Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN MINH ĐỨC TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN P24 CỦA VIRUS HIV – 1 CRFO1_AE LƯU HÀNH TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN MINH ĐỨC TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN P24 CỦA VIRUS HIV – 1 CRFO1_AE LƯU HÀNH TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Luận văn thạc Sỹ - 1 - Trần Minh Đức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đại dịch HIV/AIDS đang là một vấn đề nan giải và là mối hiểm họa đối với nhân loại. Kể từ khi ca nhiễm bệnh đầu tiên được phát hiện vào năm 1981 cho đến nay đại dịch HIV/AIDS đã gây ra cái chết cho hàng triệu người mỗi năm. Theo báo cáo của tổ chức phòng chống AIDS toàn cầu (UNAIDS) thì tính đến hết năm 2009 trên thế giới có khoảng 33,3 triệu người vẫn đang sống chung với HIV, và riêng trong năm 2009 có khoảng 1,8 triệu người tử vong do các bệnh liên quan đến HIV/AIDS [36]. HIV/AIDS không những là nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong cao ở người mà còn tác động tiêu cực tới sự phát triển kinh tế xã hội mỗi quốc gia, nhất là các nước đang phát triển. Với cơ sở hạ tầng, trang thiết bị kỹ thuật y tế còn nhiều yếu kém thì việc chăm sóc và điều trị bệnh nhân HIV/AIDS ở các nước này gặp rất nhiều khó khăn. Vì vậy, công tác phát hiện và kiểm soát sự lây lan của dịch bệnh được coi là giải pháp phù hợp với điều kiện các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Việt Nam là một trong những nước có tỉ lệ nhiễm HIV cao trên thế giới. Theo báo cáo của Bộ Y tế thì tính đến ngày 30/9/2010, cả nước có 180.312 người đang sống chung với virus chết người này, trong đó có 42.339 bệnh nhân AIDS và tổng số người chết do AIDS đã được báo cáo là 48.368 người. Số lượng người nhiễm HIV cao sẽ là gánh nặng với xã hội và nền kinh tế [10]. Hiện nay, vấn đề sản xuất thuốc điều trị và vaccine phòng ngừa HIV/AIDS vẫn là một bài toán hóc búa đối với nền y học thế giới. Mặc dù các nghiên cứu trong những năm gần đây đã mang lại nhiều kết quả tích cực xong vẫn chưa có vaccine phòng chống HIV. Trong bối cảnh diễn biến tình hình dịch bệnh ở nước ta hiện nay ngày càng phức tạp, việc chẩn đoán sớm để có các biện pháp phòng ngừa hữu hiệu là rất cần thiết. Trên thị trường Việt Nam đã xuất hiện rất nhiều loại Kit chẩn đoán HIV nhưng đa phần là nhập ngoại, các loại Kit này thường có giá thành cao và có thể không phù hợp với các phân type HIV đang lưu hành tại Việt Nam. Do đó, việc Luận văn thạc Sỹ - 2 - Trần Minh Đức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nghiên cứu phát triến các bộ Kit chẩn đoán HIV có độ nhạy, độ đặc hiệu cao trên cơ sở các kháng nguyên có nguồn gốc từ các chủng virus đang lưu hành trong nước có ý nghĩa rất lớn cả về mặt khoa học cũng như thực tiễn. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Tách dòng, biểu hiện gen mã hóa protein P24 của virus HIV-1 phân type CRF01_AE lưu hành tại Việt nam và ứng dụng protein tái tổ hợp trong chẩn đoán”. Nghiên cứu này được thực hiện tại phòng Vi sinh Vật học Phân tử – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Luận văn thạc Sỹ - 3 - Trần Minh Đức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human immunodeficiency virus – HIV) 1.1.1. HIV là gì? HIV (Human Immunodeficiency Virus) - virus gây suy giảm miễn dịch ở người, là loại virus khi xâm nhập vào cơ thể gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS), dẫn đến nguy cơ nhiễm các bệnh cơ hội và làm cho bệnh nhân dễ mắc phải ưng thư và những tác động do chính HIV gây ra [1]. HIV chủ yếu lây nhiễm các tế bào quan trọng trong hệ thống miễn dịch của người như là tế bào T trợ giúp (đặc biệt là T CD4+), các đại thực bào và các tế bào đuôi gai. Lây nhiễm HIV dẫn đến sự giảm số lượng tế bào T CD4+ theo 3 cơ chế chính sau: Một là, các tế bào nhiễm bị giết chết trực tiếp bởi virut; hai là, tăng tỉ lệ tế bào chết theo chương trình; ba là, sự giết chết tế bào T CD4+ bị nhiễm bởi tế bào lympho gây độc CD8. Khi số lượng tế bào T CD4+ suy giảm xuống dưới một mức nhất định thì quá trình miễn dịch qua trung gian tế bào bị mất, cơ thể dễ mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội [54]. 1.1.2. Đặc điểm của virus HIV 1.1.2.1. Giới thiệu chung Về nguồn gốc của virus HIV gây suy giảm miễn dịch ở người thì vẫn là một câu đố đối với các nhà khoa học kể từ khi trường hợp mắc bệnh đầu tiên được phát hiện đầu những năm 80 của thế kỷ trước. Ngày nay thì mọi người đều đồng ý rằng HIV có quan hệ họ hàng với virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ - SIV (simian immunodeficiency virus). Đặc biệt là công bố vào năm 1999 của một số nhà nghiên cứu tại Đại học Alabama, họ nhận thấy rằng HIV-1(một type HIV) rất giống SIV tinh tinh (SIVcpz). Nguồn gốc động Luận văn thạc Sỹ - 4 - Trần Minh Đức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vật, thời gian và địa điểm chính xác của sự lây truyền hiện vẫn chưa rõ và là đề tài cho các cuộc khảo sát và tranh luận [21]. HIV thuộc nhóm Lentivirus và thuộc họ Retroviridae. Lentivirus (lenti có nghĩa là chậm), loài virus đặc trưng bởi thời gian dài ủ bệnh. Lentivirus có thể truyền thông tin di truyền của mình vào DNA tế bào chủ và loài duy nhất trong các Retrovirus có khả năng tái bản mà không thông qua phân chia tế bào [61]. HIV có những đặc trưng của retrovirus: • Là một loại virus RNA, nhưng có một enzyme phiên mã ngược, mà bản chất là DNA polymerase phụ thuộc RNA. Với enzyme phiên mã ngược này cho phép tổng hợp một DNA kép trong tế bào chủ mà retrovirus xâm nhập . • DNA mới được tạo ra đều có những đoạn tự lặp lại, có kích thước khác nhau được gọi là đoạn cuối dài tự lặp lại, nhờ vậy mà gắn được một cách ổn định trong nhiễm sắc thể của tế bào chủ và trở thành một tiền virus (provirus). Tiền virus này sẽ như một gen của tế bào và truyền sang cho thế hệ khác khi có sự phân bào, hoặc được phiên mã thành RNA thông tin, tổng hợp protein của virus để hình thành một virus hoàn chỉnh. HIV có các đặc trưng của một Lentivirus :  Phát triển chậm.  Không biến đổi tế bào nhưng lại làm tiêu huỷ tế bào.  Cấu trúc kháng nguyên dễ biến đổi [1], [6]. 1.1.2.2. Phân loại HIV HIV là loại virus có tính biến đổi cao và dễ xảy ra đột biến. Điều này có nghĩa là sẽ có nhiều chủng HIV khác nhau, thậm chí chúng có thể cùng lây nhiễm vào một cá thể [39]. Dựa vào sự tương đồng về mặt di truyền người ta có thể phân loại các chủng virus HIV thành các type, các nhóm và phân type. Có 2 type HIV: HIV-1 và HIV-2. Cả 2 type này đều lây truyền qua đường tình dục, qua máu, từ mẹ sang con và Luận văn thạc Sỹ - 5 - Trần Minh Đức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn chúng đều là nguyên nhân dẫn đến triệu chứng lâm sàng bệnh AIDS nhưng khó phân biệt được là do type nào gây ra. HIV-1 thì có mức độ lây lan rộng, còn HIV-2 khó lây nhiễm hơn, thời kì ủ bệnh cũng dài hơn [40]. HIV-1 đã được Luc Montagnier và các cộng sự ở viện Pasteur Paris phát hiện vào năm 1983 [48]. HIV-1 được chia ra làm 4 nhóm: Nhóm M (major), nhóm O (outlier), 2 nhóm mới N và P (hình 1.1) [40]. Hình 1.1: Sơ đồ các phân type HIV-1 và HIV-2[40]  Nhóm O thì chỉ xuất hiện giới hạn ở khu vực Tây-Trung phi.  Nhóm N - một chủng được phát hiện năm 1998 ở Cameroon thì lại rất hiếm xuất hiện.  Nhóm P - một chủng mới, có quan hệ rất gần với virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ được phát hiện ở người phụ nữ Cameroon vào năm 2009 [39].  Nhóm M chiếm hơn 90% HIV-1 gây đại dịch trên toàn thế giới. Trong nhóm M lại chia ra thành các phân type: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J và K. Đôi khi có hiện tượng 2 virus thuộc 2 phân type khác nhau, cùng hiện diện trong tế bào người nhiễm và hòa trộn các chất liệu di truyền để tạo thành 1 virus lai mới. Nhiều virus thuộc chủng mới này có khả năng sống sót không cao, nhưng chủng nào lây nhiễm được sẽ gọi là CRF (Circulating Recombinat Forms). CRF A/E được coi là sự lai tạo giữa phân type A và 1 phân type gốc là E. Tuy nhiên, vì chưa tìm thấy được phân type E ở dạng riêng rẽ nên hầu hết người ta coi CRF A/E là phân type E. (trên thực tế tên gọi đúng hơn là CRF01_AE) [40]. Luận văn thạc Sỹ - 6 - Trần Minh Đức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn HIV-2 được phát hiện ở các bệnh nhân ở Cameroon vào năm 1985 và thường chỉ thấy xuất hiện ở tây phi, rất ít gặp ở nơi nào khác [49]. HIV-2 cũng được chia thành 8 phân type là A, B, C, D, E, F, G, H (hình 1.1) [34,42]. Trong giới hạn của luận văn này, tôi chỉ tìm hiểu loại HIV-1 là loại virus gây ra đại dịch HIV/AIDS trên thế giới. 1.1.2.3. Đặc điểm hình thái và cấu trúc của HIV HIV có dạng hình cầu, kích thước 100 – 120nm. Về cấu tạo thì HIV gồm 3 phần chính là lớp vỏ, lớp protein nền và lõi capsid (hình 1.2) [1].  Lớp vỏ (Envelope): Vỏ ngoài có cấu tạo từ lớp lipid kép với các gai glycoprotein. Mỗi gai có hai tiểu đơn vị glycoprotein có khối lượng 41kDa là gp41 cắm xuyên màng và glycoprotein có khối lượng 120kDa (gp120) gắn với gp41 nhờ cầu nối disulfua tạo thành gp160.  Lớp Protein nền (Matrix protein): Nằm ngay sau lớp vỏ là lớp protein nền có khối lượng phân tử 17kDa (p17).  Lõi capsid: Có dạng hình trụ lệch tâm, được cấu thành bởi các protein có khối lượng 24kDa (p24). Bên trong là hai sợi RNA đơn, protein lõi (p7 và p9) và enzyme phiên mã ngược [1]. Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc của virus HIV[50] Luận văn thạc Sỹ - 7 - Trần Minh Đức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1.2.4. Cấu trúc hệ gen HIV Genome của HIV bao gồm hai chuỗi RNA đơn, giống nhau. Mỗi chuỗi có kích thước khoảng 9200bp, gồm có 9 gen với 2 nhóm chính: nhóm gen cấu trúc (gag, pol, env) và nhóm gen điều hòa (tat, rev, nef, vif, vpr, vpu) (hình 1.3) [50].  Nhóm gen cấu trúc  Gag (group-specific-antigen): mã hoá các kháng nguyên đặc hiệu nhóm bao gồm các gen mã hóa tổng hợp protein nền, lõi capsid và các cấu trúc protein lõi (nuclecapsid protein).  Pol (polymerase): mã hóa tổng hợp protease, enzyme phiên mã ngược và intergrase.  Env (envelope): mã hóa tổng hợp kháng nguyên bề mặt gp160 với hai tiểu phần là gp41 và gp120.  Nhóm gen điều hòa  Tat (Trans Activator of Transcription – yếu tố hoạt hóa phiên mã). Gen tat kích hoạt các gen mã hoá protein cấu trúc, protein điều hòa (kể cả gen tat). Gen tat mã hóa tổng hợp protein Tat, có 102 amino acid, protein này chịu trách nhiệm hoạt hóa phiên mã virus thông qua việc tạo ra vị trí gắn cho RNA pol 2 và các protein khác của tế bào.  Rev (Regulator of Expression of Virion proteins – yếu tố điều hòa sự biểu hiện các protein hạt virus) : Gen rev có chức phận điều chỉnh quá trình nhân lên của virus thông qua gen tat và nef, mã hóa tổng hợp cho protein Rev. Rev bao gồm 117 amino acid, protein này có chức năng chuyển mRNA ra tế bào chất.  nef (Negative Regulator Factor - yếu tố điều hòa âm): mã hóa cho protein Nef, ức chế hoặc tăng cường sự tái bản virus, phụ thuộc vào chủng và loại tế bào. Trong các tế bào nhiễm, Nef sẽ thay đổi con đường vận chuyển endosome, qua đó giảm sự biểu hiện các protein CD4, MHC I và MHC II ở bề mặt tế bào nhiễm. Những thay đổi này có thể bảo vệ các tế bào nhiễm HIV khỏi sự giám sát miễn dịch. Luận văn thạc Sỹ - 8 - Trần Minh Đức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn  Vif (Virion Infectivity Factor - yếu tố lây nhiễm của virus): mã hóa protein Vif, làm tăng tính thâm nhập của virus vào các tế bào chủ tự do và giúp ngăn chặn sự xâm nhập của các enzyme tế bào chủ ngăn cản sự tái bản virus vào các virion mới hình thành.  Vpu (Viral Protein U - protein U của virus): mã hóa protein Vpu, có tác dụng tăng cường sự giải phóng virus khỏi tế bào, làm giảm sự biểu hiện của CD4, MHC I trên bề mặt tế bào.  Vpr (Viral Protein R - protein R của virus): mã hóa protein Vpr, có tác dụng tăng cường sự tái bản virus trong các tế bào ban đầu, là protein liên kết với virion, ngăn cản pha G 2 /M, là tín hiệu định vị nhân [43], [44], [46]. Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc genome HIV[44] 1.1.3. Chu trình virus HIV HIV có khả năng xâm nhập rất nhiều loại tế bào: tế bào lympho T hỗ trợ (T H ) có thụ thể CD4, tế bào đơn nhân, đại thực bào và các tế bào tương tự như: tế bào tua (ở da và niêm mạc (Langerhans), ở hạch lympho), tế bào thần kinh đệm (microglia) của hệ thần kinh trung ương. Nhưng xét về sinh bệnh học, tế bào lympho T có CD4 và hệ thống đại thực bào đơn nhân là tế bào đích chính của HIV. CD4 là protein tiếp nhận, giúp cho HIV gắn với tế bào [1], [17]. Sự xâm nhập và nhân lên của virus HIV có thể chia làm bốn giai đoạn chính: Gắn kết và xâm nhiễm vào tế bào; phiên mã ngược và cài xen; sao chép và dịch mã; lắp ráp và trưởng thành (hình 1.4). [...]... capsid của HIV-1 và hình thành cấu trúc vỏ hình nón đặc trưng (hình 1.5), bao quanh phức hợp RNAnucleoprotein của hạt virus trưởng thành, đồng thời cũng là vị trí mà cycophilin A gắn với nhóm protein Gag và có ý nghĩa quan trọng trong quá trình nhân lên của virus [25] Protein p24 được mã hóa bởi gen Gag của HIV-1, gồm 231 amino acid và có khối lượng phân tử xấp xỉ 24 kDa [23, 27] Gen Gag của HIV-1 mã hóa. .. trúc của CA (1-145) không giống với protein vỏ virus, mà nó gồm có 7 chuỗi xoắn α, 2 chuỗi β kẹp tóc (hairpin) và vị trí tiếp xúc loop (hình 1.9) [29] Hình 1.9: Cấu trúc domain đầu N-terminal của p24[ 29] 1.2.2 P24 và các ứng dụng trong chẩn đoán Kháng nguyên p24 là protein cấu thành của lõi virus, bao bọc các chất liệu di truyền và là một chỉ số phản ánh sự nhân lên của virus Kháng nguyên p24 tồn tại. .. type HIV-1 phổ biến nhất là CRF01_AE chiếm tới 98,3%, 1,4 % thuộc phân type B và 0,3% là chủng tái tổ hợp giữa B và C cũng được phát hiện [45] Một nghiên cứu trước đó của nhóm tác giả ở Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TW về HIV-1 phân type CRF 01_AE trong những người tiêm trích ma túy ở Hà Nội, Việt Nam , đã cho thấy đặc điểm lưu hành của các phân type HIV ở đối tượng tiêm trích ma túy ở Hà Nội Kết quả phân. .. pháp chẩn đoán HIV dựa trên việc phát hiện RNA của virus, phương pháp chẩn đoán HIV dựa trên việc phát hiện kháng nguyên p24 có độ nhậy thấp hơn, và thường không được dùng là phương pháp duy nhất cho chẩn đoán virus HIV [59] Tuy nhiên phương pháp phát hiện p24 đã được gộp vào các phương pháp chẩn đoán HIV thế hệ mới-phương pháp chẩn đoán HIV thế hệ thứ 4, phát hiện đồng thời kháng thể kháng HIV và kháng... Tổng thể tích : 10 µl Hỗn hợp phản ứng được tiến hành (ủ) ở nhiệt độ 14oC qua đêm - Thiết kế vector biểu hiện gen p24: được tiến hành bằng cách gắn đoạn gen mã hóa cho protein p24 (đã được gắn thêm trình tự nhận biết của hai enzyme giới hạn BamH I và Xho I) vào vector biểu hiện pET 32a(+) đã được xử lý bằng enzyme giới hạn trên Thành phần phản ứng:  Nước khử ion vô trùng : 2,5 µl  Dung dịch đệm của. .. hóa tổng hợp cho một khung đọc mở của protein có khối lượng phân tử 55kDa (p55) Protein p55 được cấu thành từ 3 protein thành Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức - 11 - phần, protein nền P17, protein P24 và protein nucleocapsid p15 Các protein thành phần sẽ được giải phóng khi p55 bị thủy phân bởi protease hạt virus [24] Trong virus. .. protease của HIV phân cắt các polyprotein thành các enzyme và protein cấu trúc Các thành phần cấu trúc khác nhau sau đó được lắp ráp thành hạt virus HIV trưởng thành Giai đoạn phân cắt có thể bị ức chế bởi các protease Hạt virus trưởng thành sau đó có thể đi lây nhiễm tế bào khác và bắt đầu một chu trình tương tự [20] 1.2 Protein P24 1.2.1 Cấu trúc và chức năng của P24 Protein p24 là thành phần chủ yếu... glyxerol 100% và ̃ định mức bằng H2O đến 1ml) [60,63] 2.2.4 Phương pháp gắn gen vào vector - Tách dòng đoạn gen mã hoá cho protein p24 của virus HIV được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dòng PCR 2.1 bằng việc sử dụng bộ sinh phẩm tách dòng của hãng Invitrogen Thành phần phản ứng:  Nước khử ion vô trùng : 3 µl  Dung dịch đệm của T4 DNA ligase : 1 µl Số hóa bởi Trung... nguyên xuất hiện sớm (3-6 tuần) ở giai đoạn cửa sổ trong diễn biến quá trình nhiễm HIV/AIDS, p24 đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các bộ Kit chẩn đoán sớm sự lấy nhiễm của virus Trên thế giới hiện có rất nhiều loại Kit chẩn đoán nhanh HIV đang được sử dụng Hầu hết các Kit chẩn đoán HIV bằng kỹ thuật ELISA hay Western blot đều dựa vào việc phát hiện p24 hoặc gp41 hoặc cả p24/ gp41... mũ và đuôi polyA sẽ đóng vai trò làm RNA genome của các virus thế hệ sau [34] Lắp ráp và trƣởng thành Giai đoạn cuối cùng của chu trình tái bản virus, tạo thành các hạt virus HIV hoàn chỉnh được bắt đầu tại màng sinh chất của tế bào chủ Protein Env (gp160) đi qua màng lưới nội chất và được vận chuyển vào phức hệ Golgi, nơi mà chúng sẽ bị enzyme protease phân cắt tạo thành 2 glycoprotein vỏ gp41 và . mã hóa protein P24 của virus HIV-1 phân type CRF01_ AE lưu hành tại Việt nam và ứng dụng protein tái tổ hợp trong chẩn đoán . Nghiên cứu này được thực hiện tại phòng Vi sinh Vật học Phân tử. TRẦN MINH ĐỨC TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN P24 CỦA VIRUS HIV – 1 CRFO1 _AE LƯU HÀNH TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN LUẬN VĂN. TRẦN MINH ĐỨC TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN P24 CỦA VIRUS HIV – 1 CRFO1 _AE LƯU HÀNH TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN LUẬN VĂN