BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI          NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA NẾP THƠM KHÁNG BỆNH BẠC LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DAN CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS. PHAN HỮU TÔN HÀ NỘI - 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác. Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Huyền Trang Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn, ngoài sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của rất nhiều cá nhân và tập thể. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, sự cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy PGS.TS. Phan Hữu Tôn, trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học Ứng dụng ñã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện ñề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Văn Hùng cùng toàn bộ các cán bộ ñang công tác tại bộ môn Công nghệ sinh học Ứng dụng - ðại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài. Qua ñây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị và bạn bè ñã giúp ñỡ, ñộng viên em trong suốt quá trình học tập cũng như thực tập tốt nghiệp. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia ñình mình ñã luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Huyền Trang Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT 1 PHẦN I: MỞ ðẦU 2 1.1. ðặt vấn ñề 2 1.2. Mục ñích và yêu cầu 3 1.2.1. Mục ñích 3 1.2.2. Yêu cầu 3 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Tổng quan về bệnh bạc lá lúa 4 2.1.1. Nguyên nhân, triệu chứng và tác hại của bệnh 4 2.1.2. Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng ñến phát sinh, phát triển bệnh 5 2.1.3. Biện pháp phòng chống 7 2.2. Chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá 8 2.2.1. Cơ chế kháng bệnh 8 2.2.2. Nghiên cứu về di truyền tính kháng bệnh 11 2.2.3. Các phương pháp chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá 14 2.2.4. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng bệnh bạc lá 15 2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử vào chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá 17 2.3.1. Giới thiệu về chỉ thị phân tử DNA 17 2.3.2. Một số nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử vào chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá lúa 20 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 2.3.3. Chỉ thị phân tử liên quan một số gen kháng bệnh bạc lá lúa 21 2.4. Các phương pháp chuyển gen kháng bệnh bạc lá vào giống 24 2.4.1. Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen 24 2.4.2. Phương pháp lai hữu tính kết hợp với việc sử dụng chỉ thị phân tử 24 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1. Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 26 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu 26 3.1.2. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 26 3.2. Phương pháp nghiên cứu 26 3.2.1 Thí nghiệm ñồng ruộng 26 3.2.2. Thí nghiệm trong phòng 29 3.3. Phương pháp xử lý số liệu 32 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1. Lai Backcross chuyển gen kháng X4,Xa7 vào giống tốt. 33 4.1.1. Kết quả chọn lọc cá thể từ quần thể 12BC1F1 ((NV4 x 10915) x NV4) 39 4.1.2. Tổ hợp 21BC1F1 41 4.1.3. Tổ hợp 154BC1F1 43 4.1.4. Tổ hợp 63BC1F1 46 4.2. Chọn lọc các cá thể tốt ở quần thể phân ly F2, sử dụng chỉ thị phân tử ADN chọn lọc dạng ñồng hợp tử trội. 49 4.2.1. Kết quả chọn lọc các cá thể từ quần thể 62F2 52 4.2.2. Tổ hợp 31F2 55 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 57 5.1. Kết luận 57 5.2. ðề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Bản ñồ liên kết di truyền giữa gen quy ñịnh tính trạng nông sinh học quan trọng với RFLP ñánh dấu 21 Bảng 3.1. Các quần thể phân ly sử dụng trong nghiên cứu 26 Bảng 3.2. Thành phần dung dịch chiết tách 30 Bảng 3.3. Thành phần dung dịch TE 30 Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR cho một gen Xa4, Xa7 31 Bảng 3.5. Các Primer dùng trong PCR 31 Bảng 3.6. Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7 31 Bảng 4.1. ðặc ñiểm nông sinh học của các dòng chọn lọc từ các tổ hợp 34 Bảng 4.1.1a. ðặc ñiểm một số cá thể dị hợp tử của tổ hợp 12BC1F1 40 Bảng 4.1.1b. ðặc ñiểm của mẫu cá thể chất lượng tốt ñược chọn 40 Bảng 4.1.2a. ðặc ñiểm một số cá thể dị hợp tử của tổ hợp 21BC1F1 42 Bảng 4.1.2b. ðặc ñiểm của mẫu cá thể chất lượng tốt ñược chọn 42 Bảng 4.1.3a ðặc ñiểm một số cá thể dị hợp tử của tổ hợp 154BC1F1 45 Bảng 4.1.3b ðặc ñiểm của mẫu cá thể chất lượng tốt ñược chọn 45 Bảng 4.1.4a . ðặc ñiểm một số của cá thể dị hợp tử của tổ hợp 63BC1F1 48 Bảng 4.1.4b. ðặc ñiểm của mẫu cá thể chất lượng tốt ñược chọn 48 Bảng 4.2. ðặc ñiểm nông sinh học của các dòng chọn lọc từ các tổ hợp phân ly F2 50 Bảng 4.2.1a. ðặc ñiểm một số cá thể dồng tử trội của tổ hợp 62F2 54 Bảng 4.2.1b. ðặc ñiểm của mẫu cá thể chất lượng tốt ñược chọn 54 Bảng 4.2.2a. ðặc ñiểm một số cá thể ñồng tử trội của tổ hợp 31F2 56 Bảng 4.2.2b. ðặc ñiểm của mẫu cá thể chất lượng tốt ñược chọn 56 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC HÌNH Hình 1: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 các cá thể trong quần thể 12BC1F1 39 Hình 2: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 21BC1F1 ((Khẩu Lếch x 10132 – 2) x Khẩu Lếch) 41 Hình 3: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 154BC1F1 ((11000 x 10900) x 11000) 43 Hình 4: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 154BC1F1 ((11000 x 10900) x 11000) 44 Hình 5: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 63BC1F1 ((10883 x 10222) x 10883) 46 Hình 6: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 63BC1F1 ((10883 x 10222) x 10883) 47 Hình 7: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 62F2 (10165 x 10140 – 2) 53 Hình 8: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 31F2 (10165 x 10140 – 2) 55 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên ñầy ñủ AFLP Amplified fragment length polymorphism ALP Amplicon length polymorphism AP - PCR Arbitrary primer-PCR BVTV Bảo vệ thực vât CNSH Công nghệ sinh học DAF DNA amplification fingerprinting DHT Dị hợp tử ðHT ðồng hợp tử ðC ðối chứng MRDHV- DNA Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA(minisatellite) NS Năng suất NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random amplified polymorphic DNA RFLP Restriction fragment length polymorphism SSCP Single strand conformation polymorphism SSR Simple sequence repeat (microsatellite) TGST Thời gian sinh trưởng TL Tỷ lệ Xoo Xanthomonas oryzae. pv. oryzae Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 1 TÓM TẮT Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA nhằm chọn lọc những cá thể tốt trong các quần thể phân ly chứa các gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, Xa7 làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống kháng bệnh có năng suất cao, phẩm chất tốt là một việc làm vô cùng có ý nghĩa. Thí nghiệm ñược thực hiện trên 6 quần thể phân ly 12BC1F1 ((NV4 x 10915) x NV4), 21BC1F1 ((Khẩu Lếch x 10132 – 2) x Khẩu Lếch), 31F2 (10969 x 10900), 62F2 (10165 x 10140 – 2), 63BC1F1 ((10883 x 10222) x 10883), 154BC1F1 ((11000 x 10900) x 11000). Sau khi có kết quả theo dõi một số ñặc ñiểm nông sinh học, năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất và áp dụng phương pháp chọn lọc tăng tiến trên 6 quần thể phân ly ñã chọn ñược 98 cây có năng suất cao, phẩm chất tốt. Tiến hành chạy PCR các cá thể tốt ñã chọn ñược 59 cây mang gen kháng ðHT trong ñó 38 cây mang gen kháng Xa7 , 21 cây mang 2 gen kháng xa4/xa7. Các cá thể mang gen kháng ðHT là nguồn vật liệu quý giá trong công tác chọn tạo giống kháng có năng suất cao, chất lượng tốt. Các cá thể còn chứa gen DHT cần ñược tiếp tục chọn tạo trong các thế hệ phân ly. Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 2 PHẦN I: MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra là bệnh phổ biến và tàn phá lúa nghiêm trọng trên toàn thế giới (Khan, 1996), bệnh ñặc biệt nặng ở những nơi có mức ñộ thâm canh cao. Ở miền Bắc nước ta, bệnh gây hại ở tất cả các vụ trong năm, nặng nhất vào vụ mùa, ñặc biệt trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Cho ñến nay, chưa có loại thuốc hóa học nào ñặc trị bệnh bạc lá, việc tạo ra các giống lúa có khả năng kháng bệnh bền vững ñược xem là hiệu quả nhất, cả về mặt kinh tế và môi trường. Mỗi vùng trồng lúa lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá ñặc trưng, phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và ñiều kiện tự nhiên của vùng: Philipin 6 chủng, Nhật Bản 12 chủng, Ấn ðộ 9 chủng,… (Tika và cộng sự, 1999). Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu trước ñó ñã xác ñịnh ñược 14 chủng vi khuẩn bạc lá lúa có mặt ở miền Bắc (trích dẫn theo Pham Van Du và Le Cam Loan, 2007). ðã có trên 30 gen kháng bệnh bạc lá ñược phát hiện ở lúa trồng và lúa dại (Ninox-Lui và cộng sự, 2006; Singh và cộng sự, 2007; Siriporn Korinsak, 2009). Trong ñó có nhiều gen ñã ñược ñịnh vị trên genome cây lúa như: gen Xa2 liên kết với marker Npb197 ñịnh vị trên NST số 4 (Yoshimura và cộng sự, 1995); Gen Xa4 liên kết với chỉ thị Npb181 và Npb76 trên NST số 11, với khoảng cách di truyền là 1.7cM (Yoshimura và cộng sự, 1992); Gen Xa7 liên kết với chỉ thị P3 trên NST số 6, với khoảng cách di truyền 2.5cM ( Taura và cộng sự, 2003); Mỗi gen kháng chỉ kháng ñược một hay một số chủng vi khuẩn nhất ñịnh, trong khi ñó mỗi vùng trồng lúa lại tồn tại nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, vì vậy nếu giống chỉ chứa một gen kháng thì sau một thời gian ngắn sẽ bị nhiễm bệnh. Vấn ñề ñặt ra ở ñây là cần phải quy tụ nhiều gen kháng vào một giống ñể giống ñó có khả năng kháng ñược nhiều chủng vi khuẩn khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu của Phan Hữu Tôn và cộng sự (2005) thì các gen Xa4, Xa7 kháng ñược hầu hết các chủng vi khuẩn ở miền Bắc Việt Nam. [...]... các gi ng lúa m i kháng b nh ñ phòng tr b nh b c lá trong th i kì hi n nay Như v y, s ra ñ i c a các gi ng lúa kháng b nh kéo theo s ti n hoá c a các ch ng vi khu n gây b nh, làm gi m tính b n v ng c a gen kháng Do ñó, chi n lư c nh m kéo dài th i gian kháng b n v ng c a gen kháng là vô cùng quan tr ng trong vi c ch n gi ng kháng b nh b c lá 2.2.3 Các phương pháp ch n gi ng lúa kháng b nh b c lá Phương... ta g i tính kháng không hoàn toàn là tính kháng s lư ng (quatitativeloci resistance – QR) 2.2.2 Nghiên c u v di truy n tính kháng b nh Nh ng nghiên c u có tính ch t h th ng v gen kháng b nh b c lá ñư c th c hi n t i Nh t B n vào ñ u th p k 60 Năm 1961, nh ng nghiên c u ñ u tiên v di truy n kh năng kháng b nh b c lá ñã ñư c Nishimura ti n hành Trong khi nghiên c u v s luân chuy n các gi ng lúa tr ng phát... v i nòi ñó Vi n nghiên c u lúa qu c t (IRRI) ñã t o ra các dòng ñ ng gen ch a các gen kháng b nh b c lá khác nhau trên th gi i b ng phương pháp lai gi a gi ng IR24 và gi ng ch a gen kháng b nh b c lá khác nhau T ñó t o ra các dòng, có n n gen chung c a IR24, ch khác nhau m t gen kháng b nh b c lá Do ñó, có th phân bi t ñư c nòi sinh lý d a vào ph kháng nhi m ñ c trưng c a t ng gen kháng ðây là phương... n ph i ti n hành ch n l c b ng ch th phân t nh m ch n ra nh ng cá th t t có ch a gen kháng b nh b c lá làm v t li u cho quá trình t o gi ng kháng có năng su t cao, ph m ch t t t Chính vì v y chúng tôi ti n hành ñ tài: Nghiên c u ch n t o gi ng lúa n p thơm kháng b nh b c lá b ng ch th phân t DNA ” 1.2 M c ñích và yêu c u 1.2.1 M c ñích Ch n l c các cá th gi ng lúa n p có các ñ c tính nông sinh h c... kh năng cho các nhà ch n gi ng phân bi t ñư c s sai khác r t nh gi a hai cá th sinh v t có h hàng g n nhau, th m chí khác nhau ch do ñ t bi n nh ho c cây tái t h p, phân bi t ñư c các alen các ch ng sinh lý gây b nh… 2.3.2 M t s nghiên c u ng d ng ch th phân t vào ch n t o gi ng kháng b nh b c lá lúa Cho ñ n nay ñã tìm ra trên 30 gen kháng b nh b c lá t lúa tr ng và lúa d i trong ñó có 12 gen l n là:... gi ng kháng Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 20 2.3.3 Ch th phân t liên quan m t s gen kháng b nh b c lá lúa Hi n nay v i s phát tri n c a công ngh sinh h c, ngư i ta ñã xác ñ nh ñư c các ch th phân t liên quan ñ n nhi u tính tr ng quan tr ng cây lúa mà ñ c bi t là các ch th liên quan ñ n tính kháng b nh ð i v i b nh b c lá, xác ñ nh 7 gen kháng b nh b c lá và... 2.2 Ch n t o gi ng lúa kháng b nh b c lá 2.2.1 Cơ ch kháng b nh 2.2.1.1 Cơ ch sinh hóa và sinh thái Kiryu và Mizuta (1955), phân tích các ñ c trưng hình thái c a gi ng kháng, gi ng trung gian và gi ng nhi m nh n th y các gi ng có b n lá h p, ng n, ñ ng lá thư ng có ph n ng kháng Môi trư ng dinh dư ng bên trong c a cây kí ch cũng là m t y u t r t quan tr ng trong vi c xác ñ nh tính kháng và nhi m Khi... vi c ch n t o gi ng lúa kháng b nh, b i chúng có kh năng kháng ñư c h u h t các ch ng vi khu n ph bi n nư c ta Nhưng trong s các gen kháng h u hi u, t i mi n B c thì gen Xa7 có kh năng xu t hi n nhi u hơn xa5 Hi n chưa có nghiên c u nào công b vi c phát hi n ñư c gen Xa21 trên các gi ng lúa tr ng Vi c s d ng k thu t PCR xác ñ nh gen kháng và vi khu n b c lá trong ch n t o gi ng lúa kháng b nh cho k t... v tính kháng c a lúa ñ i v i vi khu n b c lá ít nhi u thay ñ i theo tính kháng ngang và tính kháng d c Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 9 Khái ni m tính kháng ngang, kháng d c ñư c J.E Vander Plank ñ nh nghĩa ñ u tiên vào năm 1963 Tính kháng d c thư ng do m t ho c m t vài gen qui ñ nh nên còn ñư c g i là tính kháng ñơn gen Ch c n m t ho c m t vài gen kháng là... 2 hay nhi u gen kháng vào m t gi ng chính là chi n lư c ñ tăng ph kháng cho gi ng cũng như tăng ñ b n cho gen kháng Theo Phan H u Tôn và Bùi Tr ng Thu (2003), thì vi c có thêm gen kháng không h u hi u khác t h p v i m t trong s các gen kháng h u hi u ñ u không làm tăng tính kháng c a các dòng Như v y, vi c t h p 2 gen kháng và kháng h u hi u, kháng và nhi m không làm thay ñ i kh năng kháng ho c nhi . trong nghiên cứu và chọn giống kháng bệnh bạc lá 15 2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử vào chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá 17 2.3.1. Giới thiệu về chỉ thị phân tử DNA 17 2.3.2. Một số nghiên. tiến hành ñề tài: Nghiên cứu chọn tạo giống lúa nếp thơm kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử DNA ”. 1.2. Mục ñích và yêu cầu 1.2.1. Mục ñích Chọn lọc các cá thể giống lúa nếp có các ñặc tính. ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI          NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA NẾP THƠM KHÁNG BỆNH BẠC LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DAN