Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM VŨ THỊ HƢỜNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN DREB5 PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐỊA PHƢƠNG XUÂN LẠNG SƠN VÀ LƠ BẮC GIANG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên, 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Di truyền học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên, tôi đã nhận đƣợc sự ủng hộ, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Sinh- KTNN và khoa Sau đại học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 4 năm 2012 Tác giả Vũ Thị Hƣờng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 3 3. Nội dung nghiên cứu 3 Chƣơng 1 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1.CÂY ĐẬU TƢƠNG 4 1.1.1.Đặc điểm sinh học cây đậu tƣơng 4 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tƣơng 6 1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam 7 1.2. GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 11 1.2.1. Nhóm gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng 12 1.2.2. Nhóm gen điều khiển quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn 15 1.3. NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB5 VÀ GEN DREB5 20 1.3.1. Nhân tố phiên mã DREB5 20 1.3.2. Gen DREB5 21 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 27 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 27 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 28 2.2.1. Hóa chất 28 2.2.2 Thiết bị 28 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.3.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử 30 2.3.2. Phƣơng pháp phân tích trình tự gen 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1. KẾT QUẢ NHÂN BẢN GEN DREB5 TỪ HỆ GEN CỦA HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG XLS VÀ LBG 37 3.1.1. Tách chiết DNA từ lá non hạt đậu tƣơng 37 3.1.2. Kết quả nhân bản gen GmDREB5 bằng phản ứng PCR 38 3.2. TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB5 40 3.3. SO SÁNH TRÌNH GEN GmDREB5 PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG XLS VÀ LBG VỚI CÁC TRÌNH TỰ ĐÃ CÔNG BỐ 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4 D 2,4- Diclorophenoxyacetic acid ABA Abscisis acid bp Cặp base BAP 6- Bezyl amino purin đtg Cộng sự DNA Deoxiribonucleic acid DREB Dehydration- Responsive Element Binding EDTA Ethyen Diamin Tetraacetic Acid HSP Heat shock protein kb Kilo base LEA Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tích luỹ với số lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi) LTP Lipid Tranfer protein (Protein vận chuyển lipid) LBG Lơ Bắc Giang MGPT Môi giới phân tử MS Murashige- Skoog NAA Naphtyacetic acid PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) P5CS Pyrroline- 5- Carboxylate Synthetase TAE Tris acetat EDTA TBE Tris borat EDTA XLS Xuân Lạng Sơn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2005- 2011 9 Bảng 2.1 Nguồn gốc của các giống đậu tƣơng nghiên cứu. 27 Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị đã sử dụng 29 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi nhân gen DREB5 31 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 32 Bảng 2.5 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 32 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT 34 Bảng 3.1 Giá trị mật độ quang của phổ hấp thụ DNA ở bƣớc sóng 260nm và 280nm của giống đậu tƣơng XLS và LBG 38 Bảng 3.2 Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác của trình tự gen GmDREB5 của 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS với trình tự gen GmDREB5 của 6 giống đậu tƣơng công bố trên ngân hàng gen quốc tế 46 Bảng 3.3 Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác của trình tự amino acid của Protein DREB5 của 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS với trình tự amino acid của Protein DREB5 của 6 giống đậu tƣơng công bố trên ngân hàng gen quốc tế 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Sản xuất đậu tƣơng của Việt Nam 10 Hình 1.2 Sơ đồ mô tả gen và vùng mã hóa của gen GmDREB5 ở đậu tƣơng 22 Hình 1.3 Sơ đồ mô tả protein GmDREB5 ở đậu tƣơng 22 Hình 1.4 Trình tự amino acid của vùng AP2 của protein DREB5 ở đậu tƣơng 23 Hình 1.5 Mô hình cấu trúc của miền AP2 của protein DREB5 23 Hình 1.6 Điểm liên kết với DNA của protein DREB5 (DNA binding site) 24 Hình 1.7 Sơ đồ các điểm DNA- Binding của protein DREB5 ở đậu tƣơng 24 Hình 1.8 Sự đa dạng và mối quan hệ của vùng AP2 của protein DREB5 ở đậu tƣơng 25 Hình 2.1 Hình ảnh các giống đậu tƣơng nghiên cứu 27 Hình 2.2 Sơ đồ vector pBT 34 Hình 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số của 2 giống XLS và LBG 38 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen GmDREB5 39 Hình 3.3 Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chủng DH5 chứa vector tái tổ hợp mang gen GmDREB5 40 Hình 3.4 Plasmid mang gen GmDREB5 41 Hình 3.5 So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn viii Hình 3.6 So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS với sáu trình tự nucleotide của gen GmDREB5 đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế 45 Hình 3.7 Biểu đồ hình cây so sánh mức độ tƣơng đồng gen GmDREB5 của 8 giống đậu tƣơng 47 Hình 3.8 So sánh trình tự amino acid mã hoá bởi gen DREB5 phân lập từ 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS 49 Hình 3.9 So sánh trình tự amino acid mã hoá bởi gen GmDREB5 phân lập từ 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS với trình tự amino acid mã hoá bởi gen GmDREB5 của 6 giống đậu tƣơng đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế 50 Hình 3.10 Biểu đồ hình cây so sánh mức độ tƣơng đồng Protein DREB5 của 8 giống đậu tƣơng 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày có vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp, là loại cây trồng chiến lƣợc của nhiều quốc gia trên thế giới bởi có tác dụng nhiều mặt và có hiệu quả kinh tế cao, có thời gian sinh trƣởng ngắn lại dễ trồng. Sản phẩm từ cây đậu tƣơng đƣợc sử dụng cho ngƣời và gia súc do đáp ứng đƣợc nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hằng ngày của ngƣời cũng nhƣ gia súc [1], [3]. Hạt đậu tƣơng đƣợc dùng làm thực phẩm cho con ngƣời, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là mặt hàng xuất khẩu. Trong hạt đậu tƣơng có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, chứa 35%- 52% protein, 18%- 25% lipit, 20% glucid và nhiều loại axit amin cần thiết nhƣ: leucin, isoleucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, trong hạt đậu tƣơng còn chứa nhiều vitamin (B1, B2, A, D, E, K…) là thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao rất cần thiết cho cơ thể ngƣời và động vật. Đặc biệt, protein của đậu tƣơng đƣợc coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lƣợng đáng kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể, dễ tiêu hoá và không có các thành phần tạo cholesterol. Lipit của đậu tƣơng chứa tỉ lệ lớn các axit béo chƣa no, có hệ số đồng hoá lớn (98%), chỉ số iot cao (120-137). Sử dụng protein và lipit của hạt đậu tƣơng còn có tác dụng chữa một số bệnh nhƣ: đái tháo đƣờng, béo phì, huyết áp cao, chảy máu não… [3]. Ngoài ra, ở rễ cây đậu tƣơng có các nốt sần, đó là kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Vì vậy, đậu tƣơng là loại cây trồng có tác dụng cải tạo đất, làm cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp [...]... phương Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang 2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc sự khác biệt về trình tự gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng địa phƣơng Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang và sự đa dạng về cấu trúc gen DREB5 ở cây đậu tƣơng trên cơ sở phân tích các trình tự đã công bố 3 Nội dung nghiên cứu - Khuếch đại gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang bằng kỹ thuật PCR; - Tách dòng và xác... cung cấp (Bảng 2.1 và Hình 2.1) Bảng 2.1 Nguồn gốc của các giống đậu tƣơng nghiên cứu Nơi cung cấp STT Ký hiệu Tên giống Nguồn gốc 1 LBG Lơ Lạng Giang- Bắc Sở NN và PTNT Lạng Bắc Giang 2 XLS Xuân Lạng Sơn Giang Sơn Văn Quan - Lạng Phòng NN và PTNT Sơn Huyện Lạng GiangBắc Giang Xuân Lạng Sơn Lơ Bắc Giang Hình 2.1 Hình ảnh các giống đậu tƣơng nghiên cứu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên... bằng kỹ thuật PCR; - Tách dòng và xác định trình tự gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang; - So sánh trình tự gen DREB5 của hai giống giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang; - So sánh trình tự gen DREB5, trình tự amino acid của protein DREB5 của các giống đậu tƣơng nghiên cứu với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học... gia vào quá trình kháng hạn nhƣng nó giữ vai trò là nhân tố kích hoạt đồng thời sự biểu hiện của các gen liên quan đến khả năng chịu hạn Do vậy, việc nghiên cứu gen DREB là cơ sở để cải thiện đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng thông qua kỹ thuật chuyển gen là cần thiết Xuất phát từ lý do trên tôi đã lựa chọn đề tài: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen DREB5 phân lập từ hai giống đậu tương địa phương Xuân. .. hạn của giống cây này bằng công nghệ gen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 26 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Hai giống đậu tƣơng địa phƣơng đƣợc sử dụng làm vật liệu nghiên cứu, bao gồm: Đậu tƣơng Lơ (Lạng Giang- Bắc Giang) và Đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn có nguồn gốc địa phƣơng do các cơ quan giống cây trồng cung cấp (Bảng 2.1 và Hình... (Chaperonin), HSP 90, HSP 100 và sHSP (small HSP) trong đó có hai họ môi giới phân tử đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là chaperonin và HSP70 HSP70 đã đƣợc phân lập ở đậu xanh Yang và đtg (2008) đã phân lập gen HSP 60 ở đậu tƣơng và đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số EU036414, kích thƣớc là 498 bp [36] Wang và đtg (2010) đã nghiên cứu phân lập gen HSP 90 và đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số FJ969431,... (GMER-EBP1) đã đƣợc phân lập từ cây đậu tƣơng và đặc điểm biểu hiện của chúng cũng đã đƣợc kiểm tra bằng thực nghiệm 1.3.2 Gen DREB5 Trong Ngân hàng gen quốc tế (Genbank) có hai loại trình tự gen GmDREB 5 đƣợc công bố, đó là trình tự gen GmDREB5 của Chen và đtg công bố năm 2007 có kích thƣớc 927 bp, mã hóa 308 amino acid và một số trình tự gen GmDREB5 của nhóm nghiên cứu Nguyen và Chu (năm 2011) có... Shahrokhabadi và đtg (2008) đã xác định các gen trong họ DREB ở đậu tƣơng Ở Việt Nam, gen DREB5 đã đƣợc Chu Hoàng Mậu và đtg phân lập trên giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài với kích thƣớc 924 bp, trong đó có 207 T, 268 A, 190 G và 259 C, mã số trên NCBI là FR822737.1 Nguyễn Thùy Giang và đtg (2011) đã khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen DREB5 từ mRNA của hai giống đậu tƣơng Cúc lông Phú Bình và Vàng... lƣợng đậu tƣơng đứng đầu là: Mỹ, Brazil, Argentina và Trung Quốc Đậu tƣơng là nguồn cung cấp dầu và protein quan trọng Ở Việt Nam, đậu tƣơng đƣợc trồng từ rất lâu, trƣớc cây đậu xanh và các cây họ đậu khác Các giống đậu tƣơng ở nƣớc ta bao gồm các giống đậu tƣơng nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tƣơng đột biến và các giống đậu tƣơng địa phƣơng Trƣớc cách mạng tháng 8 năm 1945, diện tích gieo trồng đậu. .. phân lập đƣợc phân họ DREB trên đối tƣợng Hoa Cúc, theo đó phân họ gồm DmDREBa và DmDREBb, những gen này mã hoá cho hai protein có 191 amino acid và 185 amino acid với trọng lƣợng phân tử 21,66 và 20,99 kDa, các protein của hai gen này đƣợc biểu hiện khi cây hoa cúc bị stress hạn lạnh Chen và đtg (2007) đã phân lập gen GmDREB2 ở đậu tƣơng và dựa trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp vào phân . giống đậu tương địa phương Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang . 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc sự khác biệt về trình tự gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng địa phƣơng Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang. VŨ THỊ HƢỜNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN DREB5 PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐỊA PHƢƠNG XUÂN LẠNG SƠN VÀ LƠ BẮC GIANG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số:. Bắc Giang bằng kỹ thuật PCR; - Tách dòng và xác định trình tự gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang; - So sánh trình tự gen DREB5 của hai giống giống đậu tƣơng Xuân