BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR PHÁT HIỆN SACBROOD VIRUS GÂY BỆNH TRÊN ONG MẬT TẠI HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR PHÁT HIỆN SACBROOD VIRUS GÂY BỆNH TRÊN ONG MẬT TẠI HÀ NỘI CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHẠM HỒNG THÁI TS. NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI – 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ trong việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thị Thoa Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành bản luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực học hỏi của bản thân tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của các thầy cô giáo, gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Hồng Thái - Bộ môn Côn trùng - Khoa Nông học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và TS. Nguyễn Văn Giang - Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Khoa Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã hết lòng ủng hộ và khích lệ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện ñề tài này, ñã dành nhiều thời gian và công sức chỉ dẫn, giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện ñề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Hà Viết Cường - Khoa Nông học - trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và ThS. Trịnh Thị Thủy - Khoa Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh vật và bộ môn Sinh học phân tử– Khoa Công nghệ sinh học - trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và tập thể cán bộ nhân viên Ban ñào tạo sau ñại học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện ñề tài. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Hà Nội, ngày 10 tháng09 năm 2013 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thị Thoa Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC HÌNH ix MỞ ðẦU 1 Chương 1 ỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Tầm quan trọng của ngành ong 3 1.1.1 Thế giới 3 1.1.2 Việt Nam 4 1.1.3 Các loài ong ở Việt Nam 5 1.1 Các dịch bệnh chính ñược ghi nhận trên ong mật 6 1.2 Tình hình nghiên cứu về Sacbrood virus 7 1.2.1 Lịch sử phát hiện và tác hại của bệnh virus ấu trùng túi 7 1.2.2 Triệu chứng bệnh ấu trùng túi 8 1.2.3 Cách thức lan truyền của SBV 9 1.2.4 Tác nhân gây bệnh 9 1.3 Các kỹ thuật chẩn ñoán cổ ñiển 11 1.3.1 Kỹ thuật RIA (Radio Immuno Assay) 11 1.3.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 12 1.3.3 RT – PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction) 12 1.4 Kỹ thuật Realtime- PCR 13 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 21 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 2.1.1 Thời gian 21 2.1.2 ðịa ñiểm 21 2.2 ðối tượng và vật liệu nghiên cứu 21 2.2.1 ðối tượng 21 2.2.2 Vật liệu nghiên cứu 21 2.3 Nội dung nghiên cứu 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Thu thập mẫu ong 22 2.4.2 Thí nghiệm bảo quản mẫu ong 23 2.4.3 Chẩn ñoán bệnh lâm sàng 23 2.4.4 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu ñã thu thập 24 2.4.5 Xác ñịnh khả năng chẩn ñoán của hai kỹ thuật PCR ñể phát hiện virus gây bệnh trên ong mật 26 2.5 ðánh giá về ñộ nhạy của phương pháp chẩn ñoán ñể xác ñịnh nồng ñộ của virus trên ong bệnh 29 2.5.1 Pha loãng mẫu RNA 29 2.5.2 Phản ứng Realtime – PCR 29 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 Ảnh hưởng của kỹ thuật lấy mẫu và bảo quản mẫu bệnh lên khả năng phát hiện 30 3.2 Ảnh hưởng của kỹ thuật tách chiết RNA lên khả năng phát hiện SBV 32 3.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ các mẫu ñã thu thập 32 3.3 Khảo sát tính ñặc hiệu của cặp mồi 32 3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn cặp mồi 32 3.3.2 Thử nghiêm khả năng phát hiện Sacbrood virus trên ong mật tại Hà Nội 35 3.4 Nghiên cứu, khảo sát khả năng phát hiện của Realtime- PCR 37 3.5 ðánh giá mức ñộ ñặc hiệu của cặp mồi trong kỹ thuật q- PCR 40 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi 3.6 Xác ñịnh ñộ nhạy của kỹ thuật chẩn ñoán SBV trên ong mật 42 3.6.1 Khả năng chẩn ñoán của hai phương pháp one step RT – PCR và Realtime – PCR 42 3.6.2 Khả năng phát hiện SBV ở mức ñộ pha loãng mẫu gốc 46 3.6.3 Khảo sát khả năng phát hiện SBV theo thời gian biểu hiện bệnh tích trên ñàn ong. 50 3.7 Xây dựng quy trình kỹ thuật chẩn ñoán bệnh ấu trùng túi do virus Sacbrood bằng Realtime – PCR 52 3.7.1 Tách chiết RNA mẫu Ong 52 3.7.2 Tiến hành phản ứng One step Reverse Transcription – PCR (RT – PCR) 53 3.7.3 Tiến hành phản ứng Realtime – PCR 55 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 56 1 Kết luận 56 2 ðề nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 60 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CSBV Chinese Sacbrood Virus (Virus gây bệnh ấu trùng túi Trung Quốc) CP Concentration Point (ðiểm tập trung) Ct Cycle Threshold (Chu kỳ ngưỡng) DsRNA Double-stranded RNA (RNA mạch kép) DWV Deformed Wing Virus ( Virus xoăn cánh ong) ELISA Enzyme-Linked immunosorbent assay ( Phản ứng ELISA) EU European Union ( Liên minh Châu Âu) FAO Food and Agriculture Organization ( Tổ chức Nông lương) IFA Indirect Fluorescent Antibody ( Kháng thể huỳnh quang gián tiếp) KBV Kashmir Bee Virus ( Virus Kashmir) M Marker MRL Minimum Residue Limits (Dư lượng giới hạn tối thiểu) ORF Open Reading Frame ( Khung ñọc mở) OTC Oxytetracycline (Kháng sinh diệt khuẩn Oxytetracycline) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) qRT-PCR Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp ñịnh lượng theo thời gian thực) RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược) SBV Sacbrood Virus (Virus gây bệnh ấu trùng túi) SsRNA Single-stranded RNA (RNA mạch ñơn) Tm Temperature Melting ( Nhiệt ñộ nóng chảy) TSBV Thai Sacbrood Virus (Virus gây bệnh ấu trùng túi Thái Lan) UK United Kingdom ( Vương Quốc Anh) US United States ( Hợp chủng quốc Hoa Kì) VINAPI Vietnam National Apiculture Joint Stock Company ( Công ty Cổ phần Ong Trung ương) Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Kiểm tra RT-PCR phát hiện SBV trên các mẫu ấu trùng ong ñược bảo quản bằng các phương pháp khác nhau 30 3.2 Kết quả tách chiết RNA 32 3.3 Danh sách các cặp mồi sử dụng (Grabensteiner et al., 2001) 33 3.4 Kết quả RT-PCR cho SBV với các cặp mồi SB 1f-2r, SB 14f-15r và SB11f - SB12r với các mẫu ong mật thu tại 11 huyện trên ñịa bàn Hà Nội 36 3.5 Chất lượng RNA sau khi tách chiết bằng TRIzol-LS 37 3.6 ðỉnh nhiệt ñộ nóng chảy của 14 mẫu kiểm tra và ñối chứng 39 3.7 Ngưỡng chu kỳ sản phẩm RNA của SVB bắt ñầu nhân bản 39 3.8 Kết quả chẩn ñoán của hai phương pháp RT – PCRvà Realtime - PCR 43 3.9 Kết quả chẩn ñoán của Realtime - PCR 45 3.10 Kết quả Realtime – PCR của các mẫu pha loãng 46 3.11 Giá trị bước nhảy của ngưỡng chu kỳ khi pha loãng nông ñộ gốc 48 3.12 Kết quả Realtime – PCR của mẫu M50 pha loãng 48 3.13 Số lượng bản sao DNA/ µl và chu kỳ khuếch ñại (Yoo et al., 2012) 50 3.14 Giá trị ngưỡng chu kỳ của phản ứng Realtime- PCR ñối với các ấu trùng ở ñàn ong thí nghiệm 51 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Biểu ñồ khuếch ñại vẽ lên các ñường biểu diễn khuếch ñại của các mẫu thử và mẫu chuẩn 16 1.2 Biểu ñồ chuẩn ñường biểu diễn chuẩn mối quan hệ giữa số lượng bản DNA ñích và chu kỳ ngưỡng tương ứng 17 2.1 Bánh tổ ong nội có biểu hiện bệnh ATT 22 2.2 Bánh tổ ong ngoại có biểu hiện của bệnh ATT 22 2.3 ðuôi ấu trùng hình túi nước 22 2.4 Ấu trùng có biểu hiện nhọn ñầu 22 2.5 Mẫu ong 24 2.6 Mẫu ấu trùng ñược chuẩn bị ñể tách chiết RNA 24 2.7 Dụng cụ chuẩn bị cho tách chiết RNA 25 2.8 Tách chiết RNA 25 2.9 Vị trí cặp mồi SB1f – SB2r trên bộ gen của virus SBV (Grabensteiner et al., 2001) 26 3.1 RT-PCR phát hiện SBV bằng cặp mồi SB-1F/SB-2R từ các mẫu RNA chiết từ mẫu ấu trùng ong bệnh ñược bảo quản trong ethanol 70 % (nhiệt ñộ phòng) 30 3.2 RT-PCR phát hiện SBV bằng cặp mồi SB-1F/SB-2R từ các mẫu RNA chiết ngay lập tức từ mẫu ấu trùng ong bệnh sau khi thu thập từ ñàn bệnh 31 3.3 RT-PCR phát hiện SBV bằng cặp mồi SB-1F/SB-2R từ các mẫu RNA chiết từ mẫu ấu trùng ong thu thập từ ñàn bệnh và bảo quản lạnh 31 3.4 Kết quả kiểm tra tính ñặc hiệu của 5 cặp mồi với mẫu RNA tách từ ấu trùng biểu hiện dương tính. 34 [...]... ñoán phân t (RT -PCR và Realtime PCR) - C p m i dùng cho ch n ñoán 2.3 N i dung nghiên c u - Nghiên c u ñ ñ c hi u c a c p m i: Nghiên c u ñ ñ c hi u c a các c p m i b ng k thu t RT- PCR Nghiên c u kh năng phát hi n SBV b ng k thu t Realtime- PCR ( q -PCR) Nghiên c u ñ ñ c hi u c a c p m i trong k thu t Realtime- PCR - Xác ñ nh ñ nh y c a k thu t ch n ñoán SBV trên ong m t: So sánh kh năng phát hi n c a... queen cell virus (BQCV- làm u trùng chúa ñen và ch t) Deformed Wing Virus (DWV) làm bi n d ng cánh ong, và Sacbrood virus (SBV) gây th i u trùng túi thu c h iflaviridae, và là picornavirus 1.2 Tình hình nghiên c u v Sacbrood virus 1.2.1 L ch s phát hi n và tác h i c a b nh virus u trùng túi Sacbrood virus ñư c ghi nh n l n ñ u tiên năm 1913, và ñư c xác ñ nh là do virus gây ra năm 1917 trên ong Apis... nuôi ong và gây thi t h i r t l n cho ngư i nuôi ong và ngành nuôi ong Sacbrood virus (SBV) gây b nh ch t u trùng ong và là 1 virus quan tr ng b c nh t trên ong kh p th gi i k c Vi t Nam SBV nhi m c ong Apis mellifera và Apis cerana (Phùng H u Chính 2008, Thái et al., 2011) sacbrood virus gây ra, b nh làm ch t u trùng ch y u u trùng túi do giai ño n sau vít n p và ti n nh ng Kh năng lây nhi m c a virus. .. nhau Báo cáo năm 2004 v “S lây nhi m ña virus trên ong m t và s d bi n h gen c a các virus trên ong m t” là báo cáo ñ u tiên v s nhi m h n h p 4 lo i virus trên ong m t và cũng là báo cáo ñ u tiên v vi c s d ng phương pháp multiplex RT – PCR trong vi c ch n ñoán s lây nhi m ña virus trong các dòng ong m t Vào năm 1971, m i ch tìm ra ba lo i virus lây nhi m trên ong m t (Bailey, 1971) nhưng 5 năm sau... c phát tri n thêm nh ng phương pháp ch n ñoán hi n ñ i, chính xác ñ phát hi n s m nh ng virus ti m tàng nh ng giai ño n ñ u là h t s c c n thi t giúp nh ng ngư i nuôi ong h n ch ñư c s th t thoát v kinh t cũng như tình tr ng dư th a kháng sinh trong m t Chính vì lý do ñó mà chúng tôi quy t ñ nh nghiên c u ñ tài: Nghiên c u kh năng s d ng k thu t Realtime- PCR phát hi n Sacbrood virus gây b nh trên ong. .. hay ch t l ng trong u trùng ch t có ch a 1mg virus ñ ñ gây nhi m cho toàn b u trùng ong th c a 1000 ñàn kh e Nhưng s c ch ng ch u c a virus không cao, nó m t kh năng gây b nh khi ñun 59o C trong 10 phút nhi t ñ phòng virus có th t n t i 3 tu n các u trùng ch t ñã khô không còn kh năng gây b nh Theo Ball thì trong cơ th ong trư ng thành, virus nhân lên và tích lũy ch y u ph n ñ u c a ong b nhi m nhi... bào này có th t n t i trong ñ t, bánh t kho ng 10 năm, khi g p ñi u ki n thu n l i có th ho t ñ ng tr l i t t c các th i ñi m trong năm B nh virus trên ong ñư c quan tâm nghiên c u nhi u trong vài th p k g n ñây b i s xu t hi n ngày càng nhi u các lo i virus và m c ñ gây h i c a chúng H u h t các b nh virus trên ong không có tri u ch ng rõ ràng 18 loài virus trên ong m t ñã ñư c phát hi n và m t s ñã... Nông nghi p Hà N i - Vi n Công ngh Sinh h c - Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam - Trung tâm nghiên c u và nuôi Ong nhi t ñ i - Trư ng ðH Nông nghi p Hà N i 2.2 ð i tư ng và v t li u nghiên c u 2.2.1 ð i tư ng - Virus u trùng túi ( Sacbrood virus ) - Ong m t Apis cerana và Apis mellifera 2.2.2 V t li u nghiên c u - M u ong có s n trong phòng thí nghi m và ñư c thu th p trên ñ a bàn Hà N i - Các... nuôi ong mà còn cung c p nhi u nh ng ích l i trong xã h i cũng như v i môi trư ng Tuy nhiên ong m t r t hay b t n công b i m t s lo i b nh do vi khu n và nguy hi m hơn c là b nh do virus, b i vì b nh do virus không th ñi u tr b ng thu c kháng sinh ñư c Trong các b nh virus trên ong thì b nh u trùng túi là m t trong nh ng b nh virus nghiêm tr ng nh t trên ong m t hi n nay Virus này ñ u thu c chi iflavirus,... doanh ñàn ong và các thi t b dùng trong ngh nuôi ong Ngày nay, do s tăng trư ng phát tri n v kinh t mà các ñàn ong có th ñư c v n chuy n ñ n nh ng nơi r t xa th m chí là t châu l c này ñ n châu l c khác, do ñó mà b nh càng có cơ h i lây lan r ng hơn (FAO, 2006) Virus gây b nh trên ong m t (Apis mellifera) ñư c nghiên c u m nh m trong su t giai ño n cu i th p k Nhìn chung thì virus trên ong m t thư . sinh trong mật. Chính vì lý do ñó mà chúng tôi quyết ñịnh nghiên cứu ñề tài: Nghiên cứu khả năng sử dụng kỹ thuật Realtime-PCR phát hiện Sacbrood virus gây bệnh trên ong mật tại Hà Nội làm. TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR PHÁT HIỆN SACBROOD VIRUS GÂY BỆNH TRÊN ONG MẬT TẠI HÀ NỘI LUẬN. HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR PHÁT HIỆN SACBROOD VIRUS GÂY BỆNH TRÊN