương pháp Sanger kinh điển" HIV VÀ HỆ MIỄN DỊCH 1.1 Các loại... dụng phương pháp Sanger – nhiều ngày để giải trình tự lượng DNA tương đương [Hall N., 2007] Kỹ thuật giải trình tự DNA tự động dựa phương pháp giải trình tự Sanger kinh điển Sự đời phương pháp giải. .. VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HẢI PHÒNG ******************** Chuyên đề : XÂY DỰNG QUY TRÌNH CẢI TIẾN KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ DNA PHÙ HỢP VIỆC TIẾN HÀNH TỰ ĐỘNG VÀ PHÂN TÍCH BẰNG PHẦN MỀM