1 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  HỨA THỊ SƠN Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 2 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 60 42 40 Học viên: Hứa Thị Sơn Hƣớng dẫn khoa học: TS. Lê Nhƣ Kiểu Hà Nội – 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM 3 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin cảm ơn phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập. Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Lê Như Kiểu, Phó viện trưởng Viện Thổ nhưỡng Nông hóa–Viện Khoa học Nông nghiệp Việt nam, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và định hướng cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ này. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể bộ môn Vi sinh vật-Viện Thổ nhưỡng Nông hóa và tập thể bộ môn Sinh học Môi trường Nông nghiệp-Viện Môi trường Nông nghiệp đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm trong công việc để tôi có thể hoàn thành luận văn đúng thời gian qui định. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn. Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó./. Hà nội, ngày 2 tháng 12 năm 2010. Học viên Hứa Thị Sơn 4 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A, T, G, C Adenine, Thyamine, Guanine, Cytosine ADN Acid deoxyribonucleic ALIV African lampeye iridovirus BIV bream iridovirus bp base pair DGIV Dwarf gourami iridovirus EBI European Bioinformatics Institute EDTA Ethylenediamin Disodium Tetra Acetate EHNV Epizootic haematopoietic necrosis virus GIV Grouper iridovirus GSDIV Grouper sleepy disease iridovirus ISKNV Infectious spleen and kidney necrosis virus kb kilo base LCDV Lymphocystis disease virus MCP Major capsid protein NCBI National Center for Biotechnology Information OIE World Organisation for Animal Health OSGIV orange spotted grouper iridovirus PCR Polymerase Chain Reaction RBIV Rock bream iridovirus RSIVD red sea bream iridoviral disease SBIV Red sea bream iridovirus SN-PCR Semi-nested - Polymerase chain reaction TAE Tris - Acetic – EDTA TE Tris - EDTA 10 mM TGIV Taiwan Grouper Iridovirus 5 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. Tình hình trồng trọt trên thế giới và Việt Nam 2 1.1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới 2 1.1.2. Tình hình sản xuất lạc trong nước 3 1.2. Tình hình bệnh hại lạc trên thế giới và Việt Nam 7 1.2.1. Tình hình bệnh hại lạc trên thế giới 7 1.2.2. Tình hình bệnh hại lạc ở Việt Nam 14 1.3. Khái niệm về kiểm soát sinh học 16 1.4. Tại sao kiểm soát sinh học lại phổ biến 17 1.5. Những vấn đề trong kiểm soát sinh học 18 1.6. Cơ chế đối kháng 19 1.6.1.Cơ chế kháng sinh 19 1.6.2.Những hợp chất dễ bay hơi và enzim 21 1.6.3.Sự cạnh tranh 22 1.6.4.Sự kí sinh 23 1.6.5.Sự giảm độc tính 23 1.6.6.Kháng hệ thống (Sự kích kháng) 24 1.7.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng trong và ngoài nước 25 1.7.1.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng ở ngoài nước 25 1.7.2.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng ở trong nước 29 CHƢƠNG II.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1.Vật liệu nghiên cứu. 31 2.1.1. Mẫu nghiên cứu 31 2.1.2. Các môi trường phân lập vi khuẩn 31 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu 31 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 33 2.2.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng 33 2.2.2. Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp đục lỗ thạch 34 2.2.3. Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp cấy chấm điểm 35 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng 36 2.2.5. Phân loại vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom 39 6 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.5.1. Phương pháp PCR thông thường (đơn) 39 2.2.5.2. Phương pháp kiểm tra độ sạch và xác định nồng độ 40 2.2.5.3 Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR 41 2.2.5.4 Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 43 a. Phương pháp tách dòng 43 b. Phương pháp giải trình tự gen 46 2.2.5.5 Phương pháp tin sinh học (sử dụng phần mềm NCBI, EBI, Expasy…) 46 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1. Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng 47 3.2. Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn 50 3.3. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng 52 3.4. Một số đặc điểm cơ bản của các chủng vi khuẩn đối kháng 54 3.4.1.Một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đối kháng 54 3.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng đến quá trình nảy của lạc 57 3.4.3. Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do R. solanacearum của các chủng vi khuẩn đối kháng 58 3.4.4. Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng lên quá trình sinh trưởng và phát triển của lạc 61 3.5. Xác định vi trí phân loại các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom 63 CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN 75 CHƢƠNG V. KIẾN NGHỊ 76 CHƢƠNG VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 7 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC BẢNG Trang Bảng 3.1 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn 47 phân lập được Bảng 3.2 Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các chủng vi khuẩn 50 gây bệnh héo xanh R. Solanacearum Bảng 3.3 Một số đặc điểm sinh học của 8 chủng vi khuẩn đối kháng 52 Bảng 3.4 Một số đặc điểm sinh học cơ của các chủng vi khuẩn đối kháng 55 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của 8 chủng vi khuẩn đối kháng lên khả năng nảy mầm 57 của hạt lạc Bảng 3.6 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do R. solanacearum của các 58 chủng vi khuẩn đối kháng trên lạc trong điều kiện nhà kính Bảng 3.7 Các chỉ tiêu sinh trưởng của lạc khi có bổ sung 61 vi khuẩn đối kháng Bảng 3.8 Kết quả so sánh trình tự đoạn 16S ARN riboxom chủng TH24 với 71 các chủng vi khuẩn trong ngân hàng gen quốc tế Bảng 3.9 Kết quả so sánh trình tự đoạn 16S ARN riboxom chủng NA10 với 72 các chủng vi khuẩn trong ngân hàng gen quốc tế Bảng 3.10 Một số đặc điểm sinh học cơ của các chủng vi khuẩn đối kháng 73 8 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC HÌNH Trang Hình 3.1 Hoạt tính đối kháng của một số chủng vi khuẩn đối kháng với 51 R. solanacearum BHT gây bệnh héo xanh lạc Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc điển hình của một số chủng 53 vi khuẩn đối kháng đại diện Hình 3.3 Hình thái tế bào chủng vi khuẩn TH24 chụp dưới kính hiển vi 54 điện tử với độ phóng đại 20.000 lần Hình 3.4 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn của các chủng 60 vi khuẩn đối kháng trên Lạc Hình 3.5 Điện di đồ ADN tổng số của hai chủng vi khuẩn nghiên cứu 64 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 65 Hình 3.7 Tuyển chọn các khuẩn lạc mang gen mã hóa đoạn 16S ARN riboxom 66 của các chủng vi khuẩn NA10 và TH24 bằng phương pháp colony PCR Hình 3.8 Tách và kiểm tra plasmid mang đoạn gen mã hóa phần tử 16S 67 riboxom của các chủng vi khuẩn đối kháng Hình 3.9 Kết quả tinh sạch vectơ tái tổ hợp bằng enzim ARNaza 68 Hình 3.10 Trình tự nucleotit gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom của 70 chủng TH24 Hình 3.11 Trình tự nucleotit gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom của 70 chủng vi khuẩn NA10 9 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Bệnh héo xanh cây trồng do khuẩn Ralstonia solanacearum là một bệnh phổ biến và nghiêm trọng ở nhiều loại cây trồng như cà chua, khoai tây, lạc, ớt, gừng (1, 2, 54,58,57). Đây là bệnh chủ yếu làm giảm năng suất và mất mùa lạc ở nhiều nước như Trung Quốc, Thái Lan, Việt nam, Indonesia Hàng năm dịch bệnh có thể gây thiệt hại từ 50-80% năng suất cây trồng. Tình hình gây hại là như vậy nhưng cho tới nay những nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc và vừng chủ yếu chỉ giới hạn trong phạm vi xác định mức độ thiệt hại, sự phân bố của bệnh và bước đầu xác định nguồn gen kháng trong tập đoàn các giống hiện có. Kiểm soát dịch bệnh bằng phương pháp sinh học (kiểm soát sinh học) đang dần trở thành xu hướng phổ biến và được áp dụng rộng rãi trong nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới. Bằng việc áp dụng các biện pháp sinh học người ta có thể thay thế các loại thuốc trừ sâu hóa học có hại đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái. Trong đó biện pháp sử dụng vi sinh vật như một tác nhân kiểm soát và phòng ngừa bệnh hại đang dần trở lên phổ biến (5, 7) vì hiệu quả rõ rệt mà nó mang lại, các chủng vi sinh vật lựa chọn phải có hoạt tính đối kháng cao, ổn định trong thời gian dài và không gây hại cho động, thực vật. Với mục đích này tôi được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài “Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc”. 10 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình trồng lạc trên thế giới và Việt nam 1.1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới Trong các loại cây trồng làm thực phẩm cho con người, lạc có vị trí quan trọng. Mặc dù có nguồn gốc từ lâu đời nhưng tầm quan trọng kinh tế của cây lạc 36 được xác định cách đây khoảng trên 100 năm. Khi những xưởng ép dầu ở Macxây (Pháp) bắt đầu nhập cảng lạc từ Tây Phi, mở đầu cho thời kỳ dùng lạc ép dầu trên qui mô lớn. Công nghiệp ép dầu đã hình thành và phát triển nhanh chóng ở các nước Châu Âu và lan ra trên toàn thế giới. Phần lớn diện tích trồng lạc trên thế giới còn sản xuất theo lối cổ truyền, kỹ thuật canh tác lạc hậu. Những năm gần đây nhờ ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật mới vào sản xuất năng suất lạc đã được nâng lên. Tuy nhiên các tiến bộ kỹ thuật ở các nước không đồng đều, ở các nước phát triển năng suất lạc tăng nhanh còn ở các nước chậm phát triển thì hàng năm năng suất lạc tăng không đáng kể. Các nước có năng suất lạc tăng nhanh đó là: Mỹ trong vòng từ năm 1961 đến 1975 năng suất bình quân đã tăng từ 1.564kg/ha lên 2.875kg/ha. Ở Trung Quốc chương trình nghiên cứu nâng cao năng suất lạc được tiến hành từ 1979 và đã đạt được kết quả khả quan. Các thành tựu về chọn giống lạc trong những năm 80 đã được ứng dụng vào sản xuất tạo nên các điển hình năng suất cao như giống Nonghua 22 đạt năng suất trung bình 4.219kg/ha ở miền trung và miền nam Trung Quốc. Ngoài ra nhiều giống lạc mới có năng suất cao đã và đang được đưa ra sản xuất và mở rộng (5, 14). Cây lạc được trồng ở tất cả các châu lục với trên 100 nước trên thế giới, diện tích trồng lạc khoảng 20-21 triệu ha, năng suất biến động từ 11-12tạ/ha và [...]... nghiên cứu bệnh gây héo trên lạc Song so với tài liệu nước ngoài thì thành phần bệnh vẫn nghèo Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 24 nàn Một số bệnh chết héo đã được phát hiện ở Miền Bắc Vi t Nam Bệnh gây chết héo lạc chủ yếu do nấm gây nên, chỉ có một bệnh do vi khuẩn (bệnh héo xanh) Hiện nay bệnh héo xanh (R .solanacearum) là bệnh phổ biến trên cây lạc Bệnh thường... một loại đất, ẩm độ có ý nghĩa đối với bệnh héo xanh vi khuẩn lạc Ẩm độ càng cao bệnh héo xanh vi khuẩn càng nặng (57) Nhiệt độ đất cao ngay đầu vụ lạc thích hợp cho bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại ở giai đoạn cây con Nhiệt độ đất khoảng 25 0C tại độ sâu 5 cm cùng với độ ẩm đất cao thích hợp cho sự phát triển của bệnh (75) Nghiên cứu biện pháp phòng trừ, kết quả ở nhiều nước cho thấy luân canh lạc với. .. Quốc (44, 57, 75) và một phần của Uganda (70) Có nhiều nước bệnh héo xanh do vi khuẩn R .solanacearum là chưa quan trọng hoặc tình trạng của bệnh là không chắc chắn Nghiên cứu các dòng vi khuẩn R .solanacearum trên lạc cho thấy có 3 trong số 5 “biovar” của R solanacearum là được đánh giá đối với vi khuẩn gây héo lạc, dựa trên cơ sở khác nhau của vi c sử dụng và oxy hoá hoàn toàn vòng rượu và đường đa (43)... và hạt lạc ở nhiều diện tích lạc, đặc biệt ở vùng đất cát ven sông Lam tỉ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn lên tới 40-50% Cây bị bệnh gây hiện tượng héo đột ngột của thân và lá Cây lạc chết nhưng bộ lá vẫn giữ xanh song về sau bộ lá chuyển sang màu vàng Những cành riêng rẽ có thể héo và chết hoặc toàn bộ cây chết Trong thời gian gần đây đã có phân hữu cơ vi sinh đa chức năng có khả năng hạn chế bệnh héo xanh. .. hình bệnh hại lạc trên thế giới và Vi t Nam 1.2.1 Tình hình bệnh hại lạc trên thế giới Thực tế trồng lạc ở các nước trên Thế giới nói chung và ở Vi t Nam nói riêng gặp rất nhiều khó khăn, do xuất hiện nhiều loại sâu bệnh gây hại chủ yếu như 1/ Bệnh chết héo cây Bệnh chết héo có nhiều nguyên nhân Bệnh chết héo lạc: Phát sinh ở hầu hết các vùng trồng lạc của thế giới và cũng như ở Vi t Nam và bao gồm nhiều... điều kiện ấm và ẩm Vi khuẩn tồn tại trong đất và tiếp tục lây bệnh cho vụ sau và trên cây có cùng ký chủ và cả những cây cỏ dại khác Vì vậy, luân canh lạc với các cây cùng ký chủ như thuốc lá có thể làm tăng mức độ bệnh (56) Nghiên cứu về sự phân bố địa lý và tầm quan trong kinh tế của bệnh, các tác giả cho thấy rằng bệnh héo xanh vi khuẩn đã gây nên thiệt hại quan trọng về năng suất lạc ở Indonexia... vật đối kháng là không được dài như của thuốc trừ sâu hóa học; Bởi vậy, không thể bảo quản được một số lượng lớn các sinh vật đối kháng trước khi sử dụng 1.6 Cơ chế đối kháng Những sinh vật đối kháng được sử dụng để kiểm soát sinh học bệnh thực vật bao gồm vi khuẩn, nấm, giun tròn, động vật đơn bào và virút Với một số ngoại lệ, các sinh vật đối kháng thường không tác động lên một bệnh cụ thể, thay vào... chế kháng sinh, sự ký sinh, sự cạnh tranh Những cơ chế này không loại trừ lẫn nhau Một sinh vật đối kháng có thể sử dụng nhiều cơ chế khác nhau để tác động bất lợi tới một tác nhân gây bệnh thực vật hoặc có thể sử dụng một cơ chế để chống lại một kiểu tác nhân gây bệnh và một cơ chế khác chống lại một tác nhân gây bệnh khác Vi dụ, sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để kiểm soát Botrytis gây bệnh trên cây. .. vi khuẩn để chống lại bệnh thối của bắp cải, gây nên bởi vi khuẩn không hình thành bào tử Pseudomonas campestris khi những thể đối kháng được đưa vào đất thì cây vẫn phát triển bình thường - Năm 1955, Kuzina sử dụng vi khuẩn đối kháng bệnh héo của bông gây nên bởi Verticillum Tác giả đã xử lý hạt bông với vi khuẩn trước khi gieo Kết quả tỉ lệ cây chết ở phần đối chứng là 54%, sau khi được xử lý với vi. .. phát triển của một vài loại nấm gây bệnh và mốc xám ở cây hoa anh thảo gây nên bởi Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum f.spp cyclaminis S marcescens B2 có tạo ra enzym phân giải như chitinaza - Nhiều tác giả đã đưa ra cơ chế siderophores và kháng sinh như là những nhân tố đối kháng nấm và vi khuẩn rất hiệu quả (20, 21, 23, 26, 31, 38) - B.F Hu đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas . Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 60 42 40 Học vi n:. Hoạt tính đối kháng của một số chủng vi khuẩn đối kháng với 51 R. solanacearum BHT gây bệnh héo xanh lạc Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc điển hình của một số chủng 53 vi khuẩn đối kháng đại. giao nhiệm vụ thực hiện đề tài Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc . 10 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại