BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ PHƯƠNG ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STEINERNEMA SPP. Ở MỘT SỐ TỈNH BẮC TRUNG BỘ LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ PHƯƠNG ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STEINERNEMA SPP. Ở MỘT SỐ TỈNH BẮC TRUNG BỘ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHAN KẾ LONG Hà Nội - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phan Kế Long, nghiên cứu viên Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, người đã tận tình chỉ bảo, hướng cho tôi những phương pháp luận hết sức căn bản nhưng vô cùng giá trị để tôi có những định hướng cho luận văn của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn Giám đốc Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia đã tạo mọi điều kiện về công việc, thời gian để cho tôi được tập trung vào khóa học và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn tới các anh, chị, em trong phòng Tuyến trùng học – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp tôi rất nhiều trong quá trình làm luận văn. Tôi cũng xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, phòng Đào tạo và các thầy cô tại Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nguyên cứu. Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến: bố, mẹ, anh và con gái Hà Chi bé bỏng đã luôn ở bên động viên, khuyến khích để tôi hoàn thành luận văn này./. Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quí báu đó! Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2010 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Phương Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 1. Hoàng Thị Bích * , Nguyễn Thị Phương, Phạm Ngọc Tuyên, Lê Thị Mai Linh, Phan Kế Long (2010) , “Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của các chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema sp. TĐ3 phân lập từ Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Tạp chí Dược Học (giấy nhận đăng). Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 . Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Entomopathogenic nematode - EPN. 3 1.1.1 Sơ lược về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng. 3 1.1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema. 5 1.1.3. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis 5 1.2. Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN 6 1.2.1 Giống Xenorhabdus 6 1.2.2. Giống Photorhabdus 7 1.2.3. Sự đa dạng của giống Xenorhabdus và Photorhabdus. 7 1.3. Mối quan hệ giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh 9 1.3.1. Vai trò của tuyến trùng với vi khuẩn 9 1.3.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp nematode-bacterium 10 1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước. 11 1.4.1. Những nghiên cứu trên thế giới. 11 1.4.2. Những nghiên cứu tại Việt Nam 14 1.4.3. Ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại trong việc nghiên cứu về vi khuẩn. 17 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu. 19 2.1.1. Tuyến trùng 19 2.1.2. Ấu trùng Bướm sáp lớn 20 2.2. Hóa chất và thiết bị 20 2.2.1. Hóa chất 20 2.2.2. Môi trường phân lập vi khuẩn cộng sinh 21 2.2.3. Trang thiết bị 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phương pháp xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL 22 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.2 Phương pháp phân lập VKCS 23 2.3.3. Phương pháp quan sát hình thái tế bào vi khuẩn cộng sinh 23 2.3.4. Phương pháp định loại VKCS dựa trên trình tự 16S rDNA 23 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1. Gây nhiễm ấu trùng BSL 30 3.2. Phân lập vi khuẩn cộng sinh 30 3.3. Quan sát hình ảnh tế bào các chủng vi khuẩn cộng sinh 32 3.4 . Đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema spp. từ các tỉnh Bắc Trung Bộ 34 3.4.1 Kết quả khuếch đại gen 16S rDNA 34 3.4.2. Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của 03 chủng VKCS 35 3.5. Phân tích sự đa dạng về di truyền của các chủng vi khuẩn cộng sinh với giống Steinernema 44 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1. Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 59 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU,CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSL Bướm sáp lớn Galleria mellonella BTB Bromothymol Blue DMSO Dimethyl sulfoxide EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid EPN Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematode) EtBr Ethidium bromide h giờ IJ Ấu trùng xâm nhiễm (Infective juvenile) NBTA Môi trường phân lập vi khuẩn (Nutrient agar supplemented with bromothymol blue and triphenyl tetrazolium chloride) PCR Phản ứng khuyếch đại đoạn DNA (Polymerase Chain Reaction) TBE Dung dịch đệm điện di (Tris/Borate/EDTA) TTC Triphenyltetrazolium chloride VKCS Vi khuẩn cộng sinh VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vòng đời của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 8 Hình 2.1: Hình ảnh tuyến trùng Steinernema spp. (IJs) 19 Hình 2.2. Ấu trùng bướm sáp lớn Galleria mellonella 20 Hình 3.1. Ảnh ấu trùng BSL chết do nhiễm tuyến trùng Steinernema spp. 30 Hình 3.2. Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn 30TX1 31 Hình 3.3 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn 45XT 31 Hình 3.4. Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn TK10 32 Hình 3.5. Ảnh tế bào chủng vi khuẩn 30TX1 33 Hình 3.6. Ảnh tế bào chủng vi khuẩn 45XT 33 Hình 3.7. Ảnh tế bào chủng vi khuẩn TK10 34 Hình 3.8: Sản phẩm PCR của gen 16S rDNA của các chủng VKCS. 35 Hình 3.9: So sánh trình tự nucleotide ở các loài trong giống Xenorhabdus 42 Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại Maximum Parsimony, số ở các gốc là giá trị % bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu. 46 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh tương ứng 8 Bảng 2.1: Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR 25 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 25 Bảng 2.3: Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự DNA 27 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng xác định trình tự DNA 28 Bảng 3.1: Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen 16S-rDNA của vi khuẩn 30TX1 36 Bảng 3.2: Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen 16sDNA của vi khuẩn TK10 . 37 Bảng 3.3: Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen 16S-rDNA của vi khuẩn 45XT với ngân hàng dữ liệu trình tự quốc tế ( Genbank) bằng chương trình BLAST ta có kết quả thể hiện ở bảng sau: 38 Bảng 3.4. Kết quả thành phần nucleotide trình tự một phần gen 16S rDNA các chủng vi khuẩn nghiên cứu 44 Bảng 3.5: Ma trận khoảng cách di truyền giữa các trình tự nghiên cứu theo mô hình Jukes-Cantor với phân phối đồng đều 44 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU Hiện nay, Các quốc gia đang có xu hướng sử dụng các sản phẩm sinh học thay thế cho các chất hóa học để phòng trừ sâu hại. Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic Nematodes – EPN) có khả năng gây bệnh trên côn trùng là nhờ có sự cộng sinh chặt chẽ và đặc hiệu với các vi khuẩn cộng sinh (Xenorhabdus ở Steinernema và Photorhabdus ở Heterorhabditis). Sau khi thâm nhập vào vật chủ, các vi khuẩn này sản sinh rất nhanh và tạo ra độc tố giết chết vật chủ, thêm vào đó các vi khuẩn này cũng tiết ra một số chất chống lại các tác nhân cạnh tranh khác trong môi trường như vi khuẩn, nấm (Akhurst and Dunphy, 1993). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, các hoạt chất sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng/loài vi khuẩn này có khả năng kháng sinh, kháng nấm, ngăn chặn sự tăng sinh của tế bào ung thư chính vì vậy các chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus /Photorhabdus là nguồn hợp chất tự nhiên quan trọng để nghiên cứu các loại thuốc mới cho con người (Chen et al., 1994). Do mỗi chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus /Photorhabdus tạo ra các hoạt chất khác nhau chính vì vậy việc tìm ra các chủng/loài mới của loại vi khuẩn này là rất cần thiết. Ở Việt Nam, cho đến nay đã phân lập được hơn 60 chủng EPN từ các vùng sinh thái khác nhau. Đây là cơ sở để chúng ta dự đoán về sự đa dạng của VKCS với tuyến trùng. Mặc dù, đã có nhiều nghiên cứu về tuyến trùng rất có giá trị và có ý nghĩa khoa học trong xác định hình thái, đa dạng loài nhưng vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về VKCS với tuyến trùng, việc phân loại, định tên và tìm hiểu mối quan hệ giữa vi khuẩn với tuyến trùng hiện là vấn đề rất cần được nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... n trùng ký sinh gây b nh côn trùng Tuy n trùng ký sinh gây b nh côn trùng (Entomopathogenic nematode EPN) gi ng Steinernema thu c h Steinernematidae và Heterorhabditis thu c h Heterorhabditidae trong ngành giun tròn là nh ng loài giun tròn có ích, ký sinh nh ng loài côn trùng có h i, làm suy y u ho c gi t ch t nh ng côn trùng v t ch này, nhưng l i r t an toàn i v i ngư i, ng v t và th c v t Cơ ch gây. .. ký sinh gây b nh côn trùng Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 1.1.2 Tuy n trùng ký sinh gây b nh côn trùng Steinernema Tuy n trùng Steinernema sinh s n theo ki u phân tính nh giao ph i gi a o n c và cái, tr ng con cái ư c th tinh b i tinh trùng c a con u, con cái c giai tr ng vào cơ th côn trùng và tr ng n thành u trùng th h 1 Các u trùng c a th h 1 không... ng thành T th h th hai tuy n trùng chuy n sang dinh dư ng b ng mô côn trùng ã ư c vi khu n ho t hóa (Nguy n Ng c Châu, 2008) - VKCS ho t hóa xác ch t côn trùng: Nh các enzyme do vi khu n sinh ra, các mô cơ th côn trùng v t ch ư c ho t hóa thành ngu n th c ăn thích h p i v i tuy n trùng Nh ó, t th h 2 tuy n trùng s d ng chính xác ch t côn trùng ã ư c ho t hóa như Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học... t côn trùng và phát tán ra môi trư ng bên ngoài và tr thành IJs (tu i 3) và t ây chúng ti p t c m t chu kỳ phát tri n m i v i côn trùng v t ch m i 1.1.3 Tuy n trùng ký sinh gây b nh côn trùng Heterorhabditis Không gi ng v i các loài Steineinema, các loài tuy n trùng Heterorhabditis, IJs khi xâm nh p vào cơ th côn trùng phát tri n thành con cái lư ng tính (hermaphroditis) Con cái này có kh năng s n sinh. .. sinh v i tuy n trùng ký sinh gây b nh côn trùng Steinernema và Heterorhabditis ph c v trong y dư c Vi t Nam, d án t p trung phân l p, phân lo i tuy n trùng cùng v i VKCS và tách chi t các ho t ch t sinh h c Phan K Long và c ng Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 17 s (2009) ã phân l p ư c h p ch t Diketopiperazin t s n ph m trao ch t th c p c a vi khu n Xenorhabdus... n, sinh sôi n y n các th h ti p theo Thông thư ng trong cơ th côn trùng v t ch , tuy n trùng có th phát tri n 2 n 4 th h , ph thu c vào sinh kh i côn trùng v t ch làm ngu n th c ăn cho chúng - VKCS ngăn c n các vi khu n khác xâm nh p vào xác ch t côn trùng: VKCS có kh năng sinh ra các ho t ch t kháng sinh ngăn c n tác nhân sinh h c khác như n m ho c vi khu n xâm nh p và phát tri n trên xác ch t côn trùng. .. (Heterorhabditis spp. ) ho c h u môn (Steinernema spp. ) vào xoang máu c a côn trùng Nh môi trư ng thích h p là huy t tương v t ch VKCS nhân nhanh s lư ng và t o ra c t gây ch t v t ch trong vòng 24-48h Màu s c c a côn trùng v t ch cũng Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 là i m c trưng khác bi t gi a 2 gi ng tuy n trùng: Heterorhabditis thì khi côn trùng v t... nghi m Tuy n trùng h c - Vi n Sinh thái và Tài nguyên sinh v t Hình 2.2 u trùng bư m sáp l n Galleria mellonella Bư m sáp l n Galleria mellonella (BSL) là loài côn trùng thu c b cánh v y Lepidoptera, ư c s d ng làm v t li u chính trong các nghiên c u v tuy n trùng ký sinh gây b nh côn trùng (EPN) u trùng tu i trư c nh ng c a bư m sáp l n ư c s d ng như là v t ch trong các nghiên c u v sinh h c các... nguyên sinh v t - Ký hi u m u: Tên vi khu n Ký hi u VK 1 Steinernema sangi 30TX1 Thư ng Xuân, Thanh Hóa 2 Steinernema loci TK10 Th ch Khê, Th ch Hà, Hà Tĩnh 3 Steinernema sp 45XT Xuân Trư ng, Th Xuân, Thanh Hóa TT a i m thu m u Hình 2.1: Hình nh tuy n trùng Steinernema spp (IJs) Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 20 2.1.2 u trùng Bư m sáp l n u trùng Bư m sáp... VKCS v i tuy n trùng H indica v i vi khu n Ochrrobactrum spp Các VKCS t nhiên P luminescens subsp akhurstii ư c phân l p t tuy n trùng ký sinh gây b nh côn trùng H indica và 14 ch ng vi khu n phân l p t tuy n trùng ư c thu t 3 o khác nhau vùng Caribbean, ư c mô t b ng nh ng ki m tra ki u hình thư ng phân tích trình t và a hình chi u dài các o n c t gi i h n c a PCR gen 16S-rDNA Các vi khu n phân l . trùng. 3 1.1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema. 5 1.1.3. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis 5 1.2. Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN 6 1.2.1 Giống. vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema spp. ở một số tỉnh Bắc Trung Bộ với mục tiêu cụ thể như sau: 1/ Phân lập VKCS với một số chủng tuyến trùng giống Steinernema thu được ở các tỉnh. LIỆU 1.2 . Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Entomopathogenic nematode – EPN. 1.1.1 Sơ lược về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic