BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN VIẾT THẠCH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY TỪ PHÔI NON CÁC GIỐNG LÚA INDICA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN VIẾT THẠCH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY TỪ PHÔI NON CÁC GIỐNG LÚA INDICA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN TS. MAI ðỨC CHUNG HÀ NỘI – 2013 Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là chính xác và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam ñoan tất cả mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn Viết Thạch Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn, giúp ñỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị, các em và các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin ñược bày tỏ lới cảm ơn chân thành tới: Ban giám hiệu, Phòng ñào tạo sau ñại học, Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Phó giáo sư - Tiến sĩ Phan Hữu Tôn, người thầy kính mến ñã hết lòng giúp ñỡ, dạy bảo, ñộng viên và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tiến sĩ Mai ðức Chung - phòng Thí nghiệm trọng ñiểm – Viện Di truyền Nông nghiệp- một người ñáng kính trong công việc cũng như trong cuộc sống. Anh ñã ñộng viện giúp ñỡ và chỉ bảo cho tôi rất nhiều ñể tôi có thể hoàn thành ñược luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Viện Di truyền Nông nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên trong quá trình nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian thực hiện ñề tài Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội ñồng chấm luận văn ñã cho tôi những ñóng góp quý báu ñể hoàn chỉnh luận văn này. Xin chân thành cảm ơn bố mẹ, vợ và anh chị em ñã luôn ở bên cạnh ñộng viên và giúp ñỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành luận văn. Từ trái tim mình, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới tất cả mọi người! Hà Nội, ngày 26 tháng 10 năm 2013 Nguyễn Viết Thạch Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Chương I MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích và yêu cầu 2 1.2.1 Mục ñích 2 1.2.2 Yêu cầu 2 1.3 Ý nghĩa khoa học 2 Chương II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Tình hình nghiên cứu mô tế bào thực vật 3 2.1.1 Lịch sử phát triển 3 2.2 Nguồn gốc và phân loại cây lúa 5 2.3 Tình hình nuôi cấy mô lúa và tái sinh cây 7 2.3.1 Trên thế giới 7 2.3.2 Ở Việt Nam 8 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy phôi non và tái sinh cây lúa 10 2.4.1 Tuổi phôi 10 2.4.2 Kiểu gen của cây 11 2.4.3 Thành phần môi trường 11 Chương III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 19 Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp iv 3.2 Nội dung nghiên cứu 19 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu và chuẩn bị mẫu 20 3.3.2 Phương pháp xác ñịnh hình thái và kích thước phôi non. 20 3.3.3 Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh cây in vitro. 21 3.3.4 Môi trường nuôi cấy 21 3.4 Bố trí thí nghiệm: 21 3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác ñịnh ảnh hưởng của tuổi phôi ñến sự hình thành mô sẹo và tái sinh cây của giống lúa Indica: IR64. 21 3.4.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS và môi trường N6 ñến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của giống lúa Indica: IR64. 22 3.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất 2,4 D ; hàm lượng kinetin ñến khả năng tạo mô sẹo của mẫu cấy 23 3.4.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA, BAP ñến khả năng tái sinh cây giống lúa Indica: IR64 23 3.4.5 Thí nghiệm 5: ðánh giá ñược khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của các giống lúa Indica trên môi trường và ñiều kiện nuôi cấy tối ưu cho phôi non giống lúa IR64 24 3.5 Các chỉ tiêu theo dõi 24 3.6 Phương pháp phân tích số liệu: 25 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 4.1 Xác ñịnh các pha phát triển của phôi lúa non và tuổi phôi non thích hợp nhất cho nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh cây giống IR64 26 4.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến tạo mô sẹo và tái sinh cây 28 4.2.1 Ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng ñến tạo mô sẹo phôi hóa giống IR64 30 4.2.2 Ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng ñến tái sinh cây giống IR64 31 Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp v 4.3 ðánh giá khả năng tạo mô sẹo phôi hóa và tái sinh cây hoàn chỉnh của các giống lúa Indica trên môi trường nuôi cấy tối ưu cho giống lúa IR64 33 4.4 Xây dựng quy trình tái sinh cây lúa từ phôi hạt non phục vụ chuyển gen 38 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 ðề nghị 40 PHỤ LỤC 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid BAP: Benzylaminopurine CS: Cộng sự DNA: Deoxyribonucleic acid MS Môi trường Murashige - Skoog (1962) N6 Môi trường Chu et al (1975) SE Sai số chuẩn TB Trung bình α-NAA 1-Naphthaleneacetic Acid Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Phân biệt hình thái lúa loài phụ indica và loài phụ japonica 6 4.1 Kích thước phôi non của giống lúa IR64 ở các giai ñoạn tuổi khác nhau (mm) 27 4.2 Ảnh hưởng của tuổi phôi ñến khả năng tạo mô sẹo và mô sẹo phôi hóa của giống IR64 27 4.3 Ảnh hưởng của tuổi phôi non ñến khả năng tái sinh cây 28 4.4 Ảnh hưởng của môi trường cơ bản ñến tạo mô sẹo và mô sẹo phôi hóa của giống IR64 29 4.5 Ảnh hưởng của môi trường ñến tái sinh cây giống IR64 29 4.6 Ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng ñến tạo mô sẹo phôi hóa từ phôi non của giống IR64 30 4.7 Ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng ñến khả năng tái sinh cây giống lúa IR64 32 4.8 ðánh giá khả năng tạo mô sẹo và mô sẹo phôi hóa của các giống lúa Indica 34 4.9 ðánh giá khả năng tái sinh cây các giống Indica 35 Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1 Ảnh phôi non lúa ở các giai ñoạn 8, 12, 16, 20 ngày tuổi (từ trái qua phải) dưới kính hiển vi của giống lúa indica: IR64 26 4.2 Một số hình ảnh về tạo mô sẹo và tái sinh cây IR64 33 4.3 Hình ảnh mô tả các bước tái sinh cây từ phôi non lúa 8 ngày tuổi của 5 giống lúa: IR64, VS1, CR 203, C70, phiêu hương 1. 37 4.4 Quy trình tái sinh mô sẹo từ mô phôi non các giống lúa indica 39 [...]... p gen nư c ta nghiên c u v tái sinh mô s o t phôi non lúa và bi n n p gen vào phôi non lúa còn r t ít ñư c quan tâm Xu t phát t t m quan tr ng c a quy trình tái sinh cây in vitro t phôi non ñ ñ t ñư c hi u qu cao trong bi n n p gen lúa, chúng tôi ti n hành ñ tài: Nghiên c u xây d ng quy trình tái sinh cây t phôi non các gi ng lúa Indica ph c v chuy n gen 1.2 M c ñích và yêu c u 1.2.1 M c ñích Xây. .. cho mô phôi non gi ng lúa IR64 - Xây d ng ñư c quy trình tái sinh cây t phôi h t non các gi ng lúa thu c loài ph Indica ph c v chuy n gen 1.3 Ý nghĩa khoa h c ð tài làm cơ s khoa h c ñ xây d ng quy trình tái sinh cây t phôi h t non các gi ng lúa thu c loài ph Indica ph c v chuy n gen 1.4 Ý nghĩa th c ti n: ð tài nh m xác ñ nh tu i phôi và môi trư ng thích h p ñ t o mô s o và tái sinh cây t phôi non gi... s o và tái sinh cây Trong s các v t li u ñư c s d ng ñ t o mô s o và tái sinh cây, mô phôi non c a h t lúa non có kh năng t o mô s o và tái sinh cây cao Các nghiên c u chuy n gen vào các gi ng lúa Indica g n ñây Trư ng ð i h c nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c Nông nghi p 1 trên th gi i t p trung vào xây d ng h th ng tái sinh cây lúa t mô phôi lúa non và s d ng h th ng tái sinh cây t o... sánh ñư c các ch tiêu c a các gi ng lúa so v i IR64, rút ra k t lu n ñ ng th i xây d ng quy trình tái sinh cây lúa ph c v chuy n gen 3.5 Các ch tiêu theo dõi T l t o mô s o (%) = s phôi non t o mô s o t ng s phôi non nuôi c y x100 s phôi non t o mô s o phôi hóa T l t o mô s o phôi hóa (%) = t ng s phôi non nuôi c y T l tái sinh cây (%) = S cây tái sinh/ mô s o(%) = x100 s mô s o phôi hóa tái sinh t ng... ng ñư c quy trình tái sinh cây t mô phôi non các gi ng lúa Indica ph c v chuy n gen 1.2.2 Yêu c u - Xác ñ nh ñư c tu i phôi và môi trư ng thích h p ñ t o mô s o và tái sinh cây t phôi non gi ng lúa IR64 - ðánh giá ñư c kh năng t o mô s o và tái sinh cây c a phôi non gi ng lúa IR64 trên môi trư ng và ñi u ki n nuôi c y t i ưu - ðánh giá ñư c kh năng t o mô s o và tái sinh cây c a các gi ng lúa Indica. .. chuy n gen lúa 2.4.2 Ki u gen c a cây Ki u gen c a cây nh hư ng r t l n ñ n k t qu nuôi c y phôi non lúa Các ki u gen khác nhau có ph n ng r t khác nhau v i ñi u ki n nuôi c y in vitro Theo Raina và Zapata các gi ng lúa thu c loài ph Japonica d nuôi c y hơn các gi ng lúa thu c loài ph Indica Các gi ng lúa Japonica có hi u qu tái sinh cao hơn các gi ng lúa Indica do ñó hi u qu bi n n p gen gi ng lúa Indica. .. công th p các gi ng lúa indica (so v i các gi ng lúa japonica) có th do hi u qu tái sinh c a các gi ng lúa indica th p hơn H ñã tìm ra ñư c 2 môi trư ng m i ñ c y chuy n, phân hóa mô s o và s d ng quy trình tái sinh cây ñ bi n n p cho các gi ng lúa indica (Lin, 2005) Hiei và cs (2006) ñã t i ưu hóa quy trình bi n n p cho các gi ng lúa indica b ng Agrobacterium tumefaciens s d ng phôi non c a h t non sau... α-NAA, BAP ñ n kh năng tái sinh cây gi ng lúa Indica: IR64 e ðánh giá ñư c kh năng t o mô s o và tái sinh cây c a các gi ng lúa Indica trên môi trư ng và ñi u ki n nuôi c y t i ưu cho gi ng phôi non gi ng lúa IR64 T ñó rút ra k t lu n và xây d ng ñư c quy trình tái sinh mô s o phôi hoá t phôi h t non các gi ng lúa thu c loài ph Indica ph c v chuy n gen 3.3 Phương pháp nghiên c u 3.3.1 Phương pháp l... phát tri n c a phôi lúa non và tu i phôi non thích h p nh t cho nuôi c y t o mô s o và tái sinh cây gi ng IR64 Hình thái phôi non lúa các pha sinh trư ng khác nhau: Hình thái phôi non lúa các pha sinh trư ng khác nhau c a gi ng lúa IR64 ñã ñư c quan sát và ch p nh dư i kính hi n vi huỳnh quang soi n i (Hình 4.1) Phôi non có hình thái khác nhau: elip, b u d c, tr ng, v.v Nhìn chung, phôi non giai ño n... i b HgCl2 Phôi h t non ñư c tách kh i h t lúa b ng dao và panh c y vô trùng trong b c c y laminar Phôi non này ñư c s d ng cho các thí nghi m nuôi c y t o mô s o, tái sinh cây và bi n n p gen 3.3.2 Phương pháp xác ñ nh hình thái và kích thư c phôi non H t lúa non các pha sinh trư ng 8, 12, 16, 20 ngày ñư c tách v Phôi non lúa ñư c tách b ng panh, dao Hình thái và kích thư c c a phôi non các Trư ng . Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh cây từ phôi non các giống lúa Indica phục vụ chuyển gen . 1.2. Mục ñích và yêu cầu 1.2.1. Mục ñích Xây dựng ñược quy trình tái sinh cây từ mô phôi. thích hợp ñể tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non giống lúa IR64 và xây dựng quy trình tái sinh cây từ phôi hạt non ở các giống lúa thuộc loài phụ Indica phục vụ chuyển gen. Trường ðại học nông. thống tái sinh cây lúa từ mô phôi lúa non và sử dụng hệ thống tái sinh cây tạo ra ñể phục vụ công tác biến nạp gen. Ở nước ta nghiên cứu về tái sinh mô sẹo từ phôi non lúa và biến nạp gen vào phôi