1 B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI *** Nghiên cứu về kháng thể chống tinh trùng và ứng dụng xác định kháng thể chống tinh trùng trên ngời Chuyờn ngnh: Min dch Sinh lý bnh KHểA LUN TT NGHIP BC S Y KHOA Khúa 2006 - 2012 Ngi hng dn: ThS H QUANG HUY H NI 2012 2 Lời cảm ơn Trong quá trình học tập và nghiên cứu, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ , đóng góp của các thầy cô giáo, bạn bè và gia đình. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc , em xin chân thành cảm ơn thầy giáo ThS. Hồ Quang Huy người thầy tận tình, hết lòng vì học trò, đã hướng dẫn và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn các thầy côtrong ban chủ nhiêm cùng toàn thể các thầy cô trong bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh đã cho phép em được làm đề tài khóa luận tại bộ môn và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luân này Em cảm ơn chị chị KTV. Tạ Thị Mến, chị KTV. Đỗ Thị Nga và các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn, em xin cảm ơn đã hỗ trợ về kỹ thuật và giúp em thực hiện nghiên cứu. Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo trường đại học Y Hà Nội, nơi em học tập và nghiên cứu. Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, chăm sóc, tạo sức mạnh tinh thần để em hoàn thành bản khóa luận tốt nghiệp. Hà nội, ngày 21 tháng 5 năm 2012 Sinh viên Phạm Thị Thùy Dung 3 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản khóa luận trên là kết quả của một quá trình học tập và nghiên cứu nghiêm túc, trân thực của bản thân. Những kêt quả nghiên cứu trong bài được xử lí trên những số liệu hoàn toàn trung thực, có danh sách bệnh nhân cụ thể kèm theo tại bộ môn Miễn dịch- sinh lí bệnh Đại học Y Hà Nội từ 9/11/2011 đến 3/5/2012. Nếu có gì không trung thực, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước Hội đồng kỉ luật và phòng đào tạo đại học Đại học Y Hà nội Sinh viên Phạm Thị Thùy Dung 4 DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT KTCTT : Kháng thể chống tinh trùng TT : Tình trùng KT : Kháng thể KN : kháng nguyên (+) : dương tính (-) : âm tính 5 6 ĐẶT VẤN ĐỀ Vô sinh- một vấn đề lớn về mặt xã hội, là một bệnh phức tạp trong các bệnh lý phụ khoa, bệnh do nhiều nguyên nhân. Vô sinh là tình trạng không có thai từ 12 tháng trở lên, khi có thực hiện quan hệ đều đặn không áp dụng biện pháp tránh thai. Vấn đề vô sinh hiện nay có xu hướng tăng và là một lĩnh vực rất đáng được quan tâm trong chăm sóc sức khỏe sinh sản. Hiện nay nguyên nhân gây vô sinh đã được phát hiện, từ đó đưa ra được phương pháp điều trị vô sinh. Một trong những nguyên nhân gây vô sinh hiện nay đang được quan tâm và nghiên cứu đó là vô sinh do miễn dịch. Là một trong những bệnh rối loạn tự miễn, vô sinh do miễn dịch xảy ra ở cả nam lẫn nữ. Ở người mắc bệnh này, hệ miễn dịch của họ sẽ nhận biết tinh trùng là một kháng nguyên lạ, cơ thể sẽ sản xuất ra kháng thể chống lại và tiêu diệt tinh trùng dẫn đến hiện tượng vô sinh, kháng thể đó được gọi là kháng thể chống tinh trùng. Trong huyết thanh của người phụ nữ bị vô sinh do miễn dịch, kháng thể chống tinh trùng làm cho tình trùng ngưng kết lại với nhau, làm mất khả năng di chuyển của tinh trùng đến gặp trứng, gây nên vô sinh. Kháng thể chống tinh trùng (KTCTT) đã được Rumke và Wilson phát hiện và báo cáo lần đầu tiên vào năm 1954. Sau đó đã có rất nhiều báo cáo và nghiên cứu về KTCTT ,có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm ra phương pháp chẩn đoán, điều trị vô sinh trong miễn dịch, trong việc bảo vệ sức khỏe sinh sản. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về KTCTT như nghiên cứu về vai trò KTCTT trong vô sinh [15], liên quan giữa KTCTT và thắt ống dẫn tinh [9] đặc điểm tinh dịch và KTCTT trong chất nhầy cổ tử cung [8]….Ở Việt nam, cũng có một số nghiên cứu về KTCTT đã được báo cáo như KTCTTsau thắt ống dẫn tinh [1] KTCTT ở những bệnh nhân dãn tĩnh mạch thừng tinh [2]… 7 Tuy nhiên những nghiên cứu về KTCTT trong nước ta vẫn còn ít, nhất là trong chẩn đoán và điều trị vô sinh. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài về “Nghiên cứu về kháng thể chống tinh trùng và ứng dụng xác định kháng thể chống tinh trùng trên người” nhằm thực hiện các mục tiêu sau: 1. Gây mẫn cảm tạo KTCTT trên thỏ 2. Xác đinh nồng độ KTCTT trong huyết thanh ở những người vô sinh bằng kỹ thuật ELISA 3. Xác đinh mức độ ngưng kết trực tiếp tinh trùng chồng và huyết thanh vợ có KTCTT (+) 8 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TẾ BÀO LYMPHO B VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH DỊCH THỂ Khi một KN xâm nhập cơ thể, hệ thống miễn dịch sẽ nhận biết, nhờ vậy được hoạt hoá để loại trừ KN này. Đáp ứng miễn dịch tế bào và đáp ứng miễn dịch dịch thể là hai phương thức đặc hiệu bảo vệ cơ thể. Đối với đáp ứng miễn dịch dịch thể, các KT hòa tan, tổng quát hơn là các globulin miễn dịch (immunoglobulin) đảm đương chức năng này. Nó được sản xuất từ tế bào plasma, biệt hóa từ tế bào lympho B. 1.1.1. Tế bào lympho B Hình 1.1: Nguồn gốc tế bào lympho B Thời kỳ bào thai, tế bào lympho B có nguồn gốc từ gan và tuỷ xương thai nhi 9 Thời kỳ trưởng thành tế bào lympho B xuất hiện tại tủy xương và cũng trưởng thành ngay tại đó rồi di cư tới các cơ quan và mô lympho ngoại vi.  Quá trình tăng sinh, biệt hóa của tế bào lympho B Quá trình tăng sinh và biệt hóa tế bào lympho B diễn ra với sự thay đổi sIg, có thể chia quá trình này thành hai giai đoạn. − Giai đoạn 1 : Biệt hoá không cần kháng nguyên (quá trình chín và chọn lọc tại tủy xương) + Các tế bào B gốc trong tuỷ xương phát triển thành tiền tế bào lympho B chưa có sIg mà chỉ có IgM trong bào tương. + Tiếp theo các tiền tế bào lympho B phát triển thành tế bào lympho B chưa chín, có sIgM. + Sau đó các tế bào này tiếp tục phát triển thành tế bào lympho B chín, với sự xuất hiện khoảng 0,5 - 1, 5.105 phân tử sIg, gồm sIgM và sIgD. + Các sIg hoạt động như các thụ thể (BCR), tức là có khả năng nhận biết đặc hiệu KN nhưng chưa có khả năng sản xuất kháng thể. Cho đến đây, sự phát triển của tế bào lympho B không cần sự kích thích của KN và sự hỗ trợ của tế bào lympho T. − Giai đoạn 2 : Sự hoạt hoá dưới tác dụng của kháng nguyên (biến đổi chức năng của tể bào B sau khi được hoạt hóa bởi KN) Giai đoạn này diễn ra khi có sự xuất hiện của kháng nguyên, sau khi tế bào B trinh nữ tiếp xúc với kháng nguyên sẽ thành tế bào B được hoạt hóa, biến đổi về phenotype và chức năng. Tùy theo bản chất của KN, đáp ứng của tế bào B tạo kháng thể cần hoặc không cần sự hỗ trợ của tế bào lympho T hỗ trợ: 10 + KN phụ thuộc vào tế bào T (phụ thuộc tuyến ức): đó là những Kn có bản chất là protein, cần phải được xử lý và giới thiệu bởi các tế bào APC và cần có sự hỗ trợ của tế bào T h. + KN không phụ thuộc tế bào T (không phụ thuộc tuyến ức): có bản chất là polysaccharide, lipid và các KN không phải protein, chúng có chứa nhiều tập hợp KN giống nhau.  Quá trình bắt giữ và trình diện kháng nguyên Các tế bào trình diện KN trong trường hợp này là các ĐTB, tế bào Dendritic, tế bào Langerhans của da, tế bào nội mạc mạch. Tế bào lympho B cũng là một APC. Kháng nguyên vào bằng đường máu sẽ theo các tiểu tĩnh mạch về lách, nơi này nó sẽ bị bắt giữ bởi các APC trong lách Kháng nguyên vào từ đường da và biểu mô, một phần bị các tế bào có tua mang theo, một phần ở dạng tự do tới mạch bạch huyết và đến hạch lympho. Đây cũng là nơi các tế bào B “trinh nữ” tiếp xúc với kháng nguyên và được hoạt hóa. Tuy nhiên tế bào B chỉ có khả năng nuốt những KN nhỏ hoà tan và đặc hiệu với sIg. Sau khi kết hợp cả phức hợp KN-KT này được chuyển vào nội bào và KN được xử lý như ở các tế bào trình diện KN loại to và sau đó tự mình, tế bào lympho B trình diện KN cho tế bào lympho T. Đối với KN không phụ thuộc tuyến ức, tế bào lympho B có thể bị hoạt hoá trực tiếp, không cần sự hỗ trợ của tế bào lympho T. Điều kiện để các APC có thể trình diện được KN đó là chúng có khả năng xử lý các KN đã thực bào và có biểu lộ phân tử MHC II trên bề mặt. Thông thường với các KN phụ thuộc tuyến ức, các APC sau khi xử lý KN sẽ trình diện epitop KN liên kết phân tử MHC II cho tế bào lympho T và lympho B (các tế bào B có cả hai phân tử MHC lớp I và MHC lớp II) tại các hạch [...]... nhân do KTCTT có thể ở cả nam và nữ Thường ở những người có tiền sử thắt ống dẫn tinh [1,15], những người có tổn thương bao tinh hoàn [7,12] dẫn đến sự tiếp xúc KN tinh trùng với máu, tạo ra KTCTT Còn ở nữ, sự xuất hiện KTCTT sẽ có khi cơ thể người phụ nữ nhận diện kháng nguyên tinh trùng từ người chồng, hiện tạo ở nước ta vẫn chưa có thống kê về KTCTT ở người nữ vô sinh Những nghiên cứu về vô sinh như... Các bước nghiên cứu − Nghiên cứu gây mẫn cảm thỏ + Chọn đối tượng nghiên cứu + Gây mẫn cảm thỏ + Thu hoạch huyết thanh và định lượng KT bằng kỹ thuật Elisa − Xác định KTCTT ở các cặp vợ chồng nghi ngờ vô sinh do miễn dịch + Chọn đối tượng nghiên cứu + Thu thập thông tin về đối tượng:  Tên  Giới  Tuổi + Lấy máu tĩnh mạch đối tượng cần nghiên cứu, tách huyết thanh, khử bổ thể 36 + Xác định nồng độ KTCTT... của người vợ có KTCTT, KT trong huyết thanh người vợ sẽ kết hợp với kháng nguyên trên bề mặt của 32 tinh trùng chồng, tinh trùng tạo thành phức hợp KN-KT, chúng “cụm lại” mất khả năng di chuyển hay chính là “ngưng kết” Dùng kỹ thuật ngưng kết tinh trùng Franklin-dukes (F-D test) [8] Điều kiện tiên quyết để áp dụng F-D test : nồng độ tinh trùng ít nhất khoảng 20*106 / ml, pha loãng với đệm Baker và huyết... TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng nghiên cứu  Đối tượng là thỏ : 3 thỏ, to, khỏe, cân nặng từ 2-2,5kg  Đối tượng là bệnh nhân được xác định là vô sinh, đã loại trừ các nguyên nhân khác và nghi ngờ do miễn dịch, có chỉ định làm xét nghiệm tìm KTCTT tại bộ môn miễn dịch-sinh lý bệnh trường đại học Y Hà Nội 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang 2.2.2 Các bước nghiên. .. thiếu được trong nghiên cứu và chẩn đoán dựa trên các đặc tính liên kết KN đặc hiệu và tính ổn định cao Từ hơn một thế kỷ trước, các nghiên cứu của Emil Behring và Shibasaburo Kitasato đã cho thấy có thể thu nhận các phân tử liên kết đặc hiệu từ máu Kể từ đó, các KT có tính đặc hiệu cụ thể đã được sản xuất bằng cách sử dụng một KN để gây miễn dịch trên các động vật thí nghiệm Một vài tuần sau khi gây... a,b: tinh trùng ngưng kết, c: tinh trùng không ngưng kết Nguyên tắc của kỹ thuật ngưng kết dựa vào phản ứng ngưng kết của KN-KT Tiêu biểu cho kỹ thuật ngưng kết là xét nghiệm tìm nhóm máu Trong thử nghiệm về KTCTT, tinh trùng là các tế bào trên bề mặt mang các dấu ấn KN Ta dùng một mẫu huyết thanh làm chứng dương, đó là mẫu huyết thanh được chế tạo từ kỹ thuật gây mẫn cảm, một mẫu làm chứng âm (có thể. .. hai, thứ ba và thứ 4 tiêm KT TT vào cơ thể thỏ, hiện tượng đáp ứng miễn dịch của thỏ diễn ra càng sau càng mạnh hơn , kéo dài hơn và sớm hơn Sau quá trình tạo mẫn cảm KT thỏ, khi thu hoạch huyết thanh, ta có thể thu được huyết thanh thỏ có KTCTT với nồng độ cao, dùng để làm chứng dương cho nghiên cứu  Kỹ thuật gây mẫn cảm Ngày nay, phương pháp miễn dịch sử dụng kháng thể đã trở thành không thể thiếu... nhiêu phần trăm, xác định mức độ ngưng kết + Kết quả được xem là dương tính khi toàn bộ số tinh trùng ngưng kết còn hoạt động trên toàn bộ số tinh trùng hoạt động, tỷ số này phải >10% 2.2.3 Các kỹ thuật nghiên cứu  Kỹ thuật gây mẫn cảm − Chọn đối tượng thỏ − Mẫu tinh dịch của nhiều người (có số lượng TT từ 60.10 6 TT/ml trở lên) độ hoạt động của TT trên 70%, trộn đều với nhau − KN TT người được trộn... của KTCTT có thể gây ngưng kết tinh trùng qua thông định tính phần trăm tinh trùng ngưng kết Do đó các thông số của các F-D test vẫn có thể dao động và không có con số cụ thể 1.5.3 Kỹ thuật Elisa Vào năm 1960, thấy rằng phương pháp miễn dịch có gắn chất phóng xạ tiềm ẩn mối nguy hiểm vì vậy người ta nghĩ đến một phương pháp mới trong đó tín hiệu được phát ra không phải nhờ phóng xạ Khi đó người ta biết... biết đến như: − Bất thường chất lượng và số lượng tinh trùng- nguyên nhân hàng đầu là giãn tĩnh mạch tinh 28 − Không tinh trùng (azoospermia) do: Bệnh bẩm sinh (hội chứng Klinefelter- NST: XXY,, bất thường AZF…) không ống dẫn tinh bẩm sinh hay tắc mào tinh − Rối loạn nội tiết do suy tuyến sinh dục − Tinh hoàn ẩn 1 hoặc 2 bên − Xuất tinh ngược dòng hoặc không xuất tinh − Yếu tố nguy cơ: Nghiện thuốc . trong chẩn đoán và điều trị vô sinh. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài về Nghiên cứu về kháng thể chống tinh trùng và ứng dụng xác định kháng thể chống tinh trùng trên người nhằm thực hiện. 1 B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI *** Nghiên cứu về kháng thể chống tinh trùng và ứng dụng xác định kháng thể chống tinh trùng trên ngời Chuyờn ngnh: Min dch Sinh lý bnh KHểA LUN. biết tinh trùng là một kháng nguyên lạ, cơ thể sẽ sản xuất ra kháng thể chống lại và tiêu diệt tinh trùng dẫn đến hiện tượng vô sinh, kháng thể đó được gọi là kháng thể chống tinh trùng. Trong