Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM —————————————— BÙI TRI THỨC NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR PB2GW7 MANG GEN CRYIA(C) VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM —————————————— BÙI TRI THỨC NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR PB2GW7 MANG GEN CRYIA(C) VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.46.30 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Ngô Xuân Bình Thái Nguyên – 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo: PGS. TS Ngô Xuân Bình, đã giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Sư phạm, khoa Sau đại học, bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN và các thầy cô giáo, cán bộ khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tác giả luận văn Bùi Tri Thức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực,chưa được công bố trong bất kì công trình nào khác. Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Vi khuẩn A. tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng 4 1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn A. tumefaciens 4 1.1.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 5 1.1.3. Cơ chế quá trình chuyển gen nhờ A. tumefaciens 7 1.1.4. Một số hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 9 1.2. Vector chuyển gen dựa trên Ti-plasmid 10 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 13 1.4. Công nghệ Gateway và vector sử dụng trong đề tài 16 1.4.1. Công nghệ Gateway 16 1.4.2. Vector nhân dòng pENTR TM D/TOPO cloning 20 1.4.3. Vector chuyển gen pB2GW7 22 1.5. Vi khuẩn B. thuringiensis và gen cry 23 1.5.1. Những nghiên cứu chung về vi khuẩn B. thuringiensis 23 1.5.2. Những nghiên cứu về gen cry 24 1.5.3. Những nghiên cứu về gen cry1A 25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.6. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây A. thaliana 25 1.6.1. Đặc điểm nông sinh học cây A. thaliana 25 1.6.2. Những nghiên cứu về cây A. thaliana 26 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 28 2.1.1. Vật liêu nghiên cứu 28 2.1.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài 29 2.1.3. Thiết bị sử dụng trong đề tài 30 2.2. Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1. Nhân dòng gen cryIA(c) từ vector OB-Mutant#16-cryIA(c) 30 2.2.1.1. Nhân gen cryIA(c) từ vector OB-Mut-cryIA(c) 31 2.2.1.2. Gắn gen cryIA(c) lên vector tách dòng pENTR ™ /D-TOPO ® 32 2.2.1.3. PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc thu được sau nhân dòng với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) 32 2.2.1.4. Xác định trình tự đoạn ADN được nhân dòng 32 2.2.2. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefacien mang vector pB2GW7-cryIA(c) 33 2.2.2.1. Gắn gen cryIA(c) lên vector chuyển gen pB2GW7 34 2.2.2.2. Phân tích các dòng tế bào E. coli thu được sau chọn lọc 35 2.2.2.3. Biến nạp vector pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A. tumefacicen 35 2.2.2.4. PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens thu được sau biến nạp với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) 36 2.2.3. Đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vector pB2GW7-cryIA(c) trên cây A. thaliana 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.3.1. Tạo cây A. thaliana chuyển gen 36 2.2.3.2. Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên khả năng kháng thuốc diệt cỏ 37 2.2.3.3. Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen bar 37 2.2.3.4 Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) 38 2.2.3.5. Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây A. thaliana chuyển gen 38 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 3.1. Kết quả nhân dòng gen cryIA(c) từ vector OB-Mutant#16-cryIA(c) 39 3.1.1. Kết quả nhân gen cryIA(c) từ vector OB-Mut-cryIA(c) 39 3.1.2. Kết quả gắn gen cryIA(c) lên vector tách dòng pENTR ™ /D-TOPO ® 39 3.1.3. Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn E. coli thu được với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) 40 3.1.4. Kết quả xác định trình tự đoạn ADN được nhân dòng 41 3.2. Kết quả tạo chủng vi khuẩn A. tumefacien mang vector pB2GW7- cryIA(c) 45 3.2.1. Kết quả gắn gen cryIA(c) lên vector chuyển gen pB2GW7 45 3.2.2. Kết quả phân tích các dòng tế bào E. coli thu được sau chọn lọc 46 3.2.3. Kết quả biến nạp vector pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A. tumefacicen 47 3.2.4. Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens thu được sau biến nạp với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) 48 3.3. Đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vector pB2GW7-cryIA(c) trên cây A. thaliana 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.1. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên khả năng kháng thuốc diệt cỏ 49 3.3.2. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen bar 50 3.3.3. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) 51 3.3.4. Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây A. thaliana chuyển gen 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 1. Kết luận 53 2. Đề nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Nội dung A. thaliana Arabidopsis thaliana A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens A 260 nm Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm A 280 nm Giá trị mật độ quang ở bước sóng 280 nm ADN Axít deoxyribonucleic ADNaza Deoxyribonuclease (enzyme phân hủy ADN) Amp Ampicillin VAM Anfa mosaic virus (virut khảm anfa) ARN Axít ribonucleic ARNaza Ribonuclease (enzyme phân hủy ARN) AS Asetoseringon BC Bacillus cereus BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair - Cặp bazơ nitơ BT Bacillus thuringiensis cADN Complementary DNA (ngân hàng gen) VCaM Cauliflower mosaic virus (virut gây khảm súp lơ) Cry Crystal CTAB Cetyl trimetyl amonium bromid ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate E.coli Escherichia coli EDTA Axít etylendiaminetetraacetic Gen GUS Gen mã hóa β-glucuronidase ISAAA International Survice for the Acquisition of Agri-Biotech Application kb Kilobase LB Left border (trật tự biên trái của đoạn T-ADN) M Mol/lit mARN Messenger RNA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MS Murashige and Skoog NCBI National Center for Biotechnology Information-Trung tâm thông tin quốc gia về thông tin công nghệ sinh học. NPTII Neomycin phospho transferase gen OD Optical density ori Origin of replication PCR Polymerase chain reaction rARN Ribosomal RNA RB Right border (trật tự biên phải của đoạn T-ADN) T-ADN Transfer DNA (đoạn ADN được chuyển sang tế bào thực vật) TAE Tris-acetate-EDTA Taq polymeraza Thermostable DNA polymeraza TE Tris : EDTA (10:1) Ti-plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid gây khối u) Vir Virulence (vùng gen gây độc) YAC Yeast artificial chromosome (NST nhân tạo nấm men) [...]... trên và để phục vụ cho công tác chuyển gen tạo cây trồng kháng sâu ở Việt Nam nói chung và chuyển gen tạo cây trồng kháng sâu tại Thái Nguyên nói riêng Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu thiết kế vectơ pB2GW7 mang gen cryIA(c) và đánh giá khả năng chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana 2 Mục tiêu nghiên cứu Tạo vectơ pB2GW7 mang gen cryIA(c) và đánh giá khả năng chuyển gen trên cây. .. pB2GW7- cryIA(c) trên cây Arabidopsis thaliana (A thaliana) + Đánh giá cây A thaliana chuyển gen dựa trên khả năng kháng thuốc diệt cỏ; + Đánh giá cây A thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen bar; + Đánh giá cây A thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c); + Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây A thaliana chuyển gen Số hóa bởi Trung tâm Học... Sau đó các nghiên cứu thiết kế vectơ phục vụ chuyển gen vào thực vật trong đó có thiết kế vectơ mang gen cryIA(c) cũng đã được thực hiện [3] Năm 2001, Đặng Trọng Lượng và cs đã tiến hành thiết kế vectơ mang gen cryIA(c) để đưa vào cây bắp cải thông qua vi khuẩn A tumefaciens[5] Hiện nay, việc nghiên cứu chuyển gen kháng sâu, trong đó có gen cryIA(c) vào cây trồng ở nước ta là rất thiết thực [2] Xuất... tumefaciens) mang vectơ pB2GW7- cryIA(c) + Gắn gen cryIA(c) lên vectơ chuyển gen pB2GW7; + Phân tích các dòng tế bào E coli thu được sau chọn lọc; + Biến nạp vectơ pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A tumefacicens; + PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A tumefaciens thu được sau biến nạp với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) - Nội dung 3: Đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vectơ pB2GW7- cryIA(c) trên cây Arabidopsis. .. nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vectơ chuyển gen [6], [17] - Ảnh hưởng của kiểu gen: hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một loài Đa số các nghiên cứu về chuyển gen chỉ đề cập đến ảnh hưởng của kiểu gen đến tần số chuyển gen bền vững, chính vì vậy mà chúng ta không biết được kiểu gen có ảnh hưởng gì đến khả năng chuyển TDNA hay phản ứng... được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline [34] Nghiên cứu về hiện tượng gây khối u này, thấy rằng khả năng chuyển đoạn T-DNA vào hệ gen thực vật của A tumefaciens là dựa vào chức năng của Ti-plasmid Khi phát hiện ra Ti-plasmid và khả năng của nó, người ta đặc biệt chú ý khai thác và sử dụng chúng để tạo nên các vectơ chuyển gen, để chuyển các gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo ra cây trồng mang. .. enzym SacI 47 Hình 3.10 Kết quả biến nạp vector pB2GW7- cryIA(c) vào vi khuẩn A tumefaciens .48 Hình 3.11 Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A tumefaciens thu được sau biến nạp .48 Hình 4.12 Kết quả đánh giá cây A thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen bar 50 Hình 4.13 Kết quả đánh giá cây A thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với... các cây trồng như ngô, bông, cà chua, khoai tây, lúa, súp lơ, rau riếp, đậu tương [54] Năm 2000, nhóm tác giả Bhattacharya (Ấn Độ) đã chuyển thành công gen cryIA(c) vào cây bắp cải [12] Ở Việt Nam, các nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng đang được tiếp cận, đầu tư nghiên cứu với sự chú trọng đặc biệt Từ năm 1997, một số nghiên cứu chuyển gen đã được tiến hành trên cây thuốc lá [4] Sau đó các nghiên cứu. .. thực vật sẽ tốt hơn Đây chính là một điều kiện tốt giúp tăng khả năng chuyển gen vào thực vật Năm 2000, Trieu đã chuyển gen thành công vào cây Medicago truncatula (cây mô hình thuộc họ đậu) phương pháp này[58] 1.2 Vectơ chuyển gen dựa trên Ti-plasmid Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống vectơ chuyển gen dựa trên Ti-plasmid [45] (A) vectơ liên hợp và (B) vectơ nhị thể Vir: vùng gây độc; goi: các vùng tương đồng mà... khuẩn A tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế dạng plasmid tái tổ hợp, gắn vào hệ gen của tế bào chủ Trong tế bào chủ, gen lạ hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng, từ đó xuất hiện đặc tính mới của cơ thể đã mang gen chuyển [9] Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau . hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu thiết kế vectơ pB2GW7 mang gen cryIA(c) và đánh giá khả năng chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana . 2. Mục tiêu nghiên cứu Tạo vectơ pB2GW7 mang gen cryIA(c). của gen cryIA(c). - Nội dung 3: Đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vectơ pB2GW7- cryIA(c) trên cây Arabidopsis thaliana (A. thaliana) . + Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên khả. cryIA(c) và đánh giá khả năng chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana. 3. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Nhân dòng gen cryIA(c) từ vectơ OB-Mutant#16 -cryIA(c) + Nhân gen cryIA(c) từ vectơ