Nghiên cứu sản xuất Xylanase tái tổ hợp HVTH: Hoàng Nữ Lệ Quyên Cao Xuân Bách  XinRanLi,HuiXu,JieXie,QiaoFuYi,WeiLi,DaiRongQiao,YiCao, andYuCao. ThermostableSitesandCatalyticCharacterizationofXylanaseXYNBofAspergillusnigerS CTCC400264, J. Microbiol. Biotechnol. (2014),24(4), 483–488 Nội dung 1. Tổng quan 2. Nguồn gen và vector tách dòng 3. Vector và vật chủ biểu hiện 4. Kết luận Tổng quan  Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose của thành tế bào thực vật.  Xylan là polymer bao gồm các đơn phân D – xylose liên kết với nhau bằng liên kết ß – 1,4 – glycoside. Xylanase  Xylanase là enzyme tham gia thủy phân xylan.  Hai nhóm enzyme chủ yếu phân hủy xylan: + endo – 1,4 – ß - xylanase, enzyme này thủy phân liên kết 1,4 – ß - Glucosid. + ß – xylosidases; enzyme này thủy phân xylobiose và xylooligosaccharid. - Các enzyme (debranching enzyme): α – glucuronidase; acetylxylan… loại bỏ mạch nhánh acetyl và mạch nhánh phenol. Xylanase  Dựa trên trình tự tương đồng của amino acid chia enzyme xylanase thành 2 họ chính: + Họ 10 (KLPT > 30 kDa) + Họ 11 (KLPT khoảng 20kDa) Xylanase  Xylanase có nguồn gốc thực vật: + sinh tổng hợp endo-xylanase trong quả lê Nhật Bản trong giai đoạn chín. + sinh tổng hợp endo-xylanase (klpt 55 kDa) từ lúa mì.  Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu từ các vi sinh vật: + sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn: Bacillus SSP; Bacillus circulans… + sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc: Trichoderma sp; A.niger;… Nguồn gen và vector tách dòng  Nguồn gen: Aspergillus Niger  Gen: xynB chịu nhiệt (FJ772090).  Trong bộ sưu tập chủng giống Tứ Xuyên – Trung Quốc.  -Dựa trên trình tự nucleotide của XynB: Aspergillus Niger  P1: 5'-GGAATTCTCGACCCCGACCGGCGAGAA-3 ';  P2: 5'-ATAGCGGCCGCTTACTGAACAGTGATGGAGGAAGA-3 '. Nguồn gen và vector tách dòng  Vector tách dòng: pMD19-T  Vật chủ tách dòng: Escherichia Coli Vector và vật chủ biểu hiện  Vector tái tổ hợp: pPIC9K  Vật chủ biểu hiện: Pichia Pastoris Pichia Pastoris Vector pPIC9K  Là vector biểu hiện trong nấm men Pichia pastoris  Kết hợp gen AOX cảm ứng methanol tạo protein tái tổ hợp  Cấu trúc vector: - Ori - AOX3 - AOX1 promoter - Điểm polylinker MSC - AOX1 terminator - Gen kháng Kanamycin, Ampi [...]... phù hợp quy mô lớn hay nhỏ - Môi trường tự bảo vệ Kết quả nghiên cứu Hình 3 Nhiệt độ tối ưu của xylanase tái tổ hợp Nhiệt độ tối ưu được xác định bằng phương pháp Ghose: ủ các enzyme trong 0,1 M citrate đệm, pH 5,0, trong 10 phút ở nhiệt độ khác nhau Hình 5 Ổn định nhiệt của xylanase tái tổ hợp Protein tái tổ hợp được xác định bằng ủ ở 80 ° C trong 10 phút Hình 4 pH tối ưu độ bền của xylanase tái tổ hợp. .. pH tối ưu độ bền của xylanase tái tổ hợp pH tối ưu được xác định bằng cách ủ ở 50 ° C trong 10 phút ở pH khác nhau bằng phương pháp của Ghose; pH 2-10 Hình 6 Sự ảnh hưởng của các Hoạt độ của enzym tái tổ hợp của các ion kim loại khác nhau Cơ chất bao gồm K+, Mg2+, Fe2+, Mn2+, Cu2+, Ca2+, Fe3+, Co2+, Zn2+ So sánh điểm khác biệt trình tự gen XynB  Sriprang và cộng sự đã xây dựng lại XYLB (AY551187)... (ACN89393 và AAS67299) trong Aspergillus niger (A, B) phân tích lựcVan der Waals cho XYNB (A: ACN89393; B: AAS67299); (C, D), phân tích liên kết hydro cho XYNB (C: ACN89393 D: AAS67299) Kết luận  Enzyme tái tổ hợp có nhiều ưu điểm: - Có khả năng cải tạo nâng cao khả năng bền nhiệt, chịu pH, nâng cao hoạt tính - Dễ dàng áp dụng trong quy mô nhỏ, lớn - Có thể cải thiện tính chất để dễ thu nhận enzyme - Mở... ThermostableSitesandCatalyticCharacterizationofXylanaseXYNBofAspergil lusnigerSCTCC400264, J Microbiol Biotechnol (2014),24(4), 483–488  Guanhua Fu, Yongtao Wang, [ ], and Chenyan Zhou Cloning, Expression, and Characterization of an GHF 11 Xylanase from Aspergillus niger XZ-3S, Indian J Microbiol (Oct–Dec 2012) 52(4):682– 688  Yui Takahashi, Hiroaki Kawabata, and Shuichiro Murakami.Analysis of functional xylanases in xylan... (Oct–Dec 2012) 52(4):682– 688  Yui Takahashi, Hiroaki Kawabata, and Shuichiro Murakami.Analysis of functional xylanases in xylan degradation by Aspergillus niger E-1 and characterization of the GH family 10 xylanase XynVII, Takahashi et al SpringerPlus 2013, 2:447 Xin chân thành cảm ơn sự chý ý lắng nghe của cô và các bạn! . sinh tổng hợp endo -xylanase trong quả lê Nhật Bản trong giai đoạn chín. + sinh tổng hợp endo -xylanase (klpt 55 kDa) từ lúa mì.  Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu từ các vi sinh vật: + sinh tổng. của enzym tái tổ hợp của các ion kim loại khác nhau. Cơ chất bao gồm K+, Mg2+, Fe2+, Mn2+, Cu2+, Ca2+, Fe3+, Co2+, Zn2+. Hình 5. Ổn định nhiệt của xylanase tái tổ hợp. Protein tái tổ hợp được. Nghiên cứu sản xuất Xylanase tái tổ hợp HVTH: Hoàng Nữ Lệ Quyên Cao Xuân Bách  XinRanLi,HuiXu,JieXie,QiaoFuYi,WeiLi,DaiRongQiao,YiCao,