B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI ***. NGUYN MNH TUN THựC HàNH Kỹ THUậT NHUộM MASSONS TRÊN MÔ BệNH HọC BệNH NHÂN XƠ GAN Và TìM HIểU MộT Số YếU Tố LIÊN QUAN KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA KHểA 2009- 2013 H Ni- 2013 B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI 1 ***. NGUYN MNH TUN THựC HàNH Kỹ THUậT NHUộM MASSONS TRÊN MÔ BệNH HọC BệNH NHÂN XƠ GAN Và TìM HIểU MộT Số YếU Tố LIÊN QUAN KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA KHểA 2009- 2013 Hng dn khoa hc: ThS. Nguyn Hu Quc ThS. Hong Trung Kiờn H Ni- 2013 2 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn tới Ban Giám Hiệu, Phòng đào tạo Đại Học- trường Đại Học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em được học tập, rèn luyện và tu dưỡng tại trường. Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy giáo, Ths. Nguyễn Hữu Quốc - người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Em xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ths. Hoàng Trung Kiên, Ban Tuyên giáo Thành ủy Hà Nội, thầy đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô và cán bộ trong Bộ môn Giải phẫu bệnh - trường Đại Học Y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, con xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, những người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện về tinh thần và vật chất cho con. Cảm ơn những người bạn đã luôn ủng hộ và động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận. Nguyễn Mạnh Tuấn 3 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu trình bày trong khóa luận là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học, khóa luận hay tài liệu tham khảo nào. Hà Nội, ngày…… tháng… năm 2013 Sinh viên Nguyễn Mạnh Tuấn 4 ĐẶT VẤN ĐỀ Mô liên kết là loại mô phổ biến nhất có mặt ở hầu hết các bộ phận của cơ thể, xen giữa các mô và gắn bó chúng với nhau. Mô liên kết được tạo thành bởi các thành phần chính như: gian bào (còn gọi là dịch mô), các tế bào liên kết nằm ở gian bào, các sợi liên kết vùi trong chất căn bản. Trong đó đặc biệt chú ý đến là sợi collagen, đây là sợi liên kết có ở hầu hết các mô liên kết. Xã hội càng phát triển, bệnh lý về mô liên kết gặp ngày càng nhiều. Xơ gan là một minh chứng,thường gặp nhiều ở độ tuổi 40.Đây là một bệnh mạn tính kéo dài có tiên lượng xấu và tỷ lệ tử vong cao. Đến nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu (kể cả Tây y và Đông y). Bệnh gây tổn thương lan tỏa ở các thùy gan với xơ hóa, đảo lộn cấu trúc bình thường của gan dẫn tới hình thành các u, cục tân tạo với các cấu trúc không bình thường [9]. Nhiễm vius B, C là nguy cơ chính gây xơ gan. Kết quả một số nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy, tỷ lệ lưu hành virus viêm gan B tại cộng đồng chiếm khoảng 10- 25% dân số, trong đó tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B ở người khoẻ (8- 25%); tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C (0,4- 4,1%)[2]. Một lý do khác gây xơ gan là do rượu, gặp nhiều ở các nước Châu Âu và các nước có thói quen sử dụng rượu trong đó có Việt Nam. Ngày nay, tiến bộ trong lĩnh vực khoa học đã giúp chẩn đoán sớm và điều trị tốt cho bệnh nhân xơ gan nhưng tiên lượng của bệnh xơ gan vẫn rất dè dặt. Việc đánh giá mức độ viêm gan và xơ hóa của nhu mô gan là thực sự cần thiết, nhất là những trường hợp xơ gan nặng. Có nhiều kỹ thuật hiện đại giúp chẩn đoán xơ gan như: siêu âm, CT scanner nhưng sinh thiết gan phục vụ chẩn đoán giải phẫu bệnh mới là tiêu chẩn vàng để đánh giá tình trạng xơ gan. Phương pháp nhuộm hai màu thông thường bằng Hematoxylin và Eosin 5 không cho phép quan sát, đánh giá phân biệt bệnh lý của mô liên kết. Năm 1951, phương pháp nhuộm ba màu của nhà giải phẫu bệnh P. Masson được mô tả như là một bước ngoặt đột phá giúp cho các nhà lâm sàng trong chẩn đoán bệnh học về mô liên kết. Phương pháp giúp phân biệt rõ được các thành phần dựa trên sự tương phản màu sắc của mô: nhân, các hồng cầu, sợi huyết, bào tương và đặc biệt là các sợi collagen. Các đề tài nghiên cứu trong nước ứng dụng kỹ thuật nhuộm ba màu để chẩn đoán, phân biệt bệnh lý về mô liên kết còn ít. Mặt khác, chưa có đề tài nào nghiên cứu một cách toàn diện và cung cấp các thông tin đầy đủ về kỹ thuật nhuộm ba màu, cũng như ưu, khuyết điểm, các yếu tố ảnh hưởng đến kĩ thuật nhuộm ba màu và cách khắc phục. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thực hành kỹ thuật nhuộm ba màu của Masson’s trên mô bệnh học bệnh nhân xơ gan và tìm hiểu một số yếu tố liên quan”, với mục tiêu: 1. Thực hành thành thạo kỹ thuật chuyển, đúc, cắt, nhuộm. 2. Một số yếu tố liên quan ảnh hưởng tới kết quả thực hành. 6 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giải phẫu, mô học và tế bào học bình thường của gan 1.1.1. Giải phẫu gan Gan là cơ quan lớn thứ hai trong cơ thể (sau da). Gan đóng nhiều vai trò quan trọng khác nhau trong việc bảo tồn sức khỏe của chúng ta. Tùy theo kích thước và trọng lượng của mỗi cá nhân, gan có sức nặng từ 1.100 đến 1.800 gram. Gan vừa là tuyến ngoại tiết (tiết mật vào tá tràng), vừa là tuyến nội tiết (tổng hợp một số chất và những chất này được chuyển trực tiếp vào máu) [7]. Hình 1.1. Gan và các bộ phận lân cận trong ổ bụng 1.1.2. Mô học gan bình thường Gan được chia làm nhiều thùy. Các thùy gan được tạo thành bởi những khối nhỏ với cấu trúc điển hình được gọi là tiểu thùy gan. Mỗi tiểu thùy là một đơn vị cấu trúc và chức năng của gan [7]. 7 Mỗi tiểu thùy gan là một khối đa diện có đường kính khoảng 1- 2mm. Các tiểu thùy chỉ phân cách với nhau rõ rệt ở khoảng cửa (chỗ mô liên kết dày lên ở góc giữa 3- 4 tiểu thùy). Gan được tạo thành chủ yếu bởi các tế bào gan. Những tế bào đó hợp thành những dây tế bào và nối với nhau tạo thành một đơn vị hình thái được gọi là Kiernan hay còn gọi là tiểu thùy gan. Hình 1.2: Một phần tiểu thùy gan cổ điển 1.2. Bệnh xơ gan Xơ gan là bệnh mạn tính gây thương tổn nặng lan toả ở các thuỳ gan. Đặc điểm thương tổn là mô xơ phát triển mạnh, đồng thời cấu trúc các tiểu thuỳ và mạch máu của gan bị đảo lộn một cách không hồi phục được [1]. Hình thái học của xơ gan là kết quả của 3 quá trình đồng thời hoặc nối tiếp: - Tổn thương hoại tử của các tế bào nhu mô gan. - Sự tăng sinh của mô xơ. - Sự tạo thành những hòn, cục tái tạo và những tiểu thuỳ giả. 8 Hình 1.3: Hình thái bề mặt gan xơ 1.3. Vài nét về mô liên kết Trong số các loại mô cơ bản thì mô liên kết là loại mô phổ biến nhất. Mô liên kết có mặt ở hầu hết các bộ phận trong cơ thể, xen giữa các mô khác, giúp chúng gắn bó với nhau [7]. Mô liên kết có nguồn gốc từ lá thai giữa, tức là trung mô. Trong cơ thể có nhiều loại mô liên kết. Mỗi loại mô liên kết được tạo thành bởi:  Thành phần gian bào: gồm phần lỏng gọi là dịch mô, phần đặc hơn có đặc tính của một hệ keo gọi là chất căn bản.  Các sợi liên kết vùi trong chất căn bản.  Các tế bào liên kết nằm rải rác trong thành phần gian bào. Mô liên kết là loại mô giàu thành phần gian bào (được coi như môi trường bên trong cơ thể). Căn cứ vào sự khác nhau chủ yếu của chất căn bản người ta phân mô liên kết thành ba loại lớn:  Mô liên kết chính thức: có mật độ mềm và có mặt ở mọi nơi trong cơ thể.  Mô sụn: chất căn bản nhiễm cartilagen (chất sụn) có mật độ rắn vừa phải.  Mô xương: chất căn bản nhiễm ossein và muối canxi vì vậy mật độ rắn. 1.4. Sợi collagen 9 Sợi collagen là một trong ba loại sợi vùi trong chất căn bản liên kết gồm: sợi collagen, sợi võng và sợi chun. Sợi collagen có mặt ở hầu hết các mô liên kết, nhưng khác nhau đáng kể về số lượng. Về nguồn gốc, sợi collagen được hình thành từ protein. Sợi collagen bắt màu đỏ của thuốc nhuộm Eosin, bắt màu xanh của Blue aniline. Đơn vị cấu tạo hình thái của sợi collagen là xơ collagen, có đường kính trung bình khoảng 50nm quan sát rõ ở kính hiển vi điện tử. Về mặt sinh hóa, hiện nay đã xác định được trên 20 type collagen khác nhau. Sự khác nhau này là do có các chuỗi α khác nhau, khi chúng kết hợp thành bộ ba xuất hiện những hình thái phân tử collagen khác nhau. Một số type collagen quan trọng: 1.4.1. Collagen type 1 Có trong chân bì da, gân, cân, xương, sụn xơ. Chúng tương tác mức độ thấp với dermantan sulfat. 1.4.2. Collagen type 2 Có trong sụn trong và sụn chun. Chúng tương tác với chondroitin sulfat. 1.4.3. Collagen type 3 Có trong sợi võng của mô thần kinh đệm, ở mô kẽ của gan, thận, lách, phổi. Chúng tương tác với heparin sulfat. 1.4.4. Collagen type 4 Có trong lá đáy của màng đáy. Chúng tương tác với heparin sulfat. 1.4.5. Collagen type 5 và 6 10 [...]... 1ml 17 - Dung dch acid picric bóo hũa - Formol - Acid acetic lnh, nguyờn cht 1.7 Tin hnh 75ml 20ml 5ml [8] * Bnh phm Hai yêu cầu cơ bản trớc tiên của lấy bệnh phẩm là: phải lấy trúng và lấy đủ Những yêu cầu này dễ thực hiện đối với tử thiết hoặc bệnh phẩm phẫu thuật hơn là với những sinh thiết bằng dụng cụ, nhất là khi tổn thơng ở sâu hoặc trong các tạng [4], [8] Bnh phm sau khi c ly s c c nh ngay Mt... phm x gan ca bnh nhõn c ly ti B mụn Gii phu bnh, trng i hc Y H Ni v Khoa Gii phu bnh bnh vin Hu ngh Vit c Tiến hành chuyển bằng máy chuyển STP 20 Đúc bloc bằng máy đúc AP 280 Tiến hành cắt và dán mảnh: dy ming ct dy 3 àm Sau ú ming ct c ghi rừ h, tờn, kớ hiu khoa, phũng ca bnh nhõn 2.5 ỏnh giỏ kt qu nghiờn cu Nhng mu bnh phm sau khi qua cỏc bc pha, chuyn, ỳc, ct, nhum s c c trờn kớnh hin vi quang... sn xut mt lng nh bi nhiu loi t bo ca mụ liờn kt, bao gm t bo liờn kt, t bo ni mụ v t bo biu mụ Collagen type 6 l cu trỳc giu cu ni disunfit Collagen type 6 c tỡm thy trong khu vc ranh gii k ca si collagen type 1 v 2, cú chc nng liờn kt cỏc thnh phn khụng phi collagen [6] 1.5 Phng phỏp nhum ba mu ca Masson 1.5.1 Lch s phng phỏp nhum ba mu ca Masson Nhum ba mu l mt trong nhng phng phỏp nhum phõn bit cỏc... cỏc li liờn quan ti vn k thut nh tiờu bn thng bn, bt nc, gp, rỏch, xc, mt mụ, dy mng khụng u, nhum kộm Cú nhiu nguyờn nhõn dn ti cỏc li thng gp thỏng th nht Tiờu bn bn thng do cỏc nguyờn nhõn nh bnh phm ct b nỏt vn do k thut ct cha tt bỏm lờn lam kớnh, lamen kớnh b nm, mc hoc gn baume cha tt lm cho baume dớnh lờn mt kớnh, cng cú th do cn thuc nhum gõy ra Nhng tiờu bn bn khi chỳng tụi quan sỏt trờn... tui, gii, chn oỏn lõm sng - Cú chn oỏn lõm sng l x gan - Cú chn oỏn xỏc nh bng mụ bnh hc: cỏc bloc t yờu cu k thut 2.3.1.2 Tiờu chun loi tr - Thiu cỏc d liu cn thu thp - Mu mụ b hng, khụng cho nghiờn cu 2.3.2 C mu 40 trng hp ó c chn oỏn xỏc nh l x gan 2.4 Phng phỏp nghiờn cu 2.4.1 Thit k nghiờn cu Chỳng tụi tin hnh nghiờn cu theo phng phỏp mụ t ct ngang cú phõn tớch 2.4.2 Phng phỏp ly mu 22 Cỏc bloc... Bit húa trong acid acetic 1% trong 10 giõy Loi nc bng cỏch nhỳng tiờu bn vo cn tuyt i Lm trong tiờu bn bng Xylen v gn Baume [11] 1.8.2 Kt qu chung Nhõn t bo en nõu Bo tng, si c, hng cu Si collagen xanh 20 21 CHNG 2 I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 2.1 i tng nghiờn cu 40 bloc bnh phm gan c ly ti B mụn Gii phu bnh trng i hc Y H Ni v Khoa Gii phu bnh bnh vin Hu ngh Vit c 2.2 Thi gian v a im nghiờn cu - Thi... l ln lt l 55,1% v 42,3% T l tiờu bn cha t rt thp 2,6% 26 Biu 3.1: ỏnh giỏ tng quan cht lng tiờu bn sau cỏc thỏng Nhn xột: - Biu 3.1 cho thy: cht lng tiờu bn p tng lờn sau mi thỏng (t 23,8% thỏng th nht lờn 55,1% thỏng th t) Tiờu bn cha t yờu cu gim (t 28,6% thỏng th nht xung cũn 2,6% thỏng th t) 3.2 Cỏc yu t liờn quan nh hng ti kt qu thc hnh Bng 3.5 Bng kt qu cht lng tiờu bn cú v khụng c nh bng... phng phỏp nhum phõn bit cỏc thnh phn khỏc nhau ca mụ liờn kt Thut ng nhum ba mu l tờn thng dựng ca k thut nhum chn lc cho c, si collagen, si huyt v hng cu C.L Pierre Masson (1880-1959) l mt nh gii phu bnh ngi Canada ni ting ca th k 20 ễng c bit n nh nh nghiờn cu v u nóo v h thng thn kinh v nhng k thut mụ hc nh phng phỏp nhum ba mu ó tr thnh chun trong tt c cỏc Hỡnh 1.4: C.L Pierre Masson phũng xột... xylindine Cụng thc: C18H14N2O7S2 Hỡnh 1.7: Cu trỳc Ponceau de xylindine 14 1.5.3.4 Acid Phosphomolybdic Acid Phosphomolybdic, cũn c gi l acid molybdophosphoric dodeca hoc PMA l mt thnh phn ca phng phỏp nhum ba mu ca Masson Nú l mt hp cht mu vng- xanh, d tan trong nc v cỏc dung mụi hu c cc nh ethanol Cụng thc: 12MoO3ãH3PO4 Hỡnh 1.8: Cu trỳc acid Phosphomolybdic 1.5.3.5 Blue aniline Cụng thc: C37H27N3Na2O9S3... cu theo phng phỏp mụ t ct ngang cú phõn tớch 2.4.2 Phng phỏp ly mu 22 Cỏc bloc chỳng tụi nghiờn cu u ó c c nh bng formol 10% Mi mu ca bnh nhõn s c ct lm 6 tiờu bn, chia thnh 3 nhúm, mi nhúm 2 tiờu bn bao gm: 2 tiờu bn trong ú: 1 tiờu bn sau khi ty sch paraffin v ra nc s c c nh bng dung dch Bouin nhit 50 oC trong 1 gi v 1 tiờu bn khụng c nh qua Bouin, cỏc bc khỏc trong quy trỡnh nhum hon ton ging . hành nghiên cứu đề tài: Thực hành kỹ thuật nhuộm ba màu của Masson’s trên mô bệnh học bệnh nhân xơ gan và tìm hiểu một số yếu tố liên quan , với mục tiêu: 1. Thực hành thành thạo kỹ thuật chuyển,. B Y T TRNG I HC Y H NI 1 ***. NGUYN MNH TUN THựC HàNH Kỹ THUậT NHUộM MASSONS TRÊN MÔ BệNH HọC BệNH NHÂN XƠ GAN Và TìM HIểU MộT Số YếU Tố LIÊN QUAN KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA KHểA 2009-. TO B Y T TRNG I HC Y H NI ***. NGUYN MNH TUN THựC HàNH Kỹ THUậT NHUộM MASSONS TRÊN MÔ BệNH HọC BệNH NHÂN XƠ GAN Và TìM HIểU MộT Số YếU Tố LIÊN QUAN KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA KHểA 2009-