Khóa luận tốt nghiệp 1 Trần Hà Ngọc Trâm – Sinh K34 MỞ ĐẦU Rừng ngập mặn là kiểu rừng phát triển trên vùng đất lầy, ngập nƣớc mặn vùng cửa sông, ven biển, dọc theo các sông ngòi, kênh rạch có nƣớc lợ do thủy triều lên xuống hàng ngày. Nó đóng vai trò rất quan trọng đối với con ngƣời, động vật và hệ sinh thái xung quanh. Rừng ngập mặn có giá trị lớn về kinh tế – xã hội nhƣ cung cấp thực phẩm (các loại hải sản, đƣờng, mật ong…), dƣợc phẩm, năng lƣợng (than các cây đƣớc, vẹt ít khói, năng lƣợng cao), lâm sản (gỗ các loại cây nhƣ đƣớc, vẹt, cóc…)… Một vai trò vô cùng to lớn mà chúng ta phải nhắc đến ở đây là rừng ngập mặn có vai trò chống biến đổi khí hậu và điều hòa khí hậu. Rừng ngập mặn đƣợc ví nhƣ lá chắn xanh bảo vệ vùng cửa sông, cửa biển để chống xói lở, hạn chế tác hại của gió bão và sóng thần, mở rộng đất liền Rừng ngập mặn không chỉ hấp thụ một lƣợng CO 2 do hoạt động công nghiệp và sinh hoạt thải ra mà còn sản sinh ra một lƣợng O 2 rất lớn làm cho bầu không khí trong lành [35]. Tuy nhiên, diện tích rừng ngập mặn đang ngày càng suy giảm do hậu quả của chiến tranh, bom đạn và chất diệt cỏ với liều lƣợng cao; do sự tàn phá của con ngƣời; hay thảm họa của thiên nhiên. Ở Thừa Thiên Huế, hiện tại, rừng ngập mặn chỉ còn chƣa đầy 8 ha, chủ yếu ở Rú Chá (Hƣơng Phong, Hƣơng Trà), Tân Mỹ (Phú Vang), Cù Du (Cảnh Dƣơng, Phú Lộc), Đầm Lập An (Lăng Cô, Phú Lộc). Diện tích rừng ở địa bàn đang ngày càng thu hẹp chủ yếu do ngƣời dân khai thác cây ngập mặn đốn củi, lấy đất làm ao nuôi tôm, xây dựng các khu đô thị, khu nghĩ dƣỡng [32]. Vi khuẩn cố định nitrogen có khả năng cố định N 2 trong khí quyển thành NH 3 dùng làm nguồn N để tổng hợp chất hữu cơ cho cây. Chính vì vậy, việc bổ sung vi khuẩn cố định nitrogen vào hệ sinh thái rừng ngập mặn có ý nghĩa quan trọng trong việc sinh trƣởng, phát triển của cây trồng đặc biệt là đối với cây con trong vƣờn ƣơm; duy trì độ phì của đất và mở rộng diện tích rừng ngập mặn. Vi khuẩn cố định nitrogen làm phân bón cho cây con trong vƣờn ƣơm là những giống bản địa, đƣợc phân lập và tuyển chọn tại đất rừng ngập mặn trên địa bàn. Nên nó thích nghi trong đất rừng ngập mặn tạo điều kiện cho cây sinh trƣởng và phát triển tốt. Khóa luận tốt nghiệp 2 Trần Hà Ngọc Trâm – Sinh K34 Không những thế, sử dụng phân vi khuẩn cố định nitrogen là giải pháp tối ƣu. Hạn chế đƣợc những nhƣợc điểm của phân bón hóa học, tránh ô nhiễm môi trƣờng, bảo vệ hệ sinh thái rừng ngập mặn. Để góp một phần nhỏ trong hƣớng nghiên cứu vi khuẩn cố định nitrogen làm cơ sở cho việc sử dụng chúng trong ƣơm nhân, gây trồng rừng ngập mặn ở Thừa Thiên Huế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu vi khuẩn cố định nitrogen phân lập từ đất rừng ngập mặn ở Thừa Thiên Huế." Bƣớc đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, do điều kiện thời gian có hạn nên không tránh khỏi những thiếu sót trong bài khóa luận, chúng tôi rất mong đƣợc sự góp ý chân thành của tất cả thầy cô giáo và các bạn. Khóa luận tốt nghiệp 3 Trần Hà Ngọc Trâm – Sinh K34 Phần 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NITROGEN 1. Các vi sinh vật có khả năng cố định nitrogen Vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trình cố định nitrogen là những vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitrogen phân tử trong không khí thành các hợp chất chứa nitrogen và làm giàu thêm nguồn dự trữ thức ăn nitrogen trong đất [8]. Những vi sinh vật có khả năng cố định nitrogen thƣờng gặp nhƣ:  Vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây thuộc bộ Đậu.  Vi khuẩn hiếu khí sống tự do thuộc chi Azotobacter và Beiferinckia.  Vi khuẩn kị khí sống tự do thuộc chi Clostridium.  Tảo lam sống tự do và tảo lam sống cộng sinh ở bèo hoa dâu.  Các nhóm vi sinh vật khác nhƣ:  Họ Pseudomonadaceae: Azotomonas insolita, A. fluorescens, Pseudomonas azotocolligans, P. azotogensis, P. methanitrificens, P. non-liquefaciens, P. herbicola, nhiều loài Pseudomonas sp.  Họ Spirillaceae: Spirillum lipoferum, S. azotocolligens, S. magnum, S. speciosum, S. nana, Vibrio frequens, V. hydrosulfureus, V. non hydrosulfurus, Desulfovibrio desulfuricans, Desulfovibrio sp.  Họ Azotobacteriaceae: Derxia gummosa, D. indica.  Họ Rhizobiaceae: Agrobacterium radiobacter.  Họ Achromobacteraceae: Achromobacter parbutus, A. hartlebii.  Họ Enterbacteriaceae: Aerobacter aerogenes, Klebsiella pneumonia, Klebsiella rubiacearum.  Họ Corynebacteriaceae: loài Arthrobacter sp.  Họ Bacillaceae: Bacillus polymixa, B. megaterium, Thermobacillus azotofigens, B. trufauti, Methannobacterium omeliansskii.  Họ Thiorhodaceae: nhiều loài thuộc chi Chromatium.  Họ Athiorhodaceae: Thodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas capsulatus, R. gelatinosa, R. spherodes, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum sp. Khóa luận tốt nghiệp 4 Trần Hà Ngọc Trâm – Sinh K34  Họ Chlorobacteriaceae: Chloropseudomonas ethylicum, Chlorobium limicola, C. thiosulfatophilum.  Họ Hyphomicrobiaceae: Rhodomicrobium vannielii.  Họ Mycobacteriaceae: Mycobacterium roseo-album, M. invisible, M. azot- absorptum.  Họ Actinomucetaceae: Nocardia calcaren, N. cellulans, Streptomyces elephanatis primigeni, S. denitrificans, S. griseo-viridis, S. putrificus, S. azotophilus, S. griseus, S. cylundrospora, S. aureofaciens, S. ruber, S. albidoflavus, S. fumosus, S. candidus, S. miaveolus, S. globisporus, S. coelicolor, S. griseoruber.  Họ Treponemataceae: Treponema hyponeustonicum.  Một số đại diện của nấm men và nấm mốc: Saccharomyces apiculatus, S. ellipsoideus champagne, S. ellipsoideus, S. cerevisiae, Torula wiesneri, Oidium lactis [8]. 2. Sơ lƣợc về vi khuẩn cố định nitrogen Năm 1983, Vinogratski đã phân lập đƣợc vi khuẩn kỵ khí cố định nitrogen là Clostridium pasteurianum. Năm 1901, M. W. Beijerinck phân lập đƣợc hai loài vi khuẩn hiếu khí cố định nitrogen là Azotobacter chroococcum và Azotobacter agilis. Về sau ngƣời ta tìm thấy nhiều loài khác trong chi này (nhƣ Azotobacter beijerinckii, Azotobacter vinelendii…) [6]. Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng cố định nitrogen phân tử, khả năng kích thích sinh trƣởng, phát triển cây trồng thông qua sự tạo thành các chất trao đổi trung gian của nhóm vi khuẩn này. Vi khuẩn cố định nitrogen có thể là vi khuẩn hiếu khí (Azotobacter, Klebsiella, Bacillus), kỵ khí bắt buộc (Clostridium, Desulfovibrio, Desulfotomaculum…) [6].  Azotobacter: là loài vi khuẩn hiếu khí không bắt buộc hay vi hiếu khí, sống tự do trong tự nhiên, là vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, di động nhờ tiên mao mọc quanh khắp cơ thể hoặc bất động. Vi khuẩn thuộc chi Azotobacter có tế bào hình trứng với đƣờng kính 1,5 – 2,0 µm hoặc lớn hơn, có khả năng thay đổi hình dạng, từ hình que đến hình tròn. Phần lớn tế bào tồn tại riêng rẽ hoặc từng đôi hay có thể liên kết thành chuỗi với độ dài khác nhau. Tế bào sinh sôi nảy nở theo lối phân cắt đơn giản. Trên các môi trƣờng chứa nitrogen, khuẩn lạc của Azotobacter có dạng nhầy, lồi, đôi Khóa luận tốt nghiệp 5 Trần Hà Ngọc Trâm – Sinh K34 khi nhăn nheo. Khi nuôi cấy lâu trên môi trƣờng đặc, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng hoặc màu nâu đen (tùy thuộc theo loài). Khi về già hoặc khi xử lý một số hóa chất nhƣ n - butanol… tế bào Azotobacter chuyển sang dạng nang. Thể nang giúp tế bào tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣ nhiệt độ cao, thiếu nƣớc… [7]. Azotobacter phân bố rộng rãi trong đất, nƣớc và bùn. Theo các tác giả Zinovieva K. G., Mitsuxtin E. N. và Silnicova V. K. (1968) cho biết, ngoài khả năng cố định nitrogen, Azotobacter còn có khả năng tổng hợp các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật nhƣ auxin, gibberellin và tích lũy trong môi trƣờng nuôi cấy nhiều chất có hoạt tính sinh học cao nhƣ vitamin B 1 , B 2, B 6 , B 12 , acid nicotinic, acid pantothenic, lycine… [6].  Azospirillum: Năm 1922, Beijerinck phân lập đƣợc vi khuẩn này từ đất nghèo nitrogen ở Hà Lan và đặt tên là Azotobacter lipoferum. Vào năm 1962 – 1963, Becking lại phân lập từ nhiều vùng đất khác nhau và khẳng định khả năng cố định nitrogen của chúng bằng phƣơng pháp sử dụng N 15 . Sau đó (1976), Doeberiner và cộng sự đã miêu tả sự phân bố rộng rãi của vi khuẩn này trong vùng rễ nhiều cây thuộc họ Hòa thảo nhiệt đới (đặc biệt ở Brazil) cũng nhƣ ảnh hƣởng của chúng đến sinh trƣởng của cây. Dựa vào các đặc điểm sinh lý và thành phần base của nhân, vi khuẩn này đƣợc xếp vào một chi riêng có tên là Azospirillum. Tế bào của Azospirillum hình que uốn cong nhẹ, kích thƣớc khoảng 2,0 – 4,6 µm. Khi môi trƣờng trở nên kiềm hóa hoặc dƣ thừa O 2 trong dịch nuôi cấy xuất hiện những dạng tế bào dị thƣờng. Ở môi trƣờng dịch thể, Azospirillum vận động nhờ tiên mao đơn cực. Khả năng sử dụng glucose hay saccharose cũng là một thông số quan trọng để phân biệt các loài thuộc chi Azospirillum. Chúng phân bố nhiều trong đất ngập nƣớc, cố định nitrogen trong điều kiện vi hiếu khí, đặc biệt ở vùng rễ nhiều cây họ Hòa thảo. Vi khuẩn này phân bố nhiều trong đất trồng lúa và rễ lúa. Số lƣợng Azospirillum trong đất canh tác thƣờng lớn hơn so với đất hoang (Charyulu và Rao, 1980) [9]. Nhiều nghiên cứu còn xác định, khi nhiễm Azospirillum, ngoài sự gia tăng sinh trƣởng của cây, chúng còn ảnh hƣởng đến sự thay đổi các chỉ số về lá. Khi lây nhiễm Azospirillum còn kích thích sự nảy mầm của hạt và chiều dài của rễ. Tuy nhiên, nồng độ cho phép nhiễm vi khuẩn vào hạt giống và cây mạ của nhiều loại rau, lúa (từ Khóa luận tốt nghiệp 6 Trần Hà Ngọc Trâm – Sinh K34 3 – 4 tuần tuổi) chỉ khoảng 10 5 – 10 6 tế bào/ml. Thông thƣờng nồng độ Azospirillum cao khoảng 10 8 – 10 10 tế bào/ml thƣờng làm ức chế sự phát triển của rễ, chiều cao, trọng lƣợng của cây mạ [3], [11].  Beijerinckia: Tế bào của Beijerinckia thƣờng tồn tại riêng rẽ, tế bào có hình dạng thay đổi (hình cầu đến hình que), khi về già có thể tạo nên những hình dạng rất khác thƣờng. Khi phát triển trên môi trƣờng vô đạm chứa glucose, Beijerinckia thƣờng tạo thành những khuẩn lạc lồi và rất nhầy, khi già mới tạo sắc tố. Beijerinckia có thể phát triển trong phạm vi nhiệt độ 16 – 37 o C. Một số nghiên cứu cho biết, thời kỳ tiềm phát (lag phase) là ngắn nhất khi nuôi cấy ở nhiệt độ 30 – 35 o C và pH là 4,5 – 5,3 (Strydom B. W.,1966). Beijerinckia thuộc loại Gram âm, không sinh bào tử, kích thƣớc khoảng 0,5 – 1,15 × 1,17 – 4,5 µm [7]. Beijerinckia phân bố rộng rãi trong các đất vùng nhiệt đới và chống chịu oxygen kém hơn so với Azotobacter. Ngoài khả năng cố định nitrogen phân tử, Beijerinckia còn có khả năng tổng hợp một số chất hoạt động sinh học có tác dụng kích thích sinh trƣởng của cây trồng [6].  Xanthobacter: Năm 1977, Wiegel và cộng sự đã xếp Xanthobacter thành một chi riêng thuộc họ Azotobacteriaceae. Chúng có hình que, kích thƣớc 0,4 – 1,0 × 0,8 – 6,0 µm. Chúng thuộc loại vi khuẩn Gram dƣơng nhƣng siêu cấu trúc thành tế bào lại biểu hiện đặc điểm của vi khuẩn Gram âm, có chu mao, sinh trƣởng hiếu khí bắt buộc, phát triển tốt ở 25 – 30 o C, pH thích hợp là 5,8 – 9,0. Khuẩn lạc mờ đục, nhầy, có màu vàng do tạo thành sắc tố carotenoid không hòa tan trong nƣớc. Sinh trƣởng tự dƣỡng hóa năng trong môi trƣờng khoáng với sinh quyển chứa H 2 , O 2 , CO 2 theo tỷ lệ 7 : 2 : 1 về thể tích, cố định nitrogen trong điều kiện vi hiếu khí, phân bố trong đất ẩm và nƣớc [10].  Azotomonas: Tế bào của Azotomonas có hình que tƣơng tự nhƣ Azotobacter, kích thƣớc nhỏ hơn, tồn tại riêng rẽ hoặc tạo thành từng đám. Chúng có khả năng sinh chất nhầy ngoại bào rất dai hoặc có chứa các thể lipoid hình cầu, sinh sắc tố huỳnh quang màu trắng tan trong nƣớc. Azotomonas là vi khuẩn dị dƣỡng carbon, sử dụng nhiều loại đƣờng, rƣợu, acid hữu cơ. Thuộc chi này có nhiều loài khác nhau (nhƣ Azotomonas agilis, Azotomonas macrocytogenes…) [6]. Khóa luận tốt nghiệp 7 Trần Hà Ngọc Trâm – Sinh K34  Herbaspirillum: Vi khuẩn này đƣợc Doeberiner và cộng sự phát hiện năm 1987. Chúng có những đặc điểm giống Azospirillum nhƣng kích thƣớc lại nhỏ hơn, có thể có tới 2 – 3 tiên mao ở một hoặc hai cực, phân bố nhiều ở vùng rễ cây Hòa thảo [10].  Aquaspirillum: Chi này chỉ có hai loài có khả năng cố định nitrogen trong điều kiện vi hiếu khí là Aquaspirillum peregrinum và Aquaspirillum fasciculus, phân bố trong nƣớc, vận động nhờ tiên mao ở hai cực.  Clostridium: Là giống vi khuẩn kị khí sống tự do có khả năng cố định nitrogen. Tế bào có kích thƣớc 2,5 – 7,5 × 0,7 – 1,3 µm, đứng riêng rẽ hoặc từng chuỗi ngắn. Khi còn non tế bào chất đồng đều, có khả năng di động, khi về già tế bào chất có cấu tạo hạt, tế bào mất khả năng di động. Loài Clostridium pasteurianum thƣờng có hoạt tính cố định nitrogen cao hơn các loài khác trong chi Clostridium. Khi đồng hóa hết 1 g đƣờng, chúng thƣờng tích lũy khoảng 5 – 10 mg nitrogen. Khả năng cố định nitrogen trong phạm vi pH 4,7 – 8,5. Các nghiên cứu ở Việt Nam, với các vùng đất chua không tìm thấy sự phát triển của Azotobacter thì Clostridium vẫn có mặt. Clostridium là vi khuẩn Gram dƣơng, sinh bào tử, có thể chịu nhiệt độ cao tới 75 o C trong 5 giờ và 1 giờ ở 80 o C, phân bố nhiều trong đất và bùn. Đã có nhiều thí nghiệm sử dụng chế phẩm Clostridium pasteurianum (dịch nuôi cấy hoặc dịch nuôi trộn với đất đã khử trùng) để bón cho cây, trong một số trƣờng hợp đã thu đƣợc hiệu quả khá cao (nhất là khi phối hợp sử dụng với azotobacterin) [6].  Vi khuẩn quang năng cố định nitrogen: Đặc điểm chung cho nhóm vi khuẩn này là sự tồn tại của chlorophyll hoặc các hợp chất carotene. Ngoại trừ Cyanobacteria, nhóm vi khuẩn quang năng thực hiện quang hợp trong điều kiện kỵ khí, không giải phóng O 2 , cố định N 2 trong điều kiện vi hiếu khí. Các chủng đại diện có khả năng cố định nitrogen thƣờng gặp ở các họ Rhodospirillaceae và Chlorobiaceae [6], [7].  Các nhóm vi khuẩn khác: Ngoài các đối tƣợng đã nêu trên, khả năng cố định nitrogen còn gặp ở một số loài thuộc họ Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Corynebacteriaceae, Methanomonadaceae, Thiobacteriaceae. Tuy nhiên, khả năng cố định nitrogen của chúng không lớn lắm. 3. Vai trò của vi khuẩn cố định nitrogen Vai trò quan trọng nhất của vi khuẩn cố định nitrogen là cung cấp nitrogen cho cây trồng. Trong thực tế thực vật (cũng nhƣ ngƣời và các loài động vật) không có khả Khóa luận tốt nghiệp 8 Trần Hà Ngọc Trâm – Sinh K34 năng đồng hóa trực tiếp nitrogen không khí. Bởi vì trong không khí, phân tử nitrogen tồn tại ở trạng thái liên kết hai nguyên tử N lại với nhau nhờ liên kết ba rất bền (năng lƣợng của liên kết ba này là vào khoảng 255 Kcal/M). Vi khuẩn cố định nitrogen là tác nhân chuyển hóa nitrogen không khí thành nitrogen trong các dạng hợp chất mà cây hấp thu và chuyển hóa đƣợc. Trong công nghiệp phân hóa học chuyển hóa N 2 thành các hợp chất của nitrogen (muối ammonium, urea, nitrate) cần tiêu tốn nhiều năng lƣợng. Năng lƣợng cần thiết để tổng hợp ra một tấn NH 3 tƣơng đƣơng với năng lƣợng sinh ra khí đốt cháy 5 tấn than đá. Khó khăn chủ yếu làm cản trở việc mở rộng nhanh chóng hơn nữa việc sản xuất phân nitrogen hóa học là vì điều kiện để phá vỡ các liên kết trong phân tử N 2 nhƣ cần nhiệt độ cao, áp suất cao và nhiều chất xúc tác đắt tiền. Trong khi đó các vi sinh vật thực hiện cơ chế cố định nitrogen ngay trong các điều kiện bình thƣờng về nhiệt độ và áp suất. Chính vì vậy mà vi sinh vật cố định nitrogen có ý nghĩa hết sức lớn lao đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nƣớc có nền sản xuất phân hóa học chƣa phát triển [8]. Bên cạnh đó, vi khuẩn cố định nitrogen còn đƣợc biết đến với nhiều vai trò nhƣ:  Kích thích sinh trƣởng, phát triển của thực vật bằng cách tạo ra các enzyme hay các hormone thực vật.  Giảm tác động có hại của mầm bệnh bằng cách cạnh tranh dinh dƣỡng, nơi cƣ trú hay tạo các kháng sinh, enzyme thủy phân chống lại sự xâm nhập của kẻ thù hay cảm ứng hệ thống phòng vệ của cây ký chủ.  Giúp cây hấp thụ hiệu quả các ion sắt, kẽm và các nguyên tố vi lƣợng khác [24], [25], [26]. Nhiều công trình nghiên cứu về việc sử dụng chế phẩm vi khuẩn Azotobacter (gọi là azotobacterin). Đây là dịch nuôi Azotobacter đƣợc hấp thụ vào than bùn nhằm nâng cao sản lƣợng cây trồng [6]. Ở Liên Xô (cũ) ngƣời ta sử dụng khá nhiều azotobacterin – một loại chế phẩm có chứa vi khuẩn Azotobacter chroococcum. Những tài liệu hƣớng dẫn hiện có về việc sử dụng azotobacterin đều cho rằng, nên sử dụng rộng rãi azotobacterin để cải thiện sinh trƣởng của cây trồng. Ngƣời ta coi chế phẩm này không chỉ là phân đạm mà còn là nguồn kích thích sinh trƣởng của cây. Trong đất trồng rau hoặc trồng lúa, Azotobacter có thể làm tăng sản lƣợng đến 30% Khóa luận tốt nghiệp 9 Trần Hà Ngọc Trâm – Sinh K34 [18]. Trong điều kiện thuận lợi azotobacterin cố định đƣợc 10 – 30 mg nitrogen khi sử dụng hết 1 g đƣờng [27]. Sử dụng chế phẩm azotobacterin lây nhiễm cho đất trồng lúa, ngoài khả năng cung cấp nitrogen cho lúa và giảm sự tiêu thụ nitrogen của phân bón, chế phẩm này còn làm tăng độ phì nhiêu cho đất [28], [29]. Những tài liệu của Brantxevits (1963) và Sende S. T. (1965) về ảnh hƣởng của Azotobacter đến một số đặc điểm sinh hóa của cây cho biết, xử lý Azotobacter cho hạt giống trƣớc khi gieo đã làm tăng hoạt tính của các enzyme ascorbinoxydase, peroxidase, catalase và thể hiện mạnh nhất trong thời kì sinh trƣởng đầu tiên của cây. Những loại enzyme này là chỉ tiêu quan trọng về cƣờng độ oxy hóa khử của cây, liên quan trực tiếp đến tính chống chịu của cây đối với nhiều loại bệnh. Điều này đặt cơ sở cho giả thiết rằng Azotobacter có tác dụng giảm tính mẫn cảm của cây đối với một số bệnh do ảnh hƣởng của nó đến cƣờng độ các quá trình oxy hóa khử của cây [3], [15]. Một số nghiên cứu còn xác định, chế phẩm Azotobacter có tính diệt nấm và có khả năng kìm hãm sinh trƣởng của nhiều nấm nhƣ Fusarium, Alternaria, Penicillium…, những loài nấm này thƣờng ảnh hƣởng không tốt đến cây. Azotobacter có thể sản sinh một số chất ức chế một số loài vi khuẩn, nấm gây bệnh thực vật. Nhờ đó, cây trồng có thể tăng sức chống chịu dịch bệnh, tăng sinh trƣởng, phát triển và năng suất. Các nghiên cứu còn cho thấy, những cây mọc từ hạt giống đƣợc tẩm vi khuẩn Azotobacter chín sớm hơn, điều này có ý nghĩa đặc biệt khi trồng rau [7], [27]. II. CƠ CHẾ CỐ ĐỊNH NITROGEN CỦA VI SINH VẬT Trong một thời gian dài cơ chế của quá trình cố định nitrogen vẫn là một bí mật hấp dẫn của tự nhiên. Trong khi con ngƣời phải sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất cao (400 – 500 o C, 200 – 1000 atm) để phá vỡ liên kết ba trong phân tử N 2 (có năng lƣợng là 9,4 x 10 5 J/Mol) thì các vi sinh vật cố định nitrogen lại có thể đồng hóa N 2 ngay trong các điều kiện rất bình thƣờng về áp suất và nhiệt độ [2]. Quá trình cố định nitrogen của vi sinh vật là quá trình khử N 2 thành NH 3 với sự tham gia của phức enzyme hydrogenase hoạt hóa hydrogen và enzyme nitrogenase hoạt hóa nitrogen khi có ATP. Sơ đồ trung tâm hoạt động của nitrogenase đƣợc trình bày nhƣ sau: Electron của các chất khử (ferredoxin, ditionit) đi vào trung tâm có chứa Fe của thành phần enzyme II (protein – Fe) và tiếp tục chuyển cho thành phần enzyme I Khóa luận tốt nghiệp 10 Trần Hà Ngọc Trâm – Sinh K34 (protein – Fe – Mo). Electron đã đƣợc hoạt hóa sẽ đi theo mạch nguyên tử Fe để đến Mo ở bên trong. Mo sẽ bị khử và có khả năng phản ứng nhanh chóng với N 2 . Phân tử N 2 đi qua một khe có kích thƣớc 4 – 5 A 0 tức là tƣơng ứng với chiều dài của phân tử N 2 vào bên trong enzyme và đƣợc hoạt hóa ở đó. Kết quả của quá trình nitrogenase hoạt hóa và hấp thụ hóa học nitrogen sẽ làm đứt hai liên kết trong phân tử N 2 . Năng lƣợng tiêu phí là 7,8 x 10 5 J/Mol. Liên kết thứ ba sẽ bị cắt đứt khi tiếp xúc với hydrogen đã đƣợc hoạt hóa nhờ các enzyme dehydrogenase và hệ thống hydrogenase [2]. Cơ chế cố định nitrogen đƣợc thể hiện qua phƣơng trình sau: N 2 + 6 H + + 6 e - + 16ATP 2 NH 3 + 16 ADP + 16 Pi Để tạo 2 phân tử ammonium từ một phân tử N 2 tiêu tốn 16 ATP cùng với sự cung cấp điện tử và proton H + . Phản ứng này chỉ xảy ra khi N 2 gặp phức hệ nitrogenase. Đầu tiên, Fe – protein bị khử do những điện tử đƣợc cho bởi ferredoxin. Sau đó, Fe – protein này bị hoạt hóa bởi ATP và tiếp tục khử Mo – Fe – protein; từ đây nó sẽ nhƣờng điện tử cho N 2 tạo NH = NH. Ngoài ra còn có hai chu trình khác thuộc quá trình này làm NH = NH bị khử thành H 2 N – NH 2 và quay lại khử thành hai phân tử NH 3 [31]. Những nghiên cứu gần đây về quá trình cố định nitrogen cho thấy quá trình này đòi hỏi:  Có sự tham gia của enzyme nitrogenase. Có thể coi đây là nhân tố chìa khóa cho quá trình này. Enzyme này hoạt động trong điều kiện kỵ khí.  Có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP, )  Có năng lƣợng (ATP) đủ và có sự tham gia của nguyên tố vi lƣợng. Nhóm hoạt động của enzyme nitrogenase có chứa Mo và Fe. Vì vậy sử dụng Mo và Fe cho cây họ Đậu thƣờng có hiệu quả rất cao.  Tiến hành trong điều kiện kỵ khí. Các chất khử là NADH 2 và Fd cùng với năng lƣợng do hô hấp, quang hợp của cây chủ cung cấp. NH 3 tạo thành trong quá trình cố định nitrogen đƣợc sử dụng dễ dàng vào quá trình amine hóa các keto acid để tổng hợp một cách nhanh chóng các Nitrogenase [...]... Trâm – Sinh K34 Khóa luận tốt nghiệp 23 Phần 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN I PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH SỐ LƢỢNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITROGEN Từ 15 mẫu đất rừng ngập mặn ở Thừa Thiên Huế chúng tôi tiến hành phân lập đƣợc 95 chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitrogen Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1 Số lƣợng vi khuẩn cố định nitrogen trong các mẫu đất phân lập STT Kí hiệu mẫu Địa điểm lấy mẫu Nền đất Thảm... số nguyên tố vi lƣợng lại có ảnh hƣởng xấu đến hoạt động của Azotobacter Br ức chế quá trình cố định nitrogen, Al hạn chế sự phát triển của Azotobacter, Cl có tác dụng độc đối với tế bào [6] 6 Độ thoáng khí Vi khuẩn cố định nitrogen thuộc loại hiếu khí (Azotobacter, Beijerinckia, Azospirillum…) nhƣng cũng có thể phát triển đƣợc trong điều kiện vi hiếu khí Quá trình cố định nitrogen của vi khuẩn bị giảm... lần Điều này chứng tỏ đƣợc sự ảnh hƣởng của độ thoáng khí đến sinh trƣởng, phát triển của vi khuẩn cố định nitrogen Ở những nơi có độ thoáng khí lớn (đất khô, bán ngập) thì số lƣợng vi khuẩn cao, còn ở những nơi có độ thoáng khí thấp (đất ngập) thì số lƣợng vi khuẩn thấp thậm chí là rất thấp Số lƣợng vi khuẩn cố định nitrogen cao nhất ở rừng ngập mặn Tân Mỹ (trung bình 2 đợt thu mẫu là 31,26 × 106 CFU/g... phát triển của các chủng vi khuẩn cố định nitrogen Để đánh giá tốc độ sinh trƣởng, phát triển cũng nhƣ khả năng cố định nitrogen của các chủng vi khuẩn phân lập, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chúng trên môi trƣờng Ashby thạch đĩa Trong điều điện nuôi cấy không chứa nitrogen dƣới dạng hợp chất có thể hấp thu đƣợc, các chủng vi khuẩn muốn tồn tại, phát triển phải có khả năng cố định N2 không khí để sử... sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi khuẩn cố định nitrogen trên môi trƣờng là không đều Số chủng vi khuẩn không mọc và sinh trƣởng, phát triển yếu chiếm tới 37,89%, sinh trƣởng và phát triển trung bình chiếm số lƣợng lớn hơn (43,16%) Số chủng vi khuẩn sinh trƣởng, phát triển mạnh là 12,63% và rất mạnh chỉ 6,32% Trong số 95 chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitrogen, chúng tôi chọn ra 6 chủng... đến sự sinh trƣởng, phát triển của vi khuẩn cố định nitrogen Từ các mẫu đất, chúng tôi phân lập đƣợc 95 chủng vi khuẩn cố định nitrogen, kí hiệu là M1, M2, M3… M95 Dựa vào đặc điểm hình thái chúng tôi chia đối tƣợng thành các nhóm nhƣ sau:  Nhóm thứ nhất: Khuẩn lạc màu trong suốt, bề mặt trơn bóng (hoặc nhầy nhớt), tròn đều (hoặc méo), mép đều (hoặc không đều) Vi khuẩn này tìm thấy ở hầu hết các đất... cũng là ức chế quá trình cố định nitrogen của vi khuẩn Có thí nghiệm đã cho biết, khi nồng độ oxygen trong không khí là 4% thì quá trình cố định nitrogen vƣợt quá gấp ba lần so với khi nồng độ oxygen là 10 – 20% [7] 7 Các yếu tố sinh học Sinh trƣởng, phát triển và cố định nitrogen của vi khuẩn trong đất còn chịu ảnh hƣởng mật thiết của khu hệ sinh vật đất Bên cạnh các nhóm vi sinh vật có ảnh hƣởng... thạch đĩa Để xác định khả năng cố định nitrogen của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trực tiếp trên môi trƣờng Ashby thạch đĩa Tiến hành: Dùng que cấy lấy giống vi khuẩn từ ống thạch nghiêng cấy chấm vào những điểm xác định trên đĩa petri trong điều kiện vô trùng, nuôi cấy ở 30oC Sau 4 ngày, đo kích thƣớc, độ dày khuẩn lạc và đánh giá khả năng tạo sinh khối của các chủng vi khuẩn 3.2 Nuôi cấy... NITROGEN CỦA VI KHUẨN 1 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy Để xác định ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành nuôi cấy lắc hai chủng vi khuẩn M54 và M85 trong môi trƣờng Ashby dịch thể Lƣợng giống vi khuẩn là 5ml/ 50 ml dịch nuôi cấy Kế thừa các nghiên cứu trƣớc về vi khuẩn cố định nitrogen: kết quả nghiên cứu của Lê Thị Hƣơng Xuân (2005),... nhau ở các chủng vi khuẩn cố định nitrogen [6] IV TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH NITROGEN 1 Đối với nền nông nghiệp Phân bón vi sinh vật là sản phẩm sinh học, có tác dụng nâng cao năng suất và chất lƣợng nông sản, đồng thời có ý nghĩa quan trọng trong vi c bảo vệ môi trƣờng và xây dựng nền nông nghiệp sạch, bền vững sinh thái Do vậy, nghiên cứu sử dụng rộng rãi phân bón vi sinh vật trong